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Artículo de método

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

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DOI:

10.3791/54657

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30 de noviembre de 2016

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1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La capacidad de los clones metastásicos para colonizar sitios distantes depende de su capacidad de proliferación y/o de su capacidad para sobrevivir en el microambiente del huésped sin una proliferación significativa. En este trabajo se presenta un modelo animal que permite la visualización cuantitativa de ambos tipos de colonización hepática por clones metastásicos.

Resumen

Los pacientes con un número limitado de metástasis hepáticas y bajas tasas de progresión pueden ser tratados con éxito con el tratamiento local se aproxima a 1,2. Sin embargo, poco se sabe acerca de la heterogeneidad de las metástasis hepáticas, y se necesitan modelos animales capaces de evaluar el desarrollo de las colonias metastásicas individuales. A continuación, presentamos un modelo avanzado de las metástasis hepáticas que proporciona la capacidad de visualizar cuantitativamente el desarrollo de clones individuales del tumor en el hígado y estimar su cinética de crecimiento y la eficiencia de la colonización. Hemos generado un panel de derivados monoclonales de células de cáncer colorrectal humano HCT116 de forma estable con la etiqueta luciferasa y tdTomato y que poseen diferentes propiedades de crecimiento. Con una inyección esplénica seguido de una esplenectomía, la mayoría de estos clones son capaces de generar metástasis hepáticas, pero con diferentes frecuencias de la colonización y diferentes tasas de crecimiento. Uso de la Syste In Vivo Imagingm (IVIS), es posible visualizar y cuantificar el desarrollo de metástasis con luminiscente in vivo y ex vivo de imagen fluorescente. Además, Diffuse luminiscentes tomografía (DLIT) proporciona una distribución 3D de las metástasis hepáticas in vivo. Ex vivo de imágenes de fluorescencia de hígados cosechadas proporciona mediciones cuantitativas de colonias metastásicas hepáticas individuales, lo que permite la evaluación de la frecuencia de colonización hígado y la cinética de crecimiento de metástasis. Puesto que el modelo es similar a metástasis hepáticas clínicamente observados, puede servir como una modalidad para la detección de genes asociados a metástasis de hígado y para probar posibles tratamientos ablativos o adyuvante para la enfermedad metastásica de hígado.

Introducción

Los pacientes con metástasis hepáticas de los cánceres primarios de colon (CRC) se caracterizan por un mal pronóstico. La tasa de supervivencia a 5 años para los primarios no metastásicos CRC (estadios I - III) se estima en un 75 - 88% 3,4, mientras que los pacientes con metástasis hepáticas (estadio IV) tienen una tasa de supervivencia a 5 años de sólo el 8 - 12% 5 , 6. Sin embargo, los pacientes metastásicos representan un grupo heterogéneo presentando con diferente número de metástasis y recurrencia diferentes momentos. Las observaciones clínicas indican que el número de metástasis (que puede ser proporcional a la capacidad de colonización o la frecuencia de colonización) y el tamaño de cualquier metástasis única (proporcional a la tasa de crecimiento local) son factores pronósticos independientes 1,7. En otras palabras, el éxito de clones metastásicos que colonizan el hígado depende de dos propiedades principales: su capacidad para crecer y su capacidad para difundir y sobrevivir en el microambiente de hígado.

El diseñode modelos clínicos exitosos con la capacidad de capturar y cuantificar las propiedades de clones metastásicos puede mejorar drásticamente nuestra comprensión de la biología del hígado metástasis y proporcionar una herramienta eficaz para el diseño de posibles enfoques terapéuticos. Modelos de metástasis hepática experimental se ha informado anteriormente 8,9, pero ninguno de ellos siempre que la capacidad de capturar y describir las propiedades de clones metastásicas individuales tanto in vivo como ex vivo cuantitativamente.

A continuación, presentamos un nuevo modelo, avanzada de la metástasis hepática que incluye la generación de clones tumorales con diferentes eficiencias de colonización del hígado y propiedades de crecimiento. Empleamos una combinación de de doble etiquetado de las células cancerosas con la luciferasa y la proteína fluorescente tdTomato con la generación de líneas de células monoclonales que tienen diferencias intrínsecas en la capacidad metastásica. En este modelo experimental, los datos indican que el desarrollo demetástasis hepáticas pueden ser descritos en términos de frecuencia de colonización y el tiempo de duplicación (Td), que es coherente con las observaciones clínicas. La naturaleza cuantitativa de este modelo hace que sea fácil adopción para el descubrimiento de fármacos y diagnóstico.

