oclusión quirúrgica de una rama distal de la arteria cerebral media (MCAO) es un modelo frecuentemente usado en investigación del accidente cerebrovascular experimental. Este manuscrito describe la técnica básica de la MCAO permanente, combinado con la inserción de una ventana craneal lateral, que ofrece la oportunidad para microscopía intravital longitudinal en ratones.
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Artículo de método
Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa En Vivo Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Isquemia cerebral focal (es decir, accidente cerebrovascular isquémico) puede causar lesión cerebral importante, lo que lleva a una pérdida grave de la función neuronal y por lo tanto a un anfitrión de motor y discapacidades cognitivas. Su alta prevalencia supone una grave carga para la salud, como accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad a largo plazo y la muerte en todo el mundo 1. Recuperación de la función neuronal es, en la mayoría de los casos, sólo parcial. Hasta ahora, las opciones de tratamiento son muy limitadas, en particular, debido a la estrecha ventana de tiempo para la trombólisis 2,3. La determinación de métodos para acelerar la recuperación del accidente cerebrovascular sigue siendo un objetivo primordial médica; sin embargo, esto se ha visto obstaculizada por la insuficiencia de conocimientos mecánicos en el proceso de recuperación. investigadores ictus experimentales emplean con frecuencia modelos de roedores de isquemia cerebral focal. Más allá de la fase aguda, investigación del accidente cerebrovascular se centra cada vez más en la fase subaguda y crónica después de una isquemia cerebral. La mayoría de investigadores aplican ictus permanente o tranoclusión de la MCA sient en ratones o ratas. En los pacientes, las oclusiones de la MCA se encuentran entre las causas más frecuentes de accidente cerebrovascular isquémico 4. Además de la oclusión proximal de la MCA mediante el modelo de filamento, oclusión quirúrgica de la MCA distal es probablemente el modelo más utilizado en la investigación del accidente cerebrovascular experimental 5. La oclusión de una distal (a la ramificación de las arterias lenticulo-estriados) rama MCA normalmente detiene el cuerpo estriado y afecta principalmente a la neocorteza. oclusión de los vasos puede ser permanente o transitoria. Alta reproducibilidad del volumen de la lesión y muy bajas tasas de mortalidad con respecto a los resultados a largo plazo son las principales ventajas de este modelo. Aquí, demostramos cómo llevar a cabo una preparación lateral crónica ventana del cráneo (CW) al seno sagital, y después cómo quirúrgicamente inducir un accidente cerebrovascular distal debajo de la ventana usando un enfoque craneotomía. Este enfoque se puede aplicar para la imagen secuencial de los cambios agudos y crónicos después de la isquemia a través deepi-iluminación, láser confocal de barrido, y de dos fotones microscopía intravital.
Introducción
accidente cerebrovascular se encuentra entre las principales causas de discapacidad y muerte a largo plazo en todo el mundo1, ocupando el segundo lugar después de la enfermedad coronaria. Además, el accidente cerebrovascular es la principal causa de discapacidad a largo plazo, lo que subraya su tremendo impacto socioeconómico6-8. Más allá del tratamiento agudo, la investigación de nuevos enfoques y mecanismos para acelerar y mejorar la recuperación después de un accidente cerebrovascular sigue siendo un objetivo médico primordial7.
En las últimas décadas, los datos de la investigación experimental sobre el ictus han contribuido sustancialmente a la comprensión de las complejas cascadas fisiopatológicas desencadenadas por la isquemia9,10. La excitotoxicidad, la apoptosis, la despolarización periinfarto y la inflamación han sido identificadas como los mediadores más relevantes de la muerte celular tras la isquemia cerebral focal. Además, utilizando modelos animales de isquemia cerebral, se han desarrollado y validado conceptos importantes, modalidades diagnósticas y enfoques terapéuticos (por ejemplo, "penumbra" y trombólisis)11.
