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Artículo de método

Empírico, metagenómica y técnicas computacionales iluminarán los mecanismos por los cuales fungicidas compromiso Pathología Apícola

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DOI:

10.3791/54631

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9 de octubre de 2017

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1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

En este artículo

Resumen

Consorcios microbianos en las colmenas de la abeja bumble enriquecen y conservan el polen para las larvas de abeja. Utilizando la siguiente secuencia de generación, junto con laboratorio y experimentos en el campo, este manuscrito describe protocolos utilizados para probar la hipótesis de que residuos del fungicida alteran el microbioma del polen y datos demográficos de la Colonia, en última instancia conduce a la Colonia pérdida.

Resumen

Los productores a menudo usan aerosoles fungicida durante la floración para proteger los cultivos contra las enfermedades, que expone a las abejas a los residuos de fungicida. Aunque se considera "abeja-safe", hay creciente evidencia que residuos de fungicida en el polen se asocian con disminución de abeja (para especies de miel y bumble bee). Mientras que los mecanismos siguen siendo relativamente desconocidos, los investigadores han especulado que la simbiosis de abeja-microbio participan. Microbios desempeñan un papel fundamental en la preservación y procesamiento del polen, que sirve de nutrición para larvas abejas. Alterando la comunidad microbiana, es probable que los fungicidas interrumpen estos servicios mediada por el microbio y así comprometen la salud de las abejas. Este manuscrito describe los protocolos para investigar los mecanismos indirectos que fungicidas pueden causar disminución de la Colonia. Experimentos de jaula exponiendo las abejas a las flores tratadas con fungicida ya han proporcionado la primera evidencia que fungicidas causan pérdidas de Colonia profunda en un nativo de abejorro (Bombus impatiens). Utilizando dosis relevantes de campo de fungicidas, han desarrollado una serie de experimentos para proporcionar una descripción más fina de la dinámica de la comunidad microbiana de polen expuesto fungicida. Cambios en la composición estructural de ensamblajes micóticas y bacterianas en el microbioma del polen son investigados por secuenciación de próxima generación y análisis de metagenómica. Experimentos desarrollados en el presente documento han sido diseñados para proporcionar una comprensión mecanicista de cómo fungicidas afectan el microbioma de provisiones de polen. En definitiva, estos resultados deben arrojar luz sobre el camino indirecto a través del cual fungicidas pueden causar disminución de la Colonia.

Introducción

Administrado y especies de abejas silvestres están sufriendo descensos generalizados, con importantes consecuencias para ambos sistemas naturales y agrícolas1. A pesar de los esfuerzos para comprender las causas de este problema, los factores que impulsan la disminución de abejas de miel no son todavía bien entendido2,3,4. Para algunas especies de abejas silvestres, nativas, la situación se ha convertido en grave5,6. Si las poblaciones de abejas no se puede sostener cuando intersectan con la agricultura industrial, su población seguirá cayendo y los cultivos que requieren polinizadores (35% de la producción mundial7) perdurará reduce las cosechas.

Mientras que muchos factores como la exposición a los pesticidas, enfermedad y habitat pérdida1,4,8,9,10 han sido implicados en la disminución de la abeja de miel, relativamente poco se sabe sobre el efecto interactivo de estos estresores sobre la salud de las abejas nativas, dentro o cerca de los sistemas agrícolas. Muchos esfuerzos de investigación actuales seguirán centrándose en insecticidas, (p. ej., neonicotinoides11,12), aunque la última investigación indica que fungicidas también pueden desempeñar un papel en la disminución de la abeja por alterar la formación de la memoria, recepción olfativa13, nido de reconocimiento14, actividad enzimática y las funciones metabólicas15,16,17. A nivel mundial, fungicidas siguen ser aplicadas a los cultivos de flores durante la floración. Estudios recientes han documentado que las abejas traen comúnmente residuos de fungicida a la colmena18, de hecho, estudios han demostrado una gran proporción de colmenas probado contiene fungicida residuos19,20. Otro trabajo ha revelado que residuos de fungicida se asocia con altas tasas de los miel abeja mortalidad larvaria21,22,23 y la presencia de "polen entombed" dentro de las colonias, que aunque no tóxicos, carece de actividad microbiana y es nutricionalmente comprometidos24. A pesar del hecho de que fungicidas han sido considerado como "abeja-safe", ahora existe evidencia que la exposición a fungicidas solo puede causar pérdidas severas de la Colonia en una especies de abejorro nativo, Bombus impatiens25.

Para establecer causalidad entre exposición de fungicida y la Colonia mortalidad, el modus operandi de estos productos químicos deben determinarse. Como se evidencia en los suelos26,27de sedimentos y ambientes acuáticos28, dirigiéndose a hongos, fungicidas más probables alteran abundancia hongos y diversidad dentro de las disposiciones polen, invocando así una comunidad importante cambio pueden favorecer fuertemente a las bacterias. Sin hongos competidores o antagonistas, ciertas bacterias patógenas pueden proliferar relativamente sin control, facilitando la descomposición del polen-disposiciones. Más allá de la investigación ha demostrado que microorganismos, especialmente levaduras y hongos filamentosos, sirven como simbiontes nutritivos para las abejas29,30,31, protege contra parásitos y patógenos32 ,33y preservación a largo plazo de los almacenes de polen. Fungicidas, por lo tanto, indirectamente perjudiquen las abejas inmaduras interrumpiendo la comunidad microbiana necesaria para prestar estos servicios o incrementando la susceptibilidad a patógenos y parásitos oportunistas12. Con el aumento de las demandas en producción de alimentos, cultivos en todo el mundo están siendo rociados cada año con fungicidas durante la floración, lo que subraya la necesidad de comprender la magnitud de tales efectos inducidos por el fungicida.

Hasta la fecha, las lagunas de conocimiento primaria relativos a la abeja nativa microbiana ecología puede ser representada por las siguientes preguntas: ¿en qué medida cambia fungicida la comunidad microbiana dentro de polen de abeja-disposiciones? ¿Cuáles son los impactos aguas abajo de consumir polen una comunidad microbiana profundamente alterada? De conformidad con estas preguntas ecológicamente pertinentes, experimentos fueron desarrollados con los objetivos primarios de revelar 1) que residuos de fungicida solo pueden causar disminución severa de la Colonia en una especie de abeja nativa; 2) el grado en que las comunidades microbianas en las provisiones de polen son alteradas por fungicidas y 3) cómo una comunidad microbiana severamente alterada afecta salud de las abejas. Se definieron los objetivos experimentales para hacer frente a las preguntas anteriores utilizando una combinación de experimentos basados en laboratorio y campo. Mediante metagenómica de vanguardia y técnicas moleculares junto a métodos tradicionales de observación del campo, esta investigación tiene como objetivo juntar los posibles efectos de fungicidas en la salud de las abejas.

El primer objetivo de este estudio es demostrar que fungicida exposición solo puede causar pérdidas significativas de la Colonia entre especies nativas. Un estudio con jaulas de campo grande fue utilizado para investigar los efectos de la exposición de fungicidas sobre el crecimiento de colonias de Bombus impatiens, una abeja nativa ubicua, abundante en los Estados Unidos (figura 1, figura 2, figura 3). Fue presumido que colmenas tratadas con fungicida presentaría menor aptitud y Demografía atípica comparado con colmenas no expuestos. Datos obtenidos de este experimento apoyaron esta hipótesis, demostrando que residuos de fungicida dentro de polen pueden ser la única causa de las pérdidas de Colonia profunda en un nativo bumble bee especie25. El segundo objetivo de este estudio es investigar la respuesta del microbioma del polen a la exposición de fungicida. Se presume que la composición de la comunidad de microbios dentro de polen-las disposiciones expuestas a fungicidas será diferente de la de polen sin tratar. Mientras que la diversidad y abundancia de hongos se espera que disminuyan significativamente, bacterias o una sola especie fúngica dominante probablemente crecerá sin control en ausencia de otros hongos competidores. A través de una serie de ensayos in vivo , estos cambios en la composición de la comunidad microbiana se analizará mediante metagenómica.

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Protocolo

1. examinar el efecto de la exposición al fungicida en Bumble Bee Colonia éxito usando jaula de experimentos de campo

