Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Resumen

Microglia (células inmunitarias del cerebro), se utilizan como biosensor sustituto para determinar cómo influyen las nanopartículas en la neurotoxicidad. Describimos una serie de experimentos diseñados para analizar la respuesta de la microglía a las nanopartículas y la exposición de las neuronas hipotalámicas al sobrenadante de la microglía activada para determinar la neurotoxicidad.

Resumen

Las nanopartículas que se encuentran en los contaminantes del aire pueden alterar los perfiles de los neurotransmisores, aumentar la neuroinflamación y alterar la función cerebral. Por lo tanto, el ensayo descrito aquí ayudará a dilucidar el papel de la microglía en la neuroinflamación y las enfermedades neurodegenerativas. El uso de la microglía, células inmunitarias residentes del cerebro, como biosensor sustituto proporciona una nueva visión de cómo las respuestas inflamatorias median las agresiones neuronales. Aquí, utilizamos una línea celular microglial murina inmortalizada, designada BV2, y describimos un método para la exposición a nanopartículas utilizando nanopartículas de plata (AgNPs) como estándar. Describimos cómo exponer la microglía a las nanopartículas, cómo eliminar las nanopartículas del sobrenadante y cómo usar el sobrenadante de la microglía activada para determinar la toxicidad, utilizando la supervivencia de las células hipotalámicas como medida. Tras la exposición a AgNP, la activación de la microglía BV2 se validó mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El sobrenadante se filtró para eliminar el AgNP y permitir que las citocinas y otros factores secretados permanecieran en el medio condicionado. A continuación, las células hipotalámicas se expusieron al sobrenadante de la microglía activada por AgNP y se determinó la supervivencia de las neuronas mediante un ensayo fluorescente basado en resazurina. Esta técnica es útil para utilizar la microglía como biomarcador sustituto de la neuroinflamación y determinar el efecto de la neuroinflamación en otros tipos de células.

Introducción

Contaminaciones ambientales, específicamente los de la gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diámetro), se han relacionado con la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas debido a la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica ^1-3. Una elevada exposición a la contaminación puede inducir inflamación en el sistema nervioso central, incluyendo el hipotálamo ^1. Un mecanismo potencial en la que esto ocurre podría ser a través de nanopartículas inducida por la activación de la microglía (células inmunes del cerebro) ^4. Estudios anteriores han utilizado en modelos in vivo para estudiar los efectos de los PN en la salud del cerebro, que consumen mucho tiempo, es caro, y no responder directamente a la pregunta de cómo influyen los PN microglia. La microglía jugar un papel de múltiples facetas en el sistema nervioso central, incluyendo el mantenimiento del microambiente del cerebro y la comunicación con neuronas circundantes a través de la liberación de factores secretados y citoquinas. Dependiendo de los estímulos, microglia se puede activar para un pr M1o-inflamatoria o un estado anti-inflamatoria M2. Por ejemplo, M1 activa microglia liberan citocinas pro-inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), mientras que M2 activa citocinas antiinflamatorias de liberación microglia incluyendo la interleucina-4 (IL-4). Para validar nuestro sustituto en biosensor vitro para determinar la neurotoxicidad de los contaminantes del aire, que mide la respuesta microglial a 20 nm (nanopartículas de plata AGNPS). El objetivo de este artículo es describir cómo una línea de células de la microglia in vitro puede ser utilizado como un marcador sustituto biosensor para probar la respuesta de la microglia murino de PN y cómo la activación microglial afecta a las células del hipotálamo. El largo plazo destinado aplicación de este modelo validado es poner a prueba los efectos de los contaminantes del mundo real sobre la salud del cerebro y las enfermedades neurodegenerativas. Proporcionamos una descripción detallada de un ensayo de formato in vitro de 96 pocillos para medir la activación microglial y la supervivencia celular hipotalámica siguiente a la exposición de mic roglial medios condicionados.

