Method Article

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica En Vivo El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

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1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

Abstract

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Las microglías son los macrófagos residentes en los tejidos del sistema nervioso central (SNC) y realizan una variedad de funciones que apoyan la homeostasis del SNC, incluida la fagocitosis de sinapsis o células dañadas, desechos y/o patógenos invasores. El deterioro de la función fagocítica se ha implicado en la patogénesis de enfermedades como el Alzheimer y la degeneración macular relacionada con la edad, donde se acumulan placa de β amiloide y drusas, respectivamente. A pesar de su importancia, la fagocitosis microglial ha sido difícil de evaluar in vivo. Aquí, describimos una técnica simple, pero robusta, para monitorear y cuantificar con precisión el potencial fagocítico in vivo de la microglía de la retina. Los métodos anteriores se han basado en técnicas de tinción inmunohistoquímica y de diagnóstico por imágenes. Nuestro método utiliza la citometría de flujo para medir la absorción microglial de partículas marcadas con fluorescencia después de la administración intravítrea al ojo en roedores vivos. Este método sustituye a las prácticas convencionales que implican una laboriosa sección de tejido, inmunotinción e imágenes, lo que permite una cuantificación más precisa de la función fagocítica de la microglía en poco menos de seis horas. Este procedimiento también se puede adaptar para probar cómo varios compuestos alteran la fagocitosis microglial en entornos fisiológicos. Si bien esta técnica se desarrolló en el ojo, su uso no se limita a la investigación de la visión.

Introduction

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El objetivo general de este método consiste en evaluar y cuantificar la fagocitosis microglial vivo con precisión. La microglía son los macrófagos residentes tejido del sistema nervioso central (SNC). Se realizan una variedad de funciones para asegurar el mantenimiento de la homeostasis del tejido. Estos incluyen la vigilancia inmunológica, la secreción de factores neurotróficos y, de importancia fundamental, la fagocitosis 1. Fagocitosis microglial es clave en varios eventos importantes durante el desarrollo del cerebro y la retina, tales como fagocitosis de las sinapsis irrelevantes (poda sináptica) y la eliminación de las neuronas apoptóticas 2-4. Además, la fagocitosis microglial de las neuronas dañadas o apoptóticos, restos celulares, y los microbios invasores se ha demostrado ser esencial para el mantenimiento de la homeostasis del SNC a través de la edad adulta 5. Por último, la fagocitosis microglial ha sido implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y relacionados con la edaddegeneración macular, donde se ha sugerido que la capacidad de fagocitosis defectuosa o insuficiente puede contribuir a la acumulación de amiloide-beta placas (Aß) y drusas, respectivamente 6,7.

función Microglial está estrechamente regulada por su microentorno, en particular por factores solubles, tales como el factor de crecimiento del tumor interacciones célula-célula o β. Las neuronas expresan constitutivamente varios ligandos de la superficie celular, tales como CD200 y CX3CL1, mientras microglia exclusivamente expresan los respectivos receptores CD200R y CX3CR1. Estos receptores contienen inmunorreceptoras motivos de inhibición basado en tirosina (ITIM) en su porción intracelular. Estos inhibidor de los receptores son críticas para la prevención de la estimulación más de microglia, que puede contribuir a la neuroinflamación. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas normales, las interacciones célula-célula entre las neuronas y la microglia mantienen microglia en un estado de reposo. Durante la lesión tisular, sin embargo, las neuronas pueden regular a la baja expresión de estos ligandos, la eliminación de su efecto inhibidor sobre la activación de la microglia. Función microglial (incluyendo la fagocitosis) está por lo tanto estrechamente vinculada a su microambiente 8. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ensayos estandarizados para estudiar la fagocitosis microglia en un contexto fisiológico o de una manera que se replica completamente su microambiente del SNC.

Varios ensayos han sido desarrollados para medir la actividad fagocítica de microglia in vitro, donde microglia primarias o líneas de células de microglia se cultivan con las células diana (por ejemplo, neuronas apoptóticas) o perlas marcadas fluorescentemente. Captación objetivo es evaluada mediante microscopía de imágenes fluorescentes o citometría de flujo 9-12. Estos ensayos permiten realizar pruebas de cómo la manipulación farmacológica o genética puede afectar a la fagocitosis microglial y, mientras informativa, no logran replicar completamente el complejo entorno en vivo. Los métodos indirectos para el examen de la fagocitosis microglialin vivo se han reportado: estos se llevan a cabo por tinción de las moléculas se cree que participan en la fagocitosis (por ejemplo, CD68), la evaluación de la proximidad física de la microglía y los objetivos para la fagocitosis (por ejemplo, neuronas comprometidas o elementos sinápticas), o por detección inmunohistoquímica de fagocítica los objetivos dentro de las células microgliales (por ejemplo, Aß) 13-17. Dos estudios han utilizado métodos más directos para evaluar la fagocitosis microglia in vivo. Hughes y sus colegas han utilizado técnicas de imagen para determinar el consumo de microglial de cuentas entregadas por vía intracraneal 18. Sierra et al. Desarrolló un método perfeccionado para evaluar cuantitativamente la fagocitosis de las células apoptóticas microglia utilizando técnicas de imagen complejas 4. Sin embargo, estos métodos implican protocolos complicados para la preparación del tejido, seccionamiento, proyección de imagen, y el análisis. Hemos utilizado anteriormente análisis de citometría de flujo para evaluar la fagocitosis de los fotorreceptores a caboer segmentos de células de la retina epitelio pigmentario (RPE) en cultivo 19. A continuación, se describe un protocolo para evaluar rápidamente la captación de partículas marcadas con fluorescencia por la microglía de la retina como una medida cuantitativa de la fagocitosis in vivo microglia.

El protocolo se describe aquí permite una medición fiable y cuantitativa de la fagocitosis microglial de la retina en poco menos de seis horas en tres pasos fundamentales: (1) la entrega intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia, (2) la cosecha y preparación de tejido de la retina, y (3) el flujo de análisis de citometría. El método que hemos desarrollado es un método robusto para evaluar la fagocitosis microglial en la retina, y puede ser utilizado con éxito para probar cómo varios compuestos o manipulación genética alteran esta función microglial clave en la configuración fisiológicas. Como un área especializada del sistema nervioso central, la retina es un modelo de sistema de fácil acceso para estudiar la función de la microglia 20. Si bien este método fue desarrollado en tque ojo, creemos que puede ser útil para todos los neurólogos que investigan la función microglía fagocítica.

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Protocol

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Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas éticas establecidas por el Instituto de Investigación Scripps.

1. Preparación de Materiales para Inyección

  1. Esterilizar una aguja de 33 G y jeringa: desmontar y autoclave a 115 ο C. Preparar las agujas para la inyección por el aumento en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
  2. Descongelar las partículas marcadas con fluorescencia a temperatura ambiente durante 5 - 10 minutos a. Preparar la solución de partículas para la inyección mediante la reconstitución de una solución de 50 mg / ml en PBS estéril con Ca 2 + / Mg2 +.
    NOTA: partículas marcadas-AF488 de origen fúngico que han sido validados por ensayos de fagocitosis se utilizan en este protocolo 21-23. Para la absorción óptima, preparar partículas fresco e inmediatamente antes de la inyección.
    Nota 2: Partículas concentraciones pueden ser optimizados para cada experimento específico.

2. intravítrea La inyección de solución de bolas

NOTA: Dos pas personas se requieren para llevar a cabo la inyección, de tal manera que la persona que realiza la inyección puede contener el ratón y mantener el foco en el globo del ojo, mientras que la otra persona pasa la jeringa cargada y empuja el émbolo.

  1. Anestesiar el roedor por inyección intraperitoneal de 100 mg / ml de ketamina y 10 mg / ml de xilazina en una dosis de 20 l / 10 g de peso corporal. Antes de la inyección, utilice pizca dedo del pie para evaluar el nivel de anestesia.
    NOTA: El isoflurano tiene un profundo efecto en la función de las células mieloides, por lo tanto, su uso a lo largo de este ensayo debe evitarse 24,25.
  2. la aguja de carga con una solución de partículas 0,5 l de marcado con fluorescencia.
  3. Coloque el ratón hacia los lados bajo un microscopio quirúrgico (Figura 1A-B). Use un material blando, por ejemplo, un paquete de gel, para un mejor posicionamiento del ratón. Para los ratones jóvenes en la que los ojos no están abiertos, suavemente abrir los párpados con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo, creando un fissuvolver a lo largo de la ranura de la cual los párpados con el tiempo se abre.
    1. Con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo aplicar cuidadosamente la presión alrededor de los párpados, por lo que el globo ocular aparece un poco fuera de la cavidad. Mantenga la cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por su mandíbula y estirar suavemente la piel en paralelo a los párpados para mantener el ojo un poco fuera de la cavidad. Tenga cuidado de no comprender demasiado cerca de la garganta (Figura 1B).
  4. Para perforar el globo ocular, insertar la aguja de la jeringa en el limbo corneal (donde la córnea y la esclerótica Connect). Esto es visible como un círculo gris en ratones pigmentados. Retraer la aguja ligeramente para expulsar un pequeño volumen de fluido vítreo y luego inyectar. La persona que realiza la inyección debe coloque un lado del ratón con una mano y la aguja con la otra; la segunda persona debe empujar lentamente el émbolo.
  5. Retraer la jeringa lentamente. Aplicar gotas para los ojos hidratante para mantener el ojo hidratado.
  6. Deje que el roedor se recuperan en una jaula sobre una almohadilla de calor y continuar siguiendo al animal. Si se trabaja con cachorros, no devolver el animal a una jaula con otros animales de alerta hasta que está respirando y capaces de movimiento espontáneo. Si se trabaja con los adultos, no regrese al roedor a una jaula con otros animales de alerta hasta que recupera la posición decúbito esternal.

3. La recolección de tejido de la retina

NOTA: tejido de la retina de los ojos no inyectados con partículas marcadas con fluorescencia se debe recoger como un control para el análisis de citometría de flujo. Aunque el ensayo se puede realizar utilizando una única retina, para un mejor rendimiento, dos retinas, se mezclarán juntos.

  1. Recoger la retina del tejido 3 horas después de la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia.
    NOTA: Mientras que el tiempo después de la inyección de la solución de partículas se puede optimizar para cada experimento específico, se encontró que 3 h después de la inyección, la captación de partículas podría ser visto a lo largo de la mayoría de las capas of la retina (Figura 1C-D).
  2. Sacrificio ratones por dislocación cervical.
  3. Recoge los globos oculares presionando suavemente contra el párpado con la ayuda de unas pinzas finas 45 o en ángulo para proptose el globo ocular. Coloque la pinza detrás del globo ocular y de tracción.
  4. Diseccionar la retina bajo un microscopio de disección. Transferir el globo ocular a una placa de Petri que contiene una pequeña cantidad de PBS con Ca2 + / Mg2 +. En una zona seca de la placa de Petri, perforar el globo ocular en el limbo corneal con la punta del fórceps superfinas.
  5. Mantenga el globo ocular con la ayuda de finos 45 o fórceps en ángulo y el uso de tijeras de primavera para cortar alrededor del limbo corneal, hasta que se corta aproximadamente la mitad de la circunferencia del limbo corneal.
  6. Mantenga el globo ocular con los finos 45 o fórceps en ángulo y llevar el globo ocular en PBS. Con un segundo par de finas 45 o fórceps en ángulo rasgar la córnea y la esclerótica de diferencia. La lente y la retina va a salir intact.
  7. Separar la lente y la retina. Recoger la retina y transferir a un tubo de ensayo 5,4 ml de poliestireno que contiene 2 ml de PBS con Ca2 + / Mg2 +.

4. Preparación de una suspensión de células individuales

  1. Preparar suspensiones de células individuales utilizando un kit de disociación de tejido neuronal con modificaciones menores a las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, las retinas de triturado en la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 y realizar una digestión enzimática a 37 ° C sin agitación.

5. Tinción de suspensiones de células individuales para el análisis de citometría de flujo

  1. Resuspender las células en 200 l de tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con albúmina de suero bovino 0,2% (BSA) y azida sódica al 0,09%) y la transferencia a una placa de fondo en U de 96 pocillos. Centrifugar durante 5 min a 130 x g.
    NOTA: La azida sódica es nociva para el ser humano y el medio ambiente. Utilice equipo de protección personal unand desechar los residuos de acuerdo con las regulaciones locales.
  2. Invierta la placa sobre un fregadero para eliminar el sobrenadante. Para bloquear los receptores de Fc, Resuspender las células en 25 l de tampón de tinción que contiene 5 mg / ml de anticuerpo anti-ratón CD16 / CD32 por pocillo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  3. Añadir 25 l de tampón de tinción que contiene 0,5 mg / ml de anti-ratón de Ly6C-APC-Cy7, 0,5 mg / ml de anti-ratón Ly6G-Pe-Cy7 y 2,5 g / ml de anti-ratón CD11b-AF650. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
  4. Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Invertir la placa para eliminar el sobrenadante. Lavar volviendo a suspender las células en 200 l de tampón de tinción.
  5. Centrifugar durante 5 min a 130 x g. Resuspender en 200 l de tampón de tinción que contiene 0,5 g / ml de yoduro de propidio (PI). Transferir a tubos de microtitulación de 1,2 ml.
  6. Lavar los pocillos con un 100 l adicionales de tampón de tinción que contiene 0,5 g / ml de PI y la piscina con los 200 l anteriores en el1,2 ml tubos de microtitulación. Se obtiene un volumen total de 300 l de células teñidas.

6. Análisis de citometría de flujo

  1. El uso de un láser convencional de tres (violeta, azul, y el láser rojo), evitar el PE, PerCP-Cy5.5, BV510 y colorantes PI debido a la notable desvío de los extremadamente brillantes AF488-partículas fluorescentes. Utilice cuarto láser (amarillo) para optimizar este ensayo, ya que permite a los anticuerpos marcado con PE y PI (en el canal mCherry en lugar del canal de PerCP-Cy5.5) que se utilizará (Figura 2).
    NOTA: Si un láser de color amarillo no está disponible, utilice un tinte de exclusión de células muertas en otro canal.
  2. Puerta de PI células negativas (PI) para excluir las células muertas (Figura 2B).
  3. Después de excluir las células muertas, puerta de células positivas CD11b (CD11b +), esto incluirá todas las células mieloides (Figura 2C).
  4. Dentro de la población CD11b +, puerta de Ly6C - / Ly6G - para excluirneutrófilos (CD11b + / + Ly6G) y monocitos (CD11b + / + Ly6C; Figura 2D). Después se active en la microglía (aquí definida como CD11b + / Ly6C - / Ly6G - por simplicidad), dos poblaciones claras deben ser visibles; uno negativo y uno positivo para las partículas marcadas con fluorescencia. Las células fagocíticas se han tomado las partículas y por lo tanto son AF488 + (Figura 2E).
    NOTA: Ly6c positivo o Ly6G poblaciones positivas también puede ser analizado para medir la absorción de partículas usando este enfoque de tinción. El porcentaje de células fagocíticas CD11b + se correlaciona bien con el porcentaje de microglia fagocítica (Figura 2F). Para los investigadores sin experiencia citometría de flujo, un análisis más simple con CD11b tinción solo puede llevarse a cabo, aunque esto incluirá los neutrófilos y monocitos fagocíticas, así como microglia. Dentro de este CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ Sup> población, estas células son> 99% microglia, a juzgar por la tinción con los marcadores de F4 / 80 y CX3CR1; estos marcadores se pueden añadir, pero no son necesarios en nuestras manos.

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Results

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Aquí se describe un método para cuantificar rápidamente y de manera fiable el número de microglia retina fagocíticas en un entorno fisiológico utilizando el análisis de citometría de flujo (Figura 2). Este método puede adaptarse para probar el efecto de compuestos y / o la manipulación genética de la capacidad fagocítica de microglia (Figuras 3A, 3B). También se puede utilizar en los jóvenes (10 - 20 días postnatal) o ratones adultos (Fi...

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Discussion

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Hay tres pasos críticos en este método: (1) la inyección intravítrea de partículas marcadas con fluorescencia; (2) la recolección y preparación de tejido de la retina; y (3) análisis citométrico de flujo. Recomendamos que los investigadores practican inyecciones intravítreas antes de realizar el método que aquí presentamos. Ratones albinos (por ejemplo, BALB / c) y una solución de color (por ejemplo, partículas marcadas con fluorescencia) pueden ser utilizados para una fácil visualización de la aguja y...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Salome Murinello cuenta con el apoyo de la subvención #1-16-PDF-072 de la Asociación Americana de Diabetes. Este trabajo fue apoyado por subvenciones a Martin Friedlander de los Institutos Nacionales de Salud (National Eye Institute EY11254 y EY22025) y el Instituto de Investigación Médica Lowy.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopio estereoscópicoNikonDescontinuado
Hamilton   jeringa, serie 600Sigma26702
calibre 33, cubo pequeño RN NDL, 0,5 pulg., estilo de punta 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) Biopartículas, Alexa Fluor 488 conjugadoThermoFisher ScientificZ-23373Prepárese inmediatamente antes
de la inyección Pinzas DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45Fine Science Tools11251-35Necesita dos
pinzas de #5SF DumontFine Science Tools11252-00
Tijeras de resorte Vannas - 3 mm de filo FineScience Tools15000-10Kit
disociación de tejido neural curvo – Neuronas PostnatalesMiltenyi Biotec130-094-802
5 ml Poliestireno Tubo de fondo redondoFalcon352054
96 pocillos Placa inferior en UFalcon
tampón de manchas (BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 Anticuerpo BioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
Yoduro de propidioBD Biosciences556463
Anticuerpo anti-ratón CD16/32 purificadoBioLegend101301
de 353077 128025

References

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