  1. conjunto de hasta diez jaulas de malla en un campo sembrado con avena. Cavar una zanja alrededor de cada jaula y cavar los cuatro bordes de la jaula de malla en el suelo para asegurarse de que no pueden escapar de las abejas. Stock las jaulas con macetas, plantas con flores que son atractivas para las abejas (por ejemplo, trigo, borraja, alyssum, cosmos y girasoles) ( figura 2).
  2. Complementar las jaulas con una sola bandeja (36 cm x 42 cm) del trébol de in bloom. Racimo florales recursos dentro de una de las esquinas de la jaula, ocupando un espacio de aproximadamente 2,5 m x 1 m. Vegetate el área restante de la jaula por la avena.
  3. Asignar aleatoriamente el abejorro colonias, cada uno con los trabajadores y una sola Reina, un tratamiento (fungicida presente ausente, N = 5 colonias por tratamiento, total 10 colonias), luego los coloque dentro de una jaula de campo (N = 1/jaula) durante 29 días (23 de junio -21 2014 de julio de).
  4. Orientar las cajas de Colonia que la Colonia ' aberturas s punto hacia el sur para proporcionar a las abejas con las condiciones de navegación óptimas. Subvencionar las colonias con recipientes de agua de azúcar, dentro de las cajas de colmena para complementar la disponibilidad de néctar.
  5. Aplicar fungicida base de clorotalonil a nivel campo pertinentes (20 g/L) para plantas con flores en las jaulas de tratamiento cinco fungicida, con una mano sostuvo pulverizador de plaguicidas, dos veces durante el estudio (día 0 y 13). Capa de manera uniforme las flores que no hay más líquido se adhiere a superficies florales ( figura 3).
  6. Al concluir el estudio de campo jaula, quitar a mano las colonias B. impatiens de las jaulas, enfriar las colmenas colocando en congelador de -20 ° C por 20 min.
  7. Quitar las abejas utilizando pinzas estériles y anote el número de larvas, pupas, las hembras adultas (. e. forrajeras) y los machos adultos. Utilizando una balanza analítica grabar el seco-peso de la madre, Reina, larvas, pupas, adultos hembras (es decir, recolectoras) y machos.

2. Examinar los efectos de la exposición fungicida sobre las comunidades microbianas en las disposiciones de polen de Bumble Bee nidos utilizando laboratorio basado en los ensayos En Vivo

