Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Resumen

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Resumen

Scramblases translocan fosfolípidos través de la bicapa de membrana bidireccionalmente de una manera independiente de ATP. La primera escramblasa a ser identificado y bioquímicamente verificada fue opsina, la apoproteína de la rodopsina de los fotorreceptores. La rodopsina es un receptor acoplado a proteína G localizados en las membranas de disco varilla de fotorreceptores de la retina donde es responsable de la percepción de la luz. Actividad escramblasa de rodopsina no depende de su ligando 11- cis retinal, es decir, la opsina apoproteína también es activo como un escramblasa. Aunque fosfolípido constitutiva y regulada de aleatorización jugar un papel importante en la fisiología celular, sólo unos pocos scramblases fosfolípidos han sido identificados hasta el momento, además de opsina. Aquí se describe un ensayo basado en la fluorescencia de la actividad escramblasa de opsina. Opsina se reconstituye en grandes liposomas unilamelares compuestos de fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol y una cantidad traza de fluorescencia NBD marcado con PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) amino] hexanoil} - sn -glicero-3-fosfocolina). actividad escramblasa se determina midiendo el grado en que las moléculas de NBD-PC situados en la cara interna de la vesícula son capaces de acceder a la cara externa, donde su fluorescencia se elimina químicamente por un agente reductor que no pueden atravesar la membrana. Los métodos que describimos tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para identificar y caracterizar las actividades escramblasa de otras proteínas de membrana.

Introducción

La rodopsina fotorreceptor, una proteína G-receptor acoplado prototípico (revisado por ejemplo en la referencia ^1), es la primera escramblasa fosfolípido ser identificados y bioquímicamente verificada ^2,3. Scramblases son transportadores de fosfolípidos que aumentan la tasa intrínsecamente lenta de transbilayer movimiento fosfolípido a fisiológicamente niveles apropiados en un bidireccional, de manera independiente de ATP ^4-6. Ejemplos de sus acciones se pueden encontrar en el retículo endoplásmico y la membrana citoplasmática bacteriana donde aleatorización constitutiva se necesita para la homeostasis de la membrana y el crecimiento,....

Protocolo

1. Preparación de liposomas y proteoliposomas

1. formación de liposomas
   1. Usando una jeringa de vidrio, añadir 1.435 POPC l (25 mg / ml, en cloroformo) y 160 POPG l (25 mg / ml, en cloroformo) a un matraz de fondo redondo para obtener 52,5 mol lípidos en una relación molar de POPC: POPG = 9: 1.
   2. Secar los lípidos de 30 min usando un evaporador rotatorio a una velocidad de rotación de 145 rpm (no se necesita baño de agua para este volumen de disolvente), a continuación, transferir el matraz a un desecador de vacío durante al menos 3 horas o durante la noche, a temperatura ambiente (RT).
   3. Hidratar la película lipídica seca con 10 ml de ....

Resultados

Se describe la reconstitución de la opsina en LUVs para caracterizar su actividad escramblasa usando un ensayo basado en fluorescencia. Se analizan los resultados para establecer un límite inferior de la tasa de fosfolípidos mediada opsina codificación y para determinar el estado en el que oligomérica opsina reconstituye funcionalmente en las vesículas.

Para identificar las condiciones óptimas de la reconstitución, es necesari.......

Discusión

El ensayo de actividad escramblasa nos permitió originalmente para determinar que la opsina tiene actividad escramblasa fosfolípido ^2. El ensayo también nos permitió caracterizar la actividad escramblasa de opsina por evaluación de la especificidad (se utilizó una variedad de lípidos reportero marcados con NBD tales como NBD-fosfatidiletanolamina, marcado con NBD en una cadena de acilo como se muestra para NBD-PC en la Figura 1A, o en el grupo de cabeza, NBD-esfingomielina o NBD- fosfatidilse.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Lípidos Polares	850457C	POPC
1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-RAc-(1-glicerol) (sal de sodio)	Ápices Avanti Lípidos Polares	840457C	POPG
1-palmitoil-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]hexanoil}-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl Sigma		S7653-1KG	NaCl
Dodecil-β-D-maltósido	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Cubetas de fluorímetro	sigma	C0918-100EA
Espectrofluorómetro	Photon Technology International, Inc.	fluorímetro
hidrosulfito de sodio de grado técnico, 85%	Sigma	157953-5G	ditionito
GraphPad Prisma 5 software			Prisma
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extrusora	Lípidos del Norte, Inc.		Extrusora
Whatman, Disco de drenaje, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Soporte de disco
Whatman Membranas grabadas con pista de nucleporos, 0,4 y micro; m, 25 mm de diámetro	Sigma	WHA110607	membrana de 400 nm
Membranas Whatman Nucleopore Track-Etched, 0,2 y micro; m, 25 mm de diámetro	Sigma	WHA110606	200 nm membrana
fosfato de sodio	Sigma	S3264-500G
Tubos de cultivo VWR, desechables, vidrio de borosilicato, 13 x 100 mm	Tubos de vidrio	VWR Scientific	47729-572
Ácido perclórico	Sigma	30755-500ML
Molibdato de amonio Tetrahidrato	Sigma	A-7302	Molibdato de amonio
(+)-L-ascorbato de sodio	Sigma	A7631-25G	ascorbato de sodio
Bio-Beads SM2 adsorbentes	Bio Rad	1523920	perlas de poliestireno
2,0 ml Microtubos transparentes	VWR Scientific	10011-742 Tubos de	reconstitución Tubo
vidrio de reconstitución	VWR Scientific	53283-800 Tubos de	vidrio de reconstitución
Zetasizer	Malvern		Dls

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