La disponibilidad de modelos experimentales de accidente cerebrovascular, combinados con modalidades de imagen no invasivas (por ejemplo, imágenes por resonancia magnética (RM), tomografía computarizada o análisis de contraste de moteado láser), permite al investigador investigar los cambios fisiopatológicos hiperagudos y crónicos inducidos por la agresión isquémica de manera longitudinal12. Junto con el estudio del perfil espacio-temporal de la lesión en evolución, se pueden investigar los cambios que se asemejan a la plasticidad neuronal y correlacionarlos con los resultados funcionales y los hallazgos histológicos. En los últimos años se han producido nuevos avances metodológicos utilizando la combinación de modelos de isquemia cerebral y microscopía in vivo mediante ventanas craneales13. Estas nuevas técnicas permiten a los investigadores analizar la unidad neurovascular a nivel celular y molecular, con gran poder analítico en las fases aguda, subaguda y crónica tras la isquemia cerebral focal14. Además, la microscopía in vivo de la dinámica microcirculatoria ha revelado nuevos aspectos de la función de la microvasculatura cerebral y la angioarquitectura, con una importante relevancia fisiopatológica15-17.
En este protocolo, presentamos cómo realizar una preparación de CW crónica lateral al seno sagital y cómo inducir quirúrgicamente un accidente cerebrovascular distal debajo de la ventana. Este modelo de ratón se puede aplicar a la obtención de imágenes secuenciales de cambios agudos, subagudos y crónicos después de la isquemia cerebral focal mediante epiiluminación, escaneo láser confocal y microscopía intravital de dos fotones.
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Protocolo
DECLARACIÓN DE ÉTICA: Los experimentos con seres animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín, Alemania (G0298 / 13) y los criterios llegar, según sea el caso. Para este estudio, de 10 a 12 semanas de edad, machos C57BL / 6J fueron utilizados.
1. lateral crónica craneal Ventana Preparación
- Realizar la anestesia con una inyección subcutánea de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Prueba para la sedación adecuada con un estímulo doloroso.
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y campo quirúrgico con 70% de etanol.
- Quitar el pelo del cuero cabelludo del cuello a los ojos usando una máquina de afeitar de roedores.
- Fijar la cabeza en un marco estereotáxico.
- Utilice dexpantenol pomada ocular en ambos ojos para evitar la deshidratación.
- Limpiar el área quirúrgica para eliminar todos los pelos y esterilizarlo con 3 capas de 74,1% de etanol y 10% de 2-propanolol.
- Realizar una línea mediaincisión desde el cuello hasta los ojos utilizando un bisturí.
- Abarcar el colgajo de piel con 4 puntos de sutura tenting.
- Retire cuidadosamente el periostio en el hemisferio izquierdo raspando con un escalpelo hasta el punto donde comienza el músculo temporal.
NOTA: Esta preparación también sirve para crear una buena zona de adhesión para que el pegamento dental, que fija la cubierta de vidrio. - Realizar una craneotomía fronto-parietal con un diámetro de 4 mm por el adelgazamiento del cráneo en el borde del colgajo óseo utilizando un microtaladro. Aplicar una solución salina durante la perforación para evitar lesiones por calor.
- Elevar el colgajo óseo con cánulas y quitarlo usando microforceps.
- Lávense cuidadosamente y extensamente con solución salina.
- Mezclar el pegamento dental hasta que tenga la consistencia adecuada y no es fluido (es decir, el pegamento no debe producir hilos más). Lo coloca en el hueso alrededor de la craneotomía.
- Coloque una cubierta de vidrio con un diámetro de 6 mm en la cola preparada y fijarlo con THe resto del pegamento dental. Asegúrese de que es a prueba de agua. Espere hasta que el pegamento se seca y dura probándola con fórceps.
NOTA: Un riego adicional acelera el proceso de curado. - Retire las suturas tenting y cerrar la herida con suturas de la piel.
- Tire hacia arriba de la piel del costado del ratón. Insertar una aguja por vía subcutánea y sustituir suavemente por vía subcutánea 0,5 ml de solución salina estéril para mantener el equilibrio de líquidos.
