La anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar las interacciones proteína-proteína

Resumen

interacciones de proteínas están en el corazón de la función de la célula. técnicas calorimétricas y espectroscópicas son comúnmente utilizados para caracterizarlos. Aquí describimos anisotropía de fluorescencia como una herramienta para estudiar la interacción entre la proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Diamond (SBDS) y el factor de elongación 1 similar GTPasa (EFL1).

Resumen

Las interacciones proteína-proteína desempeñan un papel esencial en la función de un organismo vivo. Una vez que una interacción ha sido identificado y validado es necesario caracterizar en el nivel estructural y mecánica. Existen varios métodos bioquímicos y biofísicos para tal fin. Entre ellos, anisotropía de fluorescencia es una técnica poderosa particularmente cuando se utiliza la intensidad de fluorescencia de una proteína marcada con fluoróforo permanece constante tras la interacción proteína-proteína. En esta técnica, una proteína marcada con fluoróforo se excita con luz polarizada verticalmente de una longitud de onda apropiada que excita selectivamente un subconjunto de los fluoróforos en función de su orientación relativa con el haz entrante. La emisión resultante también tiene una direccionalidad cuya relación en los planos vertical y horizontal define la anisotropía (r) como sigue: r = (I _VV -I _VH) / (I + 2I _{VV VH),} donde I _VV y yo

Introducción

Las células contienen una multitud de biomacromoléculas que interactúan constantemente entre sí. Esta asociación da lugar a complejos que participan en las vías celulares responsables de su funcionamiento en la transducción de señales, regulación de la expresión génica y la migración celular entre otros. Todas las interacciones proteína-proteína que se producen en una célula comprenden una red conocida como el interactome. En Saccharomyces cerevisiae más de 70% de sus proteínas se ha demostrado que tiene que interactúan socios ^1. La comprensión de la interactoma de una célula y sus funciones proporcionar información relevante sobre la complejidad ....

Protocolo

1. SBDS-flash expresión de la proteína Tag y Purificación

NOTA: Para los experimentos de anisotropía, una etiqueta de flash correspondiente a la secuencia de-Pro-Cys-Cys-Cys Gly Cys se añadió a la C-terminal de la secuencia de codificación SBDS humanos por PCR. Este constructo se subclonó en el vector de expresión pRSET-A y se transformó en células C41 Escherichia coli para expresar una proteína que codifica una etiqueta de hexahistidina N-terminal (His-tag), los SBDS humanos secuencia y un C-terminal etiqueta FLASH ¹⁰ de codificación.

1. Expresión de la proteína SBDS-Flash
   1. Transformar E. competen....

Resultados

Para llevar a cabo cualquier experimento anisotropía es importante para descartar grandes cambios en la intensidad de fluorescencia del fluoróforo ya que la anisotropía observada de una mezcla de especies está representada por la Ecuación 5:

donde F _i representa la fluorescencia fra.......

Discusión

La mayoría de los experimentos bioquímicos con proteínas requieren no sólo proteína pura, sino también grandes cantidades de ellos, independientemente de la técnica utilizada. Por esta razón, las proteínas utilizadas para este tipo de experimentos se obtienen mediante la expresión heteróloga, como era el caso que aquí se presenta. espectroscopia Florescence requiere la presencia de un fluoróforo en la molécula estudiada. residuos aromáticos constituyen los fluoróforos intrínsecos de una proteína, sin embargo, el uso de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,5 mm Perlas de vidrio	Productos Biospec 11079105
Tris Base	Formedium	TRIS01	Glicerol ultra puro
	Sigma-Aldrich	G5516
colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceína	ThermoFischer Scientific	LC6090	Este kit contiene el colorante para etiquetar una etiqueta FlAsH
Ampiciline	IBI Shelton Scientific, Inc	IB02040
D(+)-Glucosa Anhidra	para medio	GLU03
D(+)-Galactosa	para medio	GAL03
L-Leucina	para medio	DOC0157
L-Triptofan	Para
	medio Sigma-Aldrich	B6506-5G
PMSF	Gold Biotechnology, Inc	P-470-25	Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
NaCl	para el medio	NAC02	Cloruro de sodio
Glycerol	Tecsiquim, S.A. de C.V.	GT1980-6
MgCl2	Merck Millipore Corporation	1725711000	Cloruro de magnesio
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399-500G
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P3786-500G	Fosfato de potasio dibásico
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S3139-500G	Fosfato de sodio monobásico
Levadura base nitrogenada sin aminoácidos	Formedium	CYN0410
Extracto de levadura	Formedium	YEM03
L-Tyroisne		Para sulfato
	Formedium	DOC0230
Casamino acids	Formedium	CAS03
Tryptone	IBI Shelton Scientific, Inc	IB49182
IPTG	Formedium	IPTG025
Unidades de filtración	Merck Millipore Corporation	UFC901096	Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10  Filtro
membrana	Merck Millipore Corporation	GSWP04700	Filtro de membrana, ésteres de celulosa mixtos, hidrófilos, 0,22  y micro; m, 47 y nbsp; mm, blanco, liso
Columna de afinidad de Ni2+	QIAGEN	30760	Cartucho precargado con 5  ml Ni-NTA Superflow
Columna intercambiadora de cationes de sulfopropilo fuerte	GE Healthcare Life Science	17-5157-01	HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Columna de exclusión de tamaño	GE Healthcare Life Science	28989335	HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Célula de fluorescencia	Hellma Analytics	111-057-40
Espectrofotómetro	Agilent Technologies G6860AA		Cary 60 Agitador UV-Vis
	ThermoFischer Scientific	SHKA4000-7	MaxQ 4000 Rango de temperatura de sobremesa Ambiente-15 grados a 60 grados;
Centrífuga	ThermoFischer Scientific 75004271		Heraeus Megafuge 16R
FPLC	Pharmacia Biotech	Descatalogado	Sistema FPLC Monitor de conductividad UV-MM II Fracción de bomba P500
Espectrofluorómetro	Olis	No aplicable	Olis DM 45 con polarización Toolbox

el clorhidrato de bezamidina de DOC0189 micro granulado de adenina de DOC0193 medio de kDa C