  1. pulverización comercialmente comprado polen a un polvo fino usando un estándar molino de bolas de laboratorio. Esterilizar en polvo polen sumergiéndolos en etanol al 70%, permitiendo que se evaporan durante la noche bajo luz UV. Verificar la esterilidad del polen por mg de ~0.5 en medios de agar para fines generales de la galjanoplastia.
    1. a la seca, polen esterilizado, utilizando pipetas estériles, añadir dosis pertinente campo de fungicidas: propiconazole 14.3%; azoxystrobin en 22,9% para los tratamientos (0,74 μl y 0.65 μl respectivamente / día / colmena). Mezclar con palillos de madera estériles.
  2. Lugar 6 colmenas experimentales (n = 3 para el control y tratamiento) en un banco de laboratorio limpio, higiénico mantenida a temperatura ambiente. Cada día pesar 4,27 g de polen 34 , 35 mezclado con fungicidas (para los tratamientos) o agua estéril (para control) dentro de una campana mediante una técnica aséptica estándar.
    1. Las puertas de trampa siempre por el lado de la caja de cartón que encierra las colmenas, introducir el polen en las colmenas. Suplemento a las colmenas con solución de azúcar esterilizados cada semana. Continúe alimentando régimen durante cuatro semanas.
  3. Al concluir el estudio de laboratorio, enfriar las colmenas por lugar en tubos de almacenamiento estéril y colocar en el congelador de-20 ° C durante 20 min raspar hacia fuera el polen dispuesto dentro de cámaras de cría utilizando pinzas estériles y espátulas. Tienda a-80 ° C. Conde y registro del peso de los trabajadores y de la reina madre al inicio y al final del experimento (paso 1.7).
  4. Aislar ADN de muestra de polen de la misma mediante el aislamiento de ADN disponible en el mercado kits (para detalles, véase tabla de materiales).
    1. Añadir 0,25 g de polen-disposición a la extracción de los tubos, brevemente vortex para mezclar el.
    2. Hacer un 200 mg/mL lisozima solución en agua destilada desionizada, suficiente para la muestra de 50 μl. Agite vigorosamente para solución de forma completamente.
    3. Añadir 50 μl de la solución de lisozima en los tubos de extracción con la muestra en él y mezclar bien por inversión varias veces. Incubar los tubos durante 10 min a 37 ° C en un baño de agua. Si ha formado el precipitado, calentar la solución a 60 ° C hasta que se disuelva antes de usar.
    4. Añadir 70 μl de solución de lisis acuosa para tubos de extracción, fije horizontalmente en una superficie plana vortex plataforma con cinta, y los tubos vortex durante 10 minutos, centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
    5. Transferir el sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL. Añadir 250 μl de solución de precipitación de proteína y de vortex por 5 s. incubar a 4 ° C por 5 min en un baño de hielo.
      Nota: Esperar entre 400 μL a 500 μl del sobrenadante. Sobrenadante puede contener algunas partículas de.
    6. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x g y transferir hasta 600 μl de sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL. Añadir 200 μL de solución de eliminación acuosa inhibidor, vortex e incubar a 4 ° C por 5 min, centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x g. transferir hasta 750 μl de sobrenadante a un tubo de recogida limpio de 2 mL.
    7. Agregar 1200 μl de solución acuosa atar al sobrenadante y vortex durante 5 s. carga aproximadamente 675 μl del sobrenadante en un filtro de centrifugado y centrifugar a 10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través de.
    8. Repetir 2.4.7. dos veces.
      Nota: Se requiere un total de tres cargas para cada muestra procesada.
    9. Añadir 500 μl etanol y centrifugar a temperatura ambiente durante 30 s a 10.000 x g. Deseche el flujo a través y centrifugar nuevamente a temperatura ambiente durante 1 min a 10.000 x filtro de centrifugado de lugar g. en un tubo de recogida limpio de 2 mL.
      10. Buffer de
    10. Agregar 100 μl de elución al centro de la membrana del filtro. Centrifugar a temperatura ambiente durante 30 s a 10.000 x g. Deseche el filtro de centrifugado. Tienda recogidas ADN entre-20 ° C y -80 ° C
  5. uso aislado ADN para secuenciación.
    1. Cuantificar y normalizar el ADN aislado a 2 ng/μl por análisis fluorométrico.
      1. Preparar reacciones por triplicado para cada muestra extraída comparar las cantidades relativas de 28S (planta), analizar su (hongos), 16S (bacteriana) componentes y de cada muestra de polen-disposición 36. Asegúrese de que cada reacción contiene 10 ng de ADN total, 2 x de master mix de Cianina asimétrica basada tinte y 2,5 μl de cartillas de avance y retroceso pares 28KJ/28B 37 para planta y ITS1/ITS5.8R para el ADN fúngico 38 .
    2. Amplificar ADN usando los siguientes parámetros: desnaturalización previa de 2 min a 50 ° C, 2 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 40 ciclos de (15 s a 98 ° C, 15 s a 58 ° C, 60 s a 72 ° C), seguido por una curva de fusión en.
    3. Preparar un protocolo PCR 2-step, anidado utilizando bibliotecas de secuenciación de próxima generación dirigido a rRNA 16S región variable V3/V4 y ITS / 5.8s región del espaciador de rRNA.
      1. Agregar 12,5 μl de DNA 5 pmol de cada primer y 2 x master mix. Hacen reacciones diferentes para cada región (16S o ITS; ver tabla 1). Modificar iniciadores específicos de la región descrita 39 , 40 para agregar secuencias de nucleótidos específicas de secuenciador adaptador saliente a las secuencias específicas del gen.
      2. Realizar amplificación inicial usando los siguientes parámetros: 3 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 25 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), extensión final de 5 min a 72 ° C.
      3. Siguiente inicial amplificación, verificar el tamaño de la biblioteca y la cantidad de movilidad electroforética y limpiar con un 1 x volumen fase sólida imm reversibleobilization granos para quitar cebadores residual y reactivos de la reacción. La piscina 16S y sus amplicones cuantitativamente para crear un pool de productos individuales para cada muestra.
      4. Añadir adaptadores específicos de secuenciador y muestra índices duales específicos utilizando los siguientes iniciadores (ver tabla 1). Añadir 2,5 μl de ADN amplificado a 5 pmol de cada primer y 2 x master mix. Realizar la amplificación de la biblioteca utilizando los siguientes parámetros: 3 minutos de desnaturalización inicial a 95 ° C, 8 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), extensión final de 5 min a 72 ° C.
    4. PCR siguientes, bibliotecas limpio acabadas usando un volumen de 1 x de granos de inmovilización reversible la fase sólida. Evaluar la calidad y cantidad de las bibliotecas terminadas con movilidad electroforética y fluorometría, respectivamente. Estandarizar las bibliotecas para 2 μm y piscina antes de la secuencia.
    5. Realizar la secuenciación de próxima generación en una plataforma similar a los adaptadores en la PCR secundaria, con una longitud apropiada para cubrir el entero amplicon 41.
  6. Secuencia anotación y análisis de la composición microbiana.
    1. Combinar par secuencia datos (R1 y R2) en único contigs de bibliotecas todo secuenciadas. Después de combinar los archivos R1 y R2, se produce un archivo fasta individual para cada una de las bibliotecas de.
      Nota: Este paso y los procesos que se describen a continuación (salvo indicación en contrario) se realizaron en Mothur versión 1.38.0 38.
    2. Pantalla cada archivo fasta para eliminar bases ambiguas, inesperadas secuencias largas y homopolímeros largo.
      Nota: Los parámetros para la detección y eliminación de la secuencia son maxambig = 0, maxlength = 600 y maxhomop = 8 para ambos genes. Quitar secuencias idénticas, pero mantener una tabla de contingencia por separado para todas las bibliotecas (también conocido como tabla de Conde en Mothur).
    3. Alinear secuencias únicas de la biblioteca de genes 16S contra la versión de base de datos SILVA 123 y la biblioteca de su gen contra la base de datos se unen su 42.
      Nota: Las secuencias deben anotarse desde el nivel unido al nivel de género.
      1. Posteriormente, clúster alineados secuencias con la función pre.cluster con diff = 5 y quitar quimeras.
    4. Clasificar secuencias usando el método de Wang 43 basado en los archivos de taxonomía unen sus (por su gen) (valor de corte de 80%) y SILVA (para el gen 16S).
    5. Carga en R 44 las tablas de contingencia (uno por cada gen) generadas durante el proceso de clasificación en Mothur. En cada nivel taxonómico, obtener abundancia relativa por la biblioteca para su posterior análisis de los cambios de la comunidad microbiana.
      Nota: En cada nivel taxonómico, fusionar grupos taxonómicos cuando abundancia relativa es inferior al 2% para todas las repeticiones experimentales.

