Microglia como una biosensor sustituto para determinar la neurotoxicidad de nanopartículas

Resumen

Microglia (células inmunitarias del cerebro), se utilizan como biosensor sustituto para determinar cómo influyen las nanopartículas en la neurotoxicidad. Describimos una serie de experimentos diseñados para analizar la respuesta de la microglía a las nanopartículas y la exposición de las neuronas hipotalámicas al sobrenadante de la microglía activada para determinar la neurotoxicidad.

Resumen

Las nanopartículas que se encuentran en los contaminantes del aire pueden alterar los perfiles de los neurotransmisores, aumentar la neuroinflamación y alterar la función cerebral. Por lo tanto, el ensayo descrito aquí ayudará a dilucidar el papel de la microglía en la neuroinflamación y las enfermedades neurodegenerativas. El uso de la microglía, células inmunitarias residentes del cerebro, como biosensor sustituto proporciona una nueva visión de cómo las respuestas inflamatorias median las agresiones neuronales. Aquí, utilizamos una línea celular microglial murina inmortalizada, designada BV2, y describimos un método para la exposición a nanopartículas utilizando nanopartículas de plata (AgNPs) como estándar. Describimos cómo exponer la microglía a las nanopartículas, cómo eliminar las nanopartículas del sobrenadante y cómo usar el sobrenadante de la microglía activada para determinar la toxicidad, utilizando la supervivencia de las células hipotalámicas como medida. Tras la exposición a AgNP, la activación de la microglía BV2 se validó mediante un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). El sobrenadante se filtró para eliminar el AgNP y permitir que las citocinas y otros factores secretados permanecieran en el medio condicionado. A continuación, las células hipotalámicas se expusieron al sobrenadante de la microglía activada por AgNP y se determinó la supervivencia de las neuronas mediante un ensayo fluorescente basado en resazurina. Esta técnica es útil para utilizar la microglía como biomarcador sustituto de la neuroinflamación y determinar el efecto de la neuroinflamación en otros tipos de células.

Introducción

Contaminaciones ambientales, específicamente los de la gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diámetro), se han relacionado con la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas debido a la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica ^1-3. Una elevada exposición a la contaminación puede inducir inflamación en el sistema nervioso central, incluyendo el hipotálamo ^1. Un mecanismo potencial en la que esto ocurre podría ser a través de nanopartículas inducida por la activación de la microglía (células inmunes del cerebro) ^4. Estudios anteriores han utilizado en modelos in vivo para estudiar los efectos de los PN ....

Protocolo

1. Microglial Mantenimiento de Cultivos Celulares

1. medio de cultivo celular caliente (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
2. Obtener material congelado de las células microgliales BV2 en el paso 18 - 25 de almacenamiento a -80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua.
3. Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm ² que contiene medios de cultivo 10 ml de células.
4. Incubar frasco en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24....

Resultados

Se demuestra que la función de microglia como un biosensor sustituto de la respuesta del cerebro a las nanopartículas utilizando el protocolo anterior. Nuestros resultados incluyen la medición de los efectos tóxicos de la activación microglial en la muerte celular neuronal aguas abajo. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo del protocolo para activar microglia y determinar si las citoquinas secretadas reducen la viabilidad de las neuronas hipotalámicas. La secreción de .......

Discusión

Estudios recientes respaldan que la exposición ambiental contribuye a la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas ^11,12. Sin embargo, las técnicas utilizadas en estudios anteriores consumen mucho tiempo y son costosas. Las consideraciones económicas, los sistemas de administración fisiológicamente relevantes, los problemas éticos con el uso extensivo de modelos animales in vivo y la dificultad para traducir los hallazgos en avisos de salud significativos son algunos de los principales desafíos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
/ Reactivos< / Línea celular >microglial de
	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium	Invitrogen	10313-039
Suero fetal bovino	PAA Labs	A15-751
Penicilina/Estreptomicina/Neomicina	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Nanopartículas de plata (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
PrestoBlue Reactivo de viabilidad celular	Invitrogen	A13262
Ratón TNF- y alfa; ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolisacárido	Sigma-Aldrich	L4391
Citrato de sodio	Sigma-Aldrich	S4641
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
96 W Placa inferior óptica, poliestireno negro, tratamiento con cultivo celular, con tapa, estéril	Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Microplaca multimodo	Molecular Devices	M5
Falcon 50 ml Tubos	Corning, Inc	14-432-22
Coladores de células de halcón 70 μ m	Corning, Inc	08-771-2
Centrífuga de sobremesa 5430	Eppendorf	22620560

ratón fuerte (BV2)Colección de líneas celulares entre laboratorios (Génova, Italia)ATL03001 Línea celular de hipotálamo de ratón adulto mHypoA-1/2  Centrífuga cónica