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Protocolo

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Chicago (Protocolo # 72213-09) y llevaron a cabo en condiciones estériles.

1. Preparativos

  1. Hacer 500 ml de medio para el cultivo de las células tumorales HCT116: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
  2. Autoclave los instrumentos que pueden utilizarse para el modelo de inyección bazo, incluyendo 3 - 4 toallas quirúrgicos, gasas, dos pastillas Adson pequeños, un conductor de la aguja, dos pares de tijeras, una pequeña pinza, y 3 microclips, a 251 ° F durante 20 minutos .
  3. Preparar anestesia postoperatoria de los ratones, a ser administrado por vía subcutánea después de la inyección bazo. Diluir de 2 - 4 mg de buprenorfina en 500 l de solución salina normal al 0,9 por ratón.
  4. Preparar alícuotas de 150 mg / 150 ml de luciferina de luciérnaga para inyecciones intraperitoneales During los ensayos de bioluminiscencia. Almacenar a -20 ° C y proteger de la luz.

2. Generación de marcadas con tdTomato luciferasa / Líneas celulares monoclonales 10,11

  1. Descongelar y mantener las células cancerosas HCT116 humanos colorrectales y 293FT células de riñón de embriones humanos en DMEM con 10% de SFB, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener en cultivo a 5% de CO2 y 37 ° C.
  2. Producir un lentivirus alto título.
    1. En D 1, la placa de 10 - 12 x 10 6 293FT células entre el paso 3 y 10 en 15 cm placas de cultivo celular en 18 ml de DMEM completo (cDMEM) con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, y 1% de aminoácidos no esenciales . Se incuba a 37 ° C y 5% de CO2.
    2. En D2, transfectar las células utilizando la siguiente solución de transfección:
      1. Para cada plato, utilice la siguiente: una mezcla de ADN de 37,5 g de pFUG vector lentiviral insertado con la luciferasa (Luc2) y tdTomatoconstruye 11 (un regalo del doctor Geoffrey Greene en la Universidad de Chicago), 25 g de pCMVΔ8.74, y 12,5 g de pMD2.G se volvieron a suspender en un total de 1.062 l de H2O estéril Añadir 188 l de 2 M de CaCl2.
      2. Añadir 1,250 l de solución salina tamponada con Hepes 2x (HBS, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 180 mM, pH 7,12) a la solución de ADN / CaCl 2, una gota a la vez, mientras que las burbujas que soplan a través de la solución con una pipeta.
      3. Incubar a TA durante 20 min, y a continuación, añadir 15,5 ml de RT cDMEM y cloroquina para hacer una concentración final de 25 mM.
    3. Aspirar los medios de comunicación en cada plato de 293FT células y reemplazar con la solución de transfección. Añadir 16 ml de la solución de transfección lentamente, como las células cultivadas en placas desprendan fácilmente.
    4. En el día 3, después de las 8 - 16 horas, se retira la solución de transfección y se lavan las células una vez con Dulbecco tamponada con fosfato salino (DPBS), de nuevo taking cuidado de no desalojar las células. Reemplazar los medios de comunicación con 18 ml de cDMEM fresca con Hepes 10 mM.
      NOTA: mueva lentamente platos, aspirar la solución de transfección, y añadir los medios de comunicación a través de la pared lateral de las placas de modo que no se desprenda de las células.
    5. En D 4, a las 48 h desde el momento de la transfección, recoger los medios de comunicación de los platos mediante la aspiración lentamente con una pipeta a fin de no desalojar las células. Centrifugar los medios recogidos a 300 xg durante 5 min para precipitar los restos celulares grandes.
    6. Filtrar el sobrenadante viral utilizando un 0,45 micras de baja unión a proteínas matraz de filtración y se centrifuga usando un rotor SW-28 durante 2 horas a 50.000 xg y 4 ° C. Se decanta el sobrenadante inmediatamente después de que finalice centrifugación y secar el interior del tubo del compartimiento de carga.
    7. Resuspender el sedimento viral en 50 l de medio de suero reducido (RSM) con 1% de FBS. Las alícuotas se pueden almacenar a -80 ° C para su uso futuro (Stock viral).
  3. Transducir la lentivirusES en las células HCT116 y generan un panel de clones tdTomato-positivos.
    1. Placa de las células HCT116 a una densidad de 1 x 10 5 en placas de 24 pocillos 1 d antes de la infección viral.
    2. Diluir 40 l de virus resuspendido (de 2.2.7) en 4 ml de RSM (dilución 1: 100) con 1% de penicilina / estreptomicina y 8 mg / ml de polibreno (CRSM).
    3. En el día de la infección, se lavan las células una vez con DPBS, y a continuación, añadir 250 l de virus diluido desde el paso 2.3.2 a cada pocillo. Se incuba durante 4 horas a 37 ° C y CO 2 al 5% y, a continuación, añadir 1 ml de cDMEM a cada pocillo; incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 - 72 h.
    4. Resuspender las células con 1 ml de tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM, y después se añade 1 ml de cDMEM para neutralizar la tripsina. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga y pellet a 300 xg durante 4 min. Lavar el sedimento 3 veces en 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) más 2% de FBS.
    5. Resuspender el precipitado de la etapa 2.3.4con tampón FACS (2% FBCs y EDTA 2 mM en PBS) en una suspensión de una sola célula a 1 x 10 6 células / ml.
    6. Ordenar las células HCT116 tdTomato positivos utilizando un clasificador celular, apertura de puerta de células PE positivas (excitación / emisión: 556/585 nm). Cultivar las células recogidas en una placa de 10 cm a 5% de CO2 y 37 ° C para generar células HCT116 tdTomato positivo parentales (Figura 1A).
    7. Resuspender las células HCT116 tdTomato-positivo de los padres de 2.3.6 con 8 ml de tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 min, y luego añadir 8 ml de cDMEM para neutralizar la tripsina.
      1. Transferir las células a un tubo y pellet 50 ml a 300 xg durante 4 min. Eliminar el sobrenadante y diluir las células HCT116 tdTomato-positivo de los padres a 1 célula por cada 200 l en cDMEM (Figura 1B).
    8. Placa de una sola célula (200 l de la dilución) por pocillo en una placa de 96 pocillos a 5% de CO2 y 37 ° C (Figura 1C).
    9. Crecer monoclones individuales en matraces a 5% de CO2 y 37 ° C. (Figura 1D).