- Después de la cirugía, mantener a los animales en la jaula de recuperación se calienta durante 90 minutos. Espere hasta que los animales son completamente despierto antes de dejarlos sin vigilancia. Espere hasta que los animales se recuperaron por completo antes de devolverlos a una jaula con otros animales.
- Repetir la sustitución volumen de solución salina por vía subcutánea después de aproximadamente 12 horas, como se describe en el paso 1.16.
- Siempre aplique analgesia a través de sonda o directamente en la cavidad oral después de la cirugía (por ejemplo, paracetamol (10 mg / ml) u otros fármacos anti-inflamatorios no esteroideos).
- Comprobar el estado de los animales todos los días después de la cirugía, y siempre ofrecen puré de alimentos de origen animal en el suelo en una placa de Petri para que una alimentación sencilla y para evitar la pérdida de peso crítico después de la cirugía.
NOTA: La microscopía intravital se puede realizar en el primer día después de la preparación ventana del cráneo. - Aplicar la anestesia con isoflurano y fijar el animal en un soporte de cabeza. Abra la sutura de la piel y limpiar la ventana con bastoncillos de algodón y una solución salina estéril. Después de 24 horas, la ventana del cráneo debe estar lleno de líquido cefalorraquídeo por ese punto en el tiempo, lo que permite obtener imágenes. Realizar las imágenes mediante el uso de protocolos de microscopía establecidos 18.
2. distal MCAO
NOTA: El procedimiento MCAO debe realizarse aproximadamente 5 d después de la preparación de CW. Esto reduce al mínimo la interferencia de la reacción inmune causada por la preparación CW con la reacción inmune inducida por apoplejía.
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Figura 1. Visión general de la MCAO distal. A. Esta es una buena visión general sobre los vasos antes de la operación. B. Los vasos después del primer contacto bipolar. C. Los vasos después de la segunda contacto bipolar. D. La visión general acerca de los buques, que ahora están completamente cerrados. E. resumen final con menor aumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Anestesiar a los ratones usando una máscara de anestesia y un régimen anestésico apropiado, en consulta con el personal veterinario (por ejemplo, la inducción con 1,5 - 2%, isoflurano y mantenimiento con 1,0 - 1,5% isoflurano en 2/3 N 2 O y 1/3 O 2 a través un vaporizador).
- Afeitarse y quitar el pelo y la desinfección de la piel y el pelo que rodea con un agente apropiado (por ejemplo, el 70% de alcohol etílico), y secarlo después.
- Mantener la temperatura corporal de los ratones a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante la cirugía. Una almohadilla térmica controlada retroalimentación, calentado según la temperatura rectal del ratón, es muy recomendable.
- Colocar el animal en la posición lateral. Fijar la nariz de la máscara de anestesia y ajustar la concentración de isoflurano al 1,0 - 1,5%.
- Aplique un ungüento húmedo (dexpantenol) para ambos ojos.
- Utilice la incisión de la piel hecha para la preparación de CW.
- separar suavemente la piel e identificar el músculo temporal por debajo.
- Ajustar la energía del generador de alta frecuencia (5-7 W) y utilizar el modo bipolar.
- Utilice las pinzas de electrocoagulación y retirar con cuidado el músculo temporal del cráneo, la creación de un colgajo de músculo, sin eliminar totalmente el músculo.
- Identificar la MCA por debajo del cráneo transparente en la parte rostral del área temporal, dorsal a la retro-orbital sinusal. Si la bifurcación MCA no se puede identificar, tratar de identificar el buque más rostral.
- Delgada del cráneo por encima de la rama de MCA con un microtaladro mientras continua el riego para evitar el daño por calor.
- Levantar el hueso con cánulas y quitarlo con microforceps.
- Disminuir la energía del generador de alta frecuencia a 3-5 W.
- El enfoque de la arteria desde arriba y suