El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

Annika Weigand; Justus P. Beier; Andreas Arkudas; Majida Al-Abboodi; Elias Polykandriotis; Raymund E. Horch; Anja M. Boos

doi:10.3791/54676

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

12.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54676

⸱

2 de noviembre de 2016

Annika Weigand¹ , Justus P. Beier¹ , Andreas Arkudas¹ , Majida Al-Abboodi¹^,² , Elias Polykandriotis³ , Raymund E. Horch¹ , Anja M. Boos¹

¹Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), ²Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, ³Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

En este artículo

Resumen

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

Resumen

Una red funcional de vasos sanguíneos es un requisito previo para la supervivencia y el crecimiento de casi todos los tejidos y órganos del cuerpo humano. Además, en situaciones patológicas como el cáncer, la vascularización juega un papel principal en la progresión de la enfermedad. En consecuencia, existe una gran necesidad de un modelo in vivo estandarizado y bien caracterizado para dilucidar los mecanismos de la neovascularización y desarrollar diferentes enfoques de vascularización para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

Describimos un enfoque microquirúrgico para un modelo animal pequeño para la inducción de un eje vascular que consiste en una vena y una arteria que se anastomosan a un asa arteriovenosa (AV). El asa AV se transfiere a una cámara de implantación cerrada para crear un microambiente aislado in vivo, que está conectado al organismo vivo solo por medio del eje vascular. Mediante el uso de imágenes 3D (resonancia magnética, microtomografía computarizada) e inmunohistología, la vasculatura en crecimiento se puede visualizar con el tiempo. Mediante la implantación de diferentes células, factores de crecimiento y matrices, su función en la formación de redes de vasos sanguíneos se puede analizar sin ninguna influencia perturbadora del entorno en un entorno bien controlable.

Además de los estudios de angiogénesis y antiangiogénesis, el modelo de bucle AV también es perfectamente adecuado para la ingeniería de tejidos vascularizados. Después de un cierto tiempo de prevascularización, los tejidos generados pueden trasplantarse al sitio del defecto y conectarse microquirúrgicamente a los vasos locales, asegurando así el suministro inmediato de sangre y la integración del tejido diseñado. Al variar las matrices, las células, los factores de crecimiento y la arquitectura de la cámara, es posible generar varios tejidos, que luego se pueden adaptar a las necesidades individuales del paciente.

Introducción

La mayoría de los tejidos y órganos del cuerpo humano dependen de una red de vasos sanguíneos funcionales que suministra nutrientes, intercambia los gases y elimina los productos de desecho. Mal funcionamiento de este sistema debido a los problemas vasculares locales o sistémicos puede conducir a una multitud de enfermedades graves. Por otra parte, en las áreas de investigación, como la ingeniería de tejidos o la medicina regenerativa, una red de vasos sanguíneos funcionales dentro de los tejidos generados artificialmente u órganos trasplantados es indispensable para el éxito de la aplicación clínica.

Durante décadas los investigadores han estado investigando los mecanismos exactos involucrados en la creciente vasculatura para ganar la penetración más profunda en situaciones patológicas con el fin de encontrar nuevas intervenciones terapéuticas y proporcionar una mejor prevención de trastornos vasculares. En el primer paso, los procesos básicos tales como las interacciones célula-célula o el efecto de moléculas sobre las células del sistema vascular son generalmente investigados por vitro en 2D o 3Dexperimentos. modelos 2D tradicionales son fáciles de realizar, están bien establecidos y han contribuido en gran medida a una mejor comprensión de estos procesos. Por primera vez en 1980, Folkman et al. reportado en la siembra de la angiogénesis in vitro de células endoteliales capilares en placas revestidas de gelatina ^1. Esto inmediatamente dio lugar a la publicación de una multitud de otros experimentos de angiogénesis 2D en tubo de ensayo de células endoteliales formación ^2, ensayo de migración de ³ y el co-cultivo de diferentes tipos de células ^4, así como otros. Estos ensayos se siguen utilizando hoy en día y se aceptan como estándar en métodos in vitro.

Sin embargo, esta configuración experimental no siempre es adecuada para el estudio del comportamiento de células in vivo ya que la mayoría tipos de células requieren un entorno 3D para formar estructuras de tejidos fisiológicos relevantes ^5. Se pudo demostrar que la arquitectura de la matriz 3D es decisivo para morphogenesi capilars ⁶ y que las interacciones célula-matriz celular adicional (ECM) y la cultura 3D condiciones regulan factores importantes que intervienen en la angiogénesis tumoral ^7. La matriz 3D proporciona entradas mecánicas complejas, pueden unirse a las proteínas efectoras y establecer gradientes de concentración de solutos tejido escala. Por otra parte, se considera necesario con el fin de imitar en morfogenética vivo y pasos de remodelación de tejidos complejos ^5. En estos sistemas, tanto la angiogénesis como la vasculogénesis puede ser estudiado. Mientras que la angiogénesis se describe el surgimiento de capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes ^8, vasculogénesis se refiere a la formación de novo de vasos sanguíneos a través de células endoteliales o sus progenitores ^9,10. La maduración de los vasos se describe en un proceso llamado "arteriogénesis" a través de reclutamiento de células de músculo liso ^11. Un angiogénico típico modelo in vitro es el surgimiento de células endoteliales de la monocapa existentes sembró como una monocapa en las superficies de gel, en la superficie de las microesferas incrustadas dentro de un gel o mediante la construcción de esferoides de células endoteliales ^12. En los modelos vasculogénicos células endoteliales individuales están atrapados en un gel 3D. Ellos interactúan con las células endoteliales adyacentes para formar estructuras y redes de novo vasculares, típicamente en combinación con células de apoyo ^12.

Sin embargo, incluso en 3D compleja en modelos in vitro no pueden imitar en entornos in vivo dado completamente la multitud de célula-célula y célula-ECM Interacciones de ^13. Las sustancias con alta actividad in vitro no muestran automáticamente los mismos efectos in vivo y viceversa ^14. Para un análisis exhaustivo de la vascularización procesa existe una necesidad urgente de desarrollar in vivo en modelos que simulan mejor la situación en el cuerpo. Una amplia gama de ensayos de angiogénesis in vivo se describen en la literatura, incluyendo elensayo polluelo corioalantoidea membrana (CAM), el modelo de pez cebra, el ensayo de angiogénesis de la córnea, el modelo de saco de aire dorsal, la cámara dorsal del pliegue cutáneo, los modelos de tumores subcutáneos ^14. Sin embargo, estos ensayos se asocian a menudo con limitaciones, tales como cambios morfológicos rápidos, problemas en nuevos capilares distintivas de las ya existentes en el ensayo de CAM, o el espacio limitado en el ensayo de angiogénesis de la córnea ^15. Además, se utilizan sistemas de no mamíferos (por ejemplo., El modelo de pez cebra ^16), que conduce a problemas en los xenotrasplantes ^17. En el modelo de tumor subcutáneo, la angiogénesis se origina sólo a partir del propio tumor no puede ser analizada desde el tejido adyacente contribuye en gran medida al proceso de vascularización. Por otra parte, el tejido circundante puede tener un papel decisivo en la formación del microambiente tumoral ^18.

No sólo para el estudio de la angiogénesis o vasculogénesis es que hay una fuerte need para una estandarizado y bien caracterizado modelo in vivo, sino también para el estudio de diferentes estrategias de vascularización en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. Hoy en día, la generación de órganos artificiales complejos o tejidos es posible tanto in vitro como in vivo. Bioprinting 3D proporciona una técnica de fabricación bajo demanda para la generación de complejo 3D tejidos vivos funcional ^19. Además, los biorreactores se pueden utilizar para la generación de tejidos ^{de 20} o incluso el propio cuerpo puede ser utilizado como biorreactor ^21. Sin embargo, el principal obstáculo para la aplicación exitosa de los tejidos generados artificialmente es la falta de vascularización dentro de las construcciones de ingeniería. Conexión inmediata a la vasculatura del huésped tras el trasplante es un requisito previo importante para la supervivencia, especialmente en el caso de tejidos u órganos artificiales de gran escala.

Diferentes estrategias in vitro o in vivo en prevascularization eran desadesa- para establecer una microvasculatura funcional en construcciones antes de la implantación ^22. La implantación de un andamio con in vitro capilares ingeniería preformadas sobre la piel dorsal de ratones condujo a una rápida anastomosis de la vasculatura ratones dentro de un día ^23. En contraste, un co-cultivo de esferoides que consiste en células madre mesenquimatosas humanas y células endoteliales de la vena umbilical humana reunidos en una red prevascular tridimensional desarrolló aún más después de la implantación in vivo. Sin embargo, la anastomosis con la vasculatura huésped se limitó ^24. Por encima de todo, en los defectos pobremente vascularizados, como las áreas necróticas o irradiados, esta llamada vascularización extrínseca - el crecimiento interno de los vasos de la zona circundante en el andamio - a menudo falla. Vascularización intrínseca, por el contrario, se basa en un eje vascular como fuente de nuevos capilares que brotan en el armazón ^25. Utilizando el enfoque de la vascularización axial, La ingeniería tisular puede ser trasplantado con su eje vasculares y conectado a los vasos locales en el sitio receptor. Inmediatamente después del trasplante, el tejido está adecuadamente soportada por el oxígeno y los nutrientes, lo que crea las condiciones adecuadas para la integración óptima.

Debido a la limitada disponibilidad de modelos para la investigación de la angiogénesis in vivo y en reconocimiento de la creciente importancia de generar tejido vascularizado axialmente, hemos desarrollado el enfoque microquirúrgico de Erol y Spira además para generar un bucle arteriovenosa (AV) en el modelo animal ^26. El uso de una cámara de implantación completamente cerrada hace que este método muy adecuado para estudiar la formación de los vasos sanguíneos debajo de "controlado", bien caracterizado en condiciones in vivo (Figura 1). Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también se adapta de forma óptima para la vascularización axial de los andamios de tejido Engininge- propósitos.