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Resultados

Estudio de la jaula del campo:

Datos obtenidos de los experimentos de jaula demostraron que las colonias de abeja bumble tuvieron una respuesta significativa a la exposición de fungicida. Las colmenas tratadas con fungicida produjeron significativamente menos trabajadores (12,2 ± 3.8, media ± SE) que las colmenas de control (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figura 4

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Discusión

Las investigaciones sobre los efectos de fungicidas en la salud de las abejas se han mantenido un estudiado aspecto de estrategias de manejo de plagas. Nuestro estudio pretende brecha este conocimiento mediante el uso de un conjunto de técnicas complementarias que explícitamente aislar los factores potenciales que impulsan abeja disminuye. La planificación, razonamiento y representación de estos experimentos se detallan a continuación.

Es importante asegurarse de que no las abejas se les permi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El autor (es) gracias a la Universidad de Wisconsin biotecnología centro DNA secuencia instalación para proporcionar amplificación secuenciación instalaciones y servicios, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto y Max Haase para asistencia técnica con Análisis molecular. Este trabajo fue apoyado por fondos de USDA-Agricultural Research Service apropiado (actual investigación sistema de información #3655-21220-001). Apoyo adicional fue proporcionado por la National Science Foundation (bajo la subvención no. DEB-1442148), el DOE grandes lagos Bioenergy Research Center (DOE oficina de ciencia DE BER-FC02-07ER64494) y el Instituto Nacional de alimentos de USDA y la agricultura (proyecto 1003258 de la portilla). C.T.H. es un erudito de Pew en las ciencias biomédicas y Alfred Toepfer facultad miembro, apoyada por la Pew Charitable Trusts y la Fundación Alexander von Humboldt, respectivamente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Colmena NatupolKoppert USRESM116 colmenas
Propiconazol 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propiconazol 14.3%
AabundanteSyngenta4033540Azoxystrobin 22.9%
ClorotalonilSyngenta3452Fungicida utilizado para ensayos
Gránulos de polenAbeja rescatadaB004D5650C3X 16oz botellas, polen para ensayos
Cepas bacterianas para inoculaciónCurrie Lab
Cepas de levadura para inoculaciónHittinger lab
Pares de cebadores Centro deBiotecnología
Kit de aislamiento de ADNMo Bio12830-50Comercial kit de aislamiento de ADN
Qubit dsDNA HS ThermoFisherQ32851DNA herramienta de cuantificación
Seleccione Master Mix for CFXThermo Fisher4472952Se utiliza para realizar PCR en tiempo real utilizando el colorante SYBR GreenER.
Sistema de detección de PCR en tiempo realBio Rad1855196Instrumento utilizado para la amplificación
PCR Kit de limpieza de PCR,Axygen10159-696Se utiliza para la eliminación eficiente de dNTP, sales y enzimas no incorporadas
1000 KitAgilent5067-1504Se utiliza para el dimensionamiento y análisis de fragmentos de ADN
MiSeq SequencerIlluminaUtilizado para la próxima generación secuenciación
Cristalería variada (vasos, frascos, pipetas, tubos de ensayo, repiquete)VWR
de la UW de DNA

Referencias

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