Herramientas para estudiar el papel de la proteína HMGB1 arquitectónico en el procesamiento de la hélice causante de distorsión, de ADN específica de sitio enlaces cruzados

Resumen

El daño dirigido al ADN se puede lograr atando un agente dañino para el ADN a un oligonucleótido formador de triplex (TFO). Mediante el uso de TFO modificados, la asociación de proteínas específicas del daño del ADN y la modificación de la topología del ADN se pueden estudiar en células humanas mediante la utilización de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina modificada y ensayos de superenrollamiento del ADN descritos en este documento.

Resumen

cuadro de grupo de alta movilidad 1 proteína (HMGB1) es una proteína de arquitectura no histonas que está implicado en la regulación de muchas funciones importantes en el genoma, tales como la transcripción, la replicación del ADN, y la reparación del ADN. HMGB1 se une al ADN estructuralmente distorsionado con mayor afinidad que a B-DNA canónica. Por ejemplo, se encontró que la HMGB1 se une al ADN enlaces cruzados (ICL), que enlazan covalentemente las dos hebras del ADN, provocar una distorsión de la hélice, y si se deja sin reparar puede causar la muerte celular. Debido a su potencial citotóxico, varios agentes inductores de ICL se utilizan actualmente como agentes quimioterapéuticos en la clínica. Mientras que los agentes formadores de ICL muestran preferencias por determinadas secuencias de bases (por ejemplo, 5'-TA-3 'es el sitio preferido para la reticulación de psoraleno), inducen daños en el ADN en gran medida de forma indiscriminada. Sin embargo, acoplando covalentemente el agente ICL-inducir a un oligonucleótido formador de triplex-(TFO), que se une al ADN en una secuencia específicamanera, el daño del ADN objetivo se puede lograr. Aquí, nosotros usamos una TFO conjugado covalentemente en 'extremo a un 4'-hidroximetil-4,5 '5 el psoraleno trimetilpsoraleno-8, (HMT) para generar una ICL específica de sitio en un plásmido reportero mutación para su uso como una herramienta de para estudiar la modificación de arquitectura, el procesamiento, y la reparación de las lesiones del ADN complejos por HMGB1 en las células humanas. Se describen las técnicas experimentales para preparar ICL dirigidas-TFO en plásmidos informadores, y para interrogar a la asociación de HMGB1 con los dirigidos ICL-TFO en un contexto celular utilizando ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Además, se describen ensayos de superenrollamiento del ADN para evaluar la modificación de arquitectura específica del ADN dañado mediante la medición de la cantidad de vueltas superhelical introducidas en el plásmido psoraleno reticulado por HMGB1. Estas técnicas se pueden utilizar para estudiar los papeles de otras proteínas implicadas en el procesamiento y la reparación de ICL dirigidas-TFO u otros daños en el ADN objetivo en cualquier línea celular de interés.

Introducción

Triplex de formación de oligonucleótidos (TFOs) de ADN se unen dúplex de una manera específica de secuencia a través de enlaces Hoogsteen-hidrógeno para formar estructuras de triple helicoidal ^1-5. Tecnología Triplex se ha utilizado para interrogar a una variedad de mecanismos biomoleculares, tales como la transcripción, daño en el DNA de reparación, y la orientación de genes (revisado en las referencias ^6-8). TFOs se han utilizado ampliamente para inducir daño de sitio específico en plásmidos informadores ^9,10. Nuestro laboratorio y otros han utilizado previamente un TFO, GA30, atado a una molécula de psoraleno para inducir reticulac....

Protocolo

1. Preparación de ICL dirigidas-TFO en el plásmido Sustratos

1. Incubar cantidades equimolares de plásmido pSupFG1 ^10,11 ADN (plásmido ADN 5 mg es un buen punto de partida) con psoraleno conjugado TFO GA30 en 8 l de tampón de unión triplex [glicerol al 50%, Tris 10 mM (pH 7,6), MgCl 10 mM _2] y dH ₂ O hasta un volumen final de 40 l en un tubo de color ámbar. Mezcle bien con la pipeta hacia arriba y hacia abajo. Incubar la reacción a 37 ° C baño de agua durante 12 hr.
2. Calentar la lámpara de rayos UVA para garantizar la máxima potencia de salida. Coloque la reacción triplex en la película de parafina, y colocar la lámin....

Resultados

La formación de la ICL dirigida TFO es crítico para los ensayos basados ​​en plásmidos, que se utilizan para interrogar a las funciones de las proteínas de arquitectura en el procesamiento de ICL en células humanas. Electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa es una manera fácil de determinar la eficacia de la formación ICL dirigida TFO. Los plásmidos que albergan ICL dirigidas-TFO migran con una movilidad más lenta a través de la matriz de gel de agarosa (Figura 1A,

Discusión

La formación eficiente de ICL dirigidas-TFO depende de dos factores cruciales: En primer lugar, los componentes del tampón adecuado (por ejemplo, MgCl ₂₎ y el tiempo de incubación de la TFO con su sustrato de ADN diana (depende de la afinidad de unión del TFO a su diana dúplex y las concentraciones se utiliza); y segundo, la dosis apropiada de UVA (365 nm) de irradiación para formar entrecruzamientos de psoraleno de manera eficiente. la formación de triplex óptimo se puede lograr mediante el uso de H.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Reactivo Certificado Co., Midland, TX	Pedido personalizado	HPLC (o gel) purificado
ChIP Kit de cromatina enzimática simple Cell	signaling Inc.	9003	El protocolo sugerido por el fabricante está optimizado para la cromatina IP y no para el plásmido IP. El fabricante suministra los anticuerpos IgG y H3 de control, así como las perlas de proteína G y la nucleasa microcócica.
GoTaq Green	Promega	M7122	Mezcla maestra de PCR
Anticuerpo HMGB1	Abcam	Ab18256
Wizard Gel y kit de limpieza de PCR	Promega	A9281
Sal de cloroquina-difosfato	Sigma	C6628-50G	Para electroforesis bidimensional en gel de agarosa
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
Reactivo de transfección GenePORTER	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerasa I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray lámpara ultravioleta de onda larga	Upland, CA	B 100 AP	Lámpara UVA
Bioprocesador multifuncional EpiSonic 1100 Epigentek		EQC-1100	Sonicador de baño de agua
Filtro Mylar	GE Healthcare Ciencias de la	vida
Agarosa	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	Sistema BIO-RAD	XRS+	Sistema de imágenes de ADN
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Utilizado para reticulación
Proteinasa K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Medios de cultivo celular
PBS	ThermoFisher	70013073	Cultivo celular
Tripsina-EDTA	ThermoFisher	25200056	Cultivo celular
Verde de bromocresol	Sigma-Aldrich	114-359	Colorante de carga de ADN
Tubos siliconados	Fisher Scientific	02-681-320 Tubo de	microfuga de baja retención
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
Ácido bórico	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fotómetro	BP24731
	InternationalLight Technologies	ILT1400-A Medición de	dosis de
UVALíneas celulares
Osteosarcoma humano U2OS	ATCC	ATCC HTB-96	Cultivado según el proveedor' s recomendación
Adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Cultivado según el proveedor' s recomendación Imprimación
proximal hacia adelante	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Imprimación inversa proximal	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Cebador distal hacia adelante	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Cebador inverso distal	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc