Los estudios de la morfogénesis neuronal utilizando Drosophila arborización dendrítica larval (DA) se benefician de las neuronas en la visualización in situ de las proteínas neuronales y epidérmicas por inmunofluorescencia. Se describe un procedimiento que mejora el análisis de inmunofluorescencia de DA neuronas y las células epidérmicas que rodean mediante la eliminación de tejido muscular de la pared del cuerpo de la larva.
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Resumen
Resumen
Arborización dendrítica (DA), las neuronas de larvas de Drosophila son un modelo popular para la investigación de los mecanismos de morfogénesis neuronal. Da neuronas desarrollan en comunicación con las células epidérmicas que inervan y por tanto su análisis de beneficios de la visualización in situ de las dos proteínas expresadas neuronalmente y epidérmicamente por inmunofluorescencia. Los métodos tradicionales de preparación de filetes de larvas para experimentos de inmunofluorescencia dejan intacto el tejido muscular que cubre la mayor parte de la pared del cuerpo, que presenta varios desafíos para la formación de imágenes proteínas neuronales y epidérmicas. Aquí se describe un método para eliminar el tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo permite que las imágenes de las proteínas que se oscurece de otra manera por el tejido muscular, mejora la relación señal a ruido, y facilita el uso de super-resolución microscopía para estudiar da el desarrollo de la neurona.
Introducción
Arborización dendrítica (da), las neuronas de larvas de Drosophila proporcionan un modelo valioso para el estudio del desarrollo neuronal debido a su susceptibilidad a la manipulación genética y la facilidad con la que pueden obtenerse imágenes. Estas neuronas sensoriales han sido instrumentales en la identificación de numerosas vías que controlan la morfogénesis de dendritas 1-3.
Cuatro clases de neuronas DA (clase I - IV) inervar la epidermis de las larvas. Estas neuronas se encuentran entre la membrana basal y la epidermis, con sus dendritas formando matrices en gran medida de dos dimensiones 4,5. De las ....
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Protocolo
Nota: El procedimiento para la eliminación de músculo (Figura 1) es una modificación de los métodos descritos anteriormente para la preparación de filetes de larvas. Los pasos que preceden y siguen a la eliminación del músculo se describen brevemente y se remite al lector a los trabajos previos 10, 11 para una descripción más detallada.
1. Dissect Larva en solución salina fría
- Preparar una dilución de trabajo de solución salina fría HL3.1 15 o Ca 2 + libre frío HL3.1 solución salina 11 (Tabla 1). Coloque la larva en una placa de elastómero de silicona....
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Resultados
Se demuestra la utilidad del procedimiento de extracción muscular para mejorar la relación señal a ruido en los experimentos de inmunofluorescencia para co-visualizar las proteínas de unión tabicado Coracle (Cora) y discos de gran (DLG), junto con la clase IV neuronas DA, marcadas con el marcador de membrana CD4 tdTomato.
Cora se ha utilizado anteriormente para identificar áreas de muestreo donde da las dendritas de las neuronas están rodeados por células de .......
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Discusión
Aquí un protocolo se describe para la extracción manual de tejido muscular de Drosophila filetes de larvas. Este protocolo descrito previamente modifica la técnica de disección de las larvas 10,11. Después de la larva se diseca en una placa de elastómero de silicona, la línea media dorsal se encuentra. Una sola pinzas de punta, en su orientación más plana posible, se inserta cuidadosamente entre el tejido muscular y la epidermis, cerca de la línea media dorsal. El fórceps se tira suavemente hacia arr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Gary Laevsky útil para los debates sobre la microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH subvenciones R01GM061107 y R01GM067758 a ERG
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pinzas Dumont #5 | Micro Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Tijeras, 8 cm, rectas, hojas de 5 mm, puntas de 0,1 mm | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 kit de elastómero de silicona | Dow Corning | 3097358-1004 | para placas de disección Pasadores |
| insectos Austerlitz, 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fuente de luz Fostec 8375 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopía | ||
| Vectashield medio de montaje antidecoloración | Vector Laboratories | H-1000 | para microscopía confocal |
| Prolong Diamond montador antidecoloración | Life Technologies | P36970 | para microscopía de iluminación estructurada |
| Micro cubreobjetos, 22 x 22 mm, n.º 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Anticuerpo anti-Coracle para ratones | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | C615.16 | sobrenadante, diluido 1:50 |
| Anti-Discos de ratón anticuerpo grande | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | 4F3 | sobrenadante, diluido 1:50 |
| Conejo anti-dsRed anticuerpo | Clontech | 632496 | diluido 1:1.000 |
| Anticuerpo anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568 conjugado | ThermoFisher Scientific | A-11011 | diluido 1:1.000 |
| Anticuerpo anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 488 conjugado | ThermoFisher Scientific | A-11001 | diluido 1:500 |
Referencias
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
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