la activación microglial se determinó después de la exposición AgNP utilizando una enzima TNF-α ensayo inmunoenzimático (ELISA). Para determinar el efecto de la microglia activada en las células del hipotálamo, los AGNPS fueron retirados de sobrenadante microglial (medio acondicionado) usando un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración retiene las citoquinas, excluyendo los AGNPS en función del tamaño. Brevemente, se recogió el sobrenadante de microglia tratados con o sin AGNPS, se añadió a los filtros, y se centrifugó a 14.000 xg durante 15 min. Estábamos entonces capaz de determinar la influencia de las citocinas secretadas microgliales sobre la viabilidad celular hipotalámica. Se determinó la toxicidad de la célula después de la exposición a medio acondicionado (que contienen citoquinas) por medio de un ensayo basado en la resazurina como se describió previamente ^5,6. Las células metabólicamente activas reducen la resazurina y producen una señal fluorescente proporcional al número de células viables ^7.

nt "> Hay varias ventajas de la utilización de esta técnica sobre los demás (como co-cultivo, las configuraciones trans pocillos, o en experimentos in vivo). Nuestro modelo ofrece la posibilidad de activar directamente la microglía y determinar si los factores secretados son tóxicos para las neuronas ⁸ . El protocolo actual utiliza inmortalizado microglia BV2 estimulado con nanopartículas de 20 nm de diámetro, e inmortalizó células hipotalámicas murinos (designado mHypo-A1 / 2) ⁹ para la determinación de la respuesta posterior. Si bien este protocolo ha sido optimizado para estas condiciones específicas, los métodos puede ser modificadas para ser utilizadas en otros modelos de muerte celular microglial inducida, o con otros tipos de células incluyendo microglia primaria y las neuronas.

Protocolo

1. Microglial Mantenimiento de Cultivos Celulares

1. medio de cultivo celular caliente (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
2. Obtener material congelado de las células microgliales BV2 en el paso 18 - 25 de almacenamiento a -80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua.
3. Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm ² que contiene medios de cultivo 10 ml de células.
4. Incubar frasco en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Se cultivan las células hasta aproximadamente el 70 - 80% de confluencia.

2. Contar las células y que platean

1. En un baño de agua a 37 ° C, DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA.
2. Aspirar los medios de las células y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min.
3. El uso de un raspador, eliminar las células del matraz y suspender en 5 mlde DMEM. Pasar las células a través de un filtro de 70 micras en un tubo de 50 ml tres veces.
4. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y semilla de 8.000 células / pocillo en una placa de fondo negro amuralladas claro en un volumen final de 200 l DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN. Incubar la placa en 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 horas.
5. Eliminar las viejas DMEM y reemplazar con 200 l de DMEM calentado suplementado con 1% de PSN a suero de hambre microglia. Incubar la placa en 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 horas.

3. Activación de microglía

1. En tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) y el vehículo / control neutro (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero suplementado con 1% de PSN a concentraciones de trabajo finales.
2. Eliminar 100 l de los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con 100 l de compuesto de tratamiento apropiado.
3. Incubar la placa en 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 horas.

4. Filtrado medio condicionado

1. Recoger 200 l de sobrenadante de medios de cada pocillo y transferir a un filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) con el tubo de recogida (1,5 a 2 ml de capacidad).
2. Centrifugar a 14.000 xg a temperatura ambiente durante 15 min.
3. Desechar el flujo continuo (sobrenadante con partículas) y colocar el filtro al revés en un nuevo tubo de recogida.
4. Centrifugar a 1000 xg a temperatura ambiente durante 2 min.
   NOTA: Los medios de comunicación filtrada resultante (que contiene citoquinas secretadas) se concentra por seis veces.
5. Llevar el volumen del concentrado a 400 l con DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y almacenar en hielo.
   NOTA: Para garantizar AGNPS residuales se eliminan de los medios de comunicación filtradas, se genera una concentración AgNP basado en el pico característico en alrededor de 390 - 420 nm ^10. Brevemente, se preparan alícuotas de AGNPS sin filtrar (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, y 0,2 g / ml como se describe en el paso 3.1) y se filtrócontrol de vehículo (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero. Alícuota de 50 l de muestras y patrones filtró en un negro amuralladas placa de fondo claro. El uso de un espectrofotómetro, medir la absorbancia a 390 - 410 nm y comparar las lecturas de la curva de concentración AgNP. Si muestras filtradas tienen el mismo valor de la absorbancia como la muestra de control del vehículo, se puede suponer AGNPS residuales se eliminan.
6. Usar medio de los medios filtrados para determinar siguientes instrucciones de secreción de TNF-α a partir de un kit disponible en el mercado.

5. hipotalámico Mantenimiento de Cultivos Celulares

1. medio de cultivo celular caliente DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN a 37 ° C.
2. Obtener material congelado de células del hipotálamo en el paso 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 almacenados a 80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua.
3. Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm ² que contiene medios de cultivo 10 ml de células.
4. Incubar matraz en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Se cultivan las células hasta que aproximadamente a 70 - 80% de confluencia.

6. Determinación de la toxicidad celular hipotalámica

1. DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
2. Aspirar los medios de comunicación a partir de células hipotalámicas y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min. Extraer células del matraz utilizando un raspador como se describe anteriormente en el paso 2.
3. Recuento de células utilizando un hemocitómetro y la placa células hipotalámicas a 5.000 células / pocillo en un negro amuralladas placa de fondo claro en un volumen final de DMEM 200 l suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y se incuba durante la noche en 5% de _CO2 a 37 ° C .
4. Eliminar 100 l de viejos medios utilizando un pipeteador multicanal y añadir 100 l de medio acondicionado concentrado se filtraron, a una concentración final de 1x.
5. Incubar la placa en 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 24 horas.
6. Añadir 221; l de reactivo de resazurina y se incuba la placa durante 20 minutos en 5% de CO ₂ a 37 ° C.
7. El uso de un espectrofotómetro multimodo, ficha fluorescencia (560 nm EX / EM 590 nm) para medir la viabilidad celular. Informar de los resultados como unidades de fluorescencia relativa (RFU).

Resultados

Se demuestra que la función de microglia como un biosensor sustituto de la respuesta del cerebro a las nanopartículas utilizando el protocolo anterior. Nuestros resultados incluyen la medición de los efectos tóxicos de la activación microglial en la muerte celular neuronal aguas abajo. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo del protocolo para activar microglia y determinar si las citoquinas secretadas reducen la viabilidad de las neuronas hipotalámicas. La secreción de ...

Discusión

Estudios recientes respaldan que la exposición ambiental contribuye a la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas ^11,12. Sin embargo, las técnicas utilizadas en estudios anteriores consumen mucho tiempo y son costosas. Las consideraciones económicas, los sistemas de administración fisiológicamente relevantes, los problemas éticos con el uso extensivo de modelos animales in vivo y la dificultad para traducir los hallazgos en avisos de salud significativos son algunos de los principales desafíos...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
/ Reactivos< / Línea celular >microglial de
	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium	Invitrogen	10313-039
Suero fetal bovino	PAA Labs	A15-751
Penicilina/Estreptomicina/Neomicina	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Nanopartículas de plata (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Reactivo de viabilidad celular	Invitrogen	A13262
Ratón TNF- y alfa; ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolisacárido	Sigma-Aldrich	L4391
Citrato de sodio	Sigma-Aldrich	S4641
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
96 W Placa inferior óptica, poliestireno negro, tratamiento con cultivo celular, con tapa, estéril	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Microplaca multimodo	Molecular Devices	M5
Falcon 50 ml Tubos	Corning, Inc	14-432-22
Coladores de células de halcón 70 μ m	Corning, Inc	08-771-2
Centrífuga de sobremesa 5430	Eppendorf	22620560