Aquí describimos una técnica basada en microscopio para visualizar y cuantificar las cascadas tempranas de eventos durante la fagocitosis de patógenos como los hongos Candida albicans y partículas que miden más de 0,5 μm, incluyendo zymosan y perlas recubiertas de IgG.
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Artículo de método
La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis
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Resumen
Resumen
El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis 1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular 2, 3. Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno 3, 4.
Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.
Introducción
A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros.
La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocim....
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Protocolo
1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares
NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células.
- Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2.
- Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en luga....
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Resultados
se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesis de los esfi.......
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Discusión
fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular 8, 19, 20. Para entender mejor este proceso dinámico, la visualizaci.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Damos las gracias a Wendy salmón y Nicki Watson de la instalación Keck en el Instituto Whitehead del MIT para la formación de imágenes.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Tecnología de señalización celular | 9998 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dilactato) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco' s Águila Mínima' s medio) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Solución salina tamponada con fosfato) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Suero fetal bovino | Sigma Aldrich | 12003C | |
| Perlas de látex recubiertas de IgG acopladas a FITC | Cayman | 500290 | |
| L-glutamina 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| solución de paraformaldehído (4% en PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 celdas | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponina | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Solución de azul de tripano (0,4 % (p/v) en PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0,05 %) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Solución detergente | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicato Sistema de cubreobjetos (8 cámaras) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 con rejillas | Hycor | 87144 |
Referencias
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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Reimpresiones y permisos