3. calibrar la intensidad fluorescente de la señal en función del número de la célula

  1. Placa de las células HCT116 transfectadas, que ahora se conoce como HCT116-L2T, a una densidad de 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 y 10 5 células / pocillo en placas de 96 pocillos por triplicado para cada densidad.
  2. Después de 5 h de incubación, cuantificar los tdTomato intensidad de fluorescencia utilizando IVIS 10.
    1. Haga clic en el icono de la imagen del software en el escritorio para iniciar el software. Haga clic en el botón "Iniciar" para iniciar el sistema de imágenes. Una vez finalizada la inicialización (que dura unos pocos minutos), seleccione, "4 segundos" tiempo de exposición, hurgar en la basura "Fluorescencia" "Medium", "2" F / parada, "535" filtro de excitación,y el filtro de "580" emisión.
    2. Coloque la placa de 96 pocillos en la estación de formación de imágenes y haga clic en "Adquirir" para iniciar la imagen. Después se adquiere la imagen, haga clic en "Herramientas" retorno de la inversión en la paleta de herramientas y seleccione 12 x 8 desde el icono de hendidura.
    3. Crear 12 x 8 ranuras para cubrir el área de la señal en la imagen de la placa de 96 pocillos y haga clic en la pestaña mediciones. Observar una ventana con una tabla de mediciones de ROI con las unidades de fotones por s por estereorradián por cm cuadrado (fotones / s / sr / cm2).
  3. Construir un diagrama de dispersión con el argumento (eje X) igual al número de las células y la función (eje Y) que representa la intensidad de la señal. Calcule curvas de regresión usando un software de análisis de datos para calcular la cantidad de celdas correspondientes a la unidad de intensidad de fluorescencia (Figura 2) 10.

4. Modelo Animal de metástasis hepáticas

  1. Una vez que las células HCT116-l2t llegan a 70- 80% de confluencia, prepararlos aproximadamente 1 h antes de la inyección bazo. Disociar las células utilizando tripsina al 0,05% en EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 min, y después neutralizar con una cantidad igual de cDMEM. Asegúrese de pipeta a fondo para evitar la formación de grumos.
  2. Contar las células con un contador de células automático.
  3. Resuspender las células en 1x DPBS hasta una concentración de 1,2 - 2 x 10 6 células / 100 l. Asegúrese de pipeta y resuspender las células a fondo para evitar la formación de grumos.
  4. Mantener las células en hielo hasta la inyección, de vez en cuando resuspendiéndolas en el tubo.
  5. Antes de anestesiar a los ratones, proporcionar un anestésico preoperatorio y bolo de líquido por inyección subcutánea de 500 l de la mezcla de la buprenorfina se describe en el paso 1.3. Administrar la misma dosis de buprenorfina mezcla adicional de dos veces al día hasta que los signos de dolor (movilidad reducida, estatura encorvada, ausencia de limpieza, la vocalización cuando se maneja) han resuelto.
  6. Anestesie de 6 a 8 semanasratones atímicos hembra -old desnuda con 2% de isoflurano en oxígeno en una cámara de anestesia. Confirman que los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Transferir cada ratón anestesiado con un cono de nariz individual para la inyección bazo. Antes de la incisión, cada ratón se debe cubrir con un paño quirúrgico estéril.
  7. Identificar el bazo como un área púrpura visto externamente a través de la piel en el flanco izquierdo de los ratones desnudos. Con unas tijeras de microdisección, hacer una incisión en el costado izquierdo de 8 mm en la piel justo por encima del bazo.
    1. A continuación, levante la pared abdominal y hacer una pequeña incisión. Permitir que el aire en la cavidad abdominal a fin de que los órganos internos se alejan de la zona de la incisión. Agrandar la incisión de la pared abdominal a aproximadamente 5 mm.
    2. Exponer el bazo mediante la aplicación de una suave presión alrededor de la incisión con un hisopo de algodón. Si es necesario, la grasa de páncreas puede ser suavemente hombreipulated para ayudar con la exposición a fin de no lesionar el bazo.
  8. inyectar lentamente 100 l de células por medio de una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G en la punta del bazo expuesta. Inyectar lentamente, durante un período de al menos 30 - 60 s, para evitar los tumores de hígado extra.
  9. Colocar un microclip en el bazo antes de retirar la aguja al final de la inyección para evitar la fuga de la suspensión celular inyectada.
  10. Deje el microclip en su lugar durante 5 minutos.
  11. 5 minutos después de la inyección, lleve a cabo una esplenectomía utilizando un dispositivo de cauterio de mano para la hemostasia. Diseccionar el hilio esplénico, a partir de la cara anterior. Cuando la disección de los vasos grandes, pre-coagular el lado proximal de los vasos con el tejido adiposo adyacente, usando cauterio para evitar el sangrado excesivo.
    NOTA: Los métodos para la hemostasia: coagulan el punto de sangrado directamente con cauterio, aplique presión en el punto de sangrado durante 3 - 5 min, o sutura ligar el punto de sangrado con una corbata de seda 5-0.
  12. Cierre la incisión en el flanco de cada ratón en dos capas. En primer lugar, cierre de la pared abdominal con sutura absorbible 5-0 trenzada (por ejemplo, vicryl) en una sola puntada horizontal. A continuación, cerrar la piel mediante una sutura de monofilamento no absorbible 4-0 (por ejemplo, prolene), de nuevo con una única puntada horizontal.
  13. Limpiar todos los instrumentos mediante pulverización isopropanol al 70% para mantener las condiciones estériles entre cada procedimiento.
    NOTA: Asegúrese de que los animales se calientan mientras se despiertan de la anestesia. Supervisar todos los ratones después de la operación hasta que se convierten ambulatoria y retorno a la actividad normal. Típicamente, el tiempo de recuperación es de aproximadamente 3 - 5 min. No deje los animales sin vigilancia hasta que hayan recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.

5. En Vivo bioluminiscente de imágenes

  1. Realizar las imágenes enuna vez por semana para medir y cuantificar los cambios en la bioluminiscencia con el tiempo.
  2. Coloque los ratones en una cámara de anestesia y anestesiar con 2% de isoflurano en oxígeno. Confirman que los ratones son completamente bajo anestesia pellizcando las colas. Utilice ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
  3. A continuación, por vía intraperitoneal inyectar cada ratón con 150 l de la preprepared luciferina de luciérnaga desde el paso 1.4.
  4. Coloque los ratones en una IVIS con conos delanteros individuales administración de isoflurano. Coloque los ratones en la posición supina con los espaciadores en el medio para reducir al mínimo la señal a ratones adyacentes. Un máximo de cinco ratones puede ser proyectado en una sola vez.
  5. Medir y analizar las intensidades bioluminiscentes 3 min después de la inyección luciferina.
    1. Después de inicializar el IVIS como se describe en el paso 3.2.1, seleccione "luminiscente", "1 segundos" tiempo de exposición, y hurgar en la basura "Medio".
    2. Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imagingramo. Asegúrese de realizar cada imagen a la vez coherente (3 min) después de la inyección luciferina.
    3. Después se adquiere la imagen, aparecerá una ventana de imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en "Herramientas de ROI" y seleccione "1", "2", "3", "4" o "5" en el icono de círculo, que corresponde al número de ratones fotografiados.
    4. Para definir regiones de interés (ROI), un círculo alrededor del área de la señal de la señal luminiscente en la cavidad abdominal del ratón, y luego haga clic en "mediciones" del retorno de la inversión como una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm 2)). Asegúrese de tener un círculo de retorno de la inversión adicional del fondo.
  6. A las cuatro semanas después de la inyección y antes del sacrificio de los animales, realice difusa luminiscentes de imágenes de Tomografía (DLIT) usando IVIS para evaluar la carga tumoral y la distribución por la reconstrucción 3D en tiempo real de las intensidades bioluminiscentes de colonias tumorales individuales.
    1. Anestesiar los ratones y se inyecta luciferina, como se describe en el paso 5.2.4. DLIT se realiza en un ratón a la vez.
    2. Después de inicializar el IVIS, tal como se describe en el paso 3.2.1, seleccione "Asistente de imagen", "bioluminiscencia", y haga clic en "Siguiente". Seleccione "DLIT" y haga clic en "Siguiente". Seleccionar sondas "Firefly" y haga clic en "Siguiente". Seleccionar objeto "ratón" de la imagen, el parámetro "Auto" de la exposición, el campo "C-13 cm" de vista, y "0,5 cm" altura de tema, y ​​haga clic en "Siguiente". Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imágenes.
    3. Después se adquiere la imagen, seleccionar la pestaña "Reconstrucción DLIT 3D" y el "Analizar" ficha y haga clic en "Reconstruir" para generar la imagen de reconstrucción 3D.
    4. Haga clic en "Herramientas" y "Animación 3D". Seleccione "CCW Girar el eje Y" en la ventana de animación 3D. Haga clic en "Grabar" y "Guardar" en un archivo de formato .mov.

6. ex vivo de imágenes fluorescentes

  1. Sacrificar a los ratones por dislocación cervical, mientras anestesiado, o de acuerdo con las directrices institucionales a las 4 - 6 semanas después de las inyecciones de bazo.
  2. Se recoge el hígado. Hacer una incisión horizontal de izquierda a flanco derecho. Agarrando el proceso xifoides con una pastilla, diseccionar el falciforme, la vena hepática y la vena cava inferior.
    1. Diseccionar el ligamento hepatorrenal derecha, el ligamento hepatoduodenal, y el ligamento hepatorrenal la izquierda, teniendo cuidado de no dañar el lóbulo caudado, mientras que la disección del ligamento hepatoduodenal. Después de cosechar el hígado, extraer la vesícula biliar, ya que esto mostrará autofluorescencia. Tome nota de los tumores de hígado supletoria adicional presente.
  3. Tome nota de los números y los tamaños de los tumores hepáticos presente macroscópicamente, y colocar los hígados cosechados en DPBS.
    NOTA: Los tumores son macroscópicamente visible para el ojo desnudocomo tumores blancos (para un ejemplo representativo, véase la Figura 4).
  4. Antes de la colocación en la hoja de formación de imágenes, tome cada hígado y eliminar cuidadosamente el exceso de líquido por transferencia sobre una toalla de papel.
  5. Medir la intensidad de fluorescencia de cada colonia tumor usando el IVIS.
    1. Seleccione "fluorescencia", "4 segundos" tiempo de exposición, hurgar en la basura "Medium", "2" F / parada, "535" filtro de excitación, y el filtro de emisión "580". Haga clic en el botón "Adquirir" para comenzar a imágenes.
    2. Tras la adquisición de la imagen, busque la ventana de la imagen y la paleta de herramientas. Haga clic en "Herramientas de ROI" y seleccione "1" en el icono de círculo. Para definir regiones de interés, un círculo alrededor del área de la señal de colonias tumorales individuales en la imagen, y luego haga clic en "mediciones" del retorno de la inversión como una unidad arbitraria de la eficiencia radiante ((fotones / s / cm2 / estereorradián) / (mW / cm2) ). Asegúrese de tener un círculo de retorno de la inversión adicional del fondo.
  6. Calcular el volumen total del tumor suponiendo que sea una esfera. El volumen del tumor = 4 x π xr 3/3 (r = radio). Calcular la fracción de células formadoras de colonias tumor (FC) como el número de tumores en el hígado dividido por el número de células splenically inyectado.
  7. Calcular el número total de células por colonia (= X) de la aproximación lineal de la etapa 3.3. Calcular el número de divisiones celulares (= Y) como Y = log 2 X y la Td como Td (día) = 28 / Y.

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Resultados

El objetivo de este experimento fue establecer un modelo animal consistente y fácilmente reproducible con el potencial para la cuantificación de serie de la carga tumoral metastásica in vivo y para la estimación de la frecuencia de colonización y la cinética de crecimiento de desarrollar metástasis hepáticas. Figuras 2-6, con leyendas, están provistos de nuestra publicación anterior bajo una licencia Creative Commons CC-BY 10.

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Discusión

El modelo animal presentado en el informe actual se basa en dos enfoques principales. En primer lugar, a fin de garantizar la capacidad de observar clones metastásicos con diferentes propensiones a colonizar y proliferar en el hígado, se estableció un panel de líneas celulares monoclonales altamente heterogéneos, en lugar de una línea celular de cáncer no fraccionada establecido 12,13. El enfoque monoclonal para el desarrollo de la metástasis es justificado por los datos genómicos últimos 14 y fue ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Geoffrey L. Greene (Universidad de Chicago) para el plásmido Luc2-tdTomato y la línea celular HCT116, el Sr. Solanki Ani (Centro de Recursos de animales) para la gestión de los ratones, y el Dr. Lara Leoni por la asistencia con la DLIT. Cuantificaciones de intensidades fluorescentes y luminiscentes se realizaron en la Investigación de Recursos de imagen Pequeños Animales integrada en la Universidad de Chicago en un espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Virginia y DK Ludwig para la Investigación del Cáncer, la Fundación de Investigación de Cáncer de Pulmón (LCRF), la Fundación de Cáncer de Próstata (PCF), y el Centro de soporte de Grant Cáncer (P30CA014599). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IVIS Spectrum In Vivo sistemade imagen Caliper Life Sciences124262In Vivo software
LivingImage 4.0 CaliperSciences128165 software de imagen
VAD-MGX Research Máquina de anestesiaVetamacVAD-MGXmáquina de anestesia inhalatoria
DMEMGibco11965-118Reactivos de cultivo celular
DPBSGibco14190250Reactivos de cultivo celular
Penicilina/estreptomicina, líquido (10.000 unidades de penicilina; 10.000 μ g estreptomicina)Invitrogen15140163Reactivos de cultivo celular
HBSSThermoFisher24020117Reactivos de cultivo celular
Buprenex Inyección (0,3 mg/mL)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-5Clorhidrato de buprenorfina
Gemini CauteriySystem Braintree ScientificGEM 5917Cauterio manual para esplenectomía
Micro Clip; Recto; 70 gramos de presión; Ancho de clip de 1,5 mm; Longitud de la mandíbula de 10 mmInstrumento quirúrgico RobozRS-5426Hemoclip: Instrumentos de hemostasia después de la inyección en el bazo
D-luciferina, sal de potasioTecnología GoldbioLUCK-1GLuciferina sal de potasio
Opti-MEM I Medio de suero reducidoGibco31985062Medio de suero reducido
TC20 Contador de células automatizado BIO-RAD1450102Contador de células automático
Software JMP10 SAS InstituteSoftware de análisis de datos
BD FACSAria II clasificador de célulasBD Biocsiences Clasificador decélulas
Life

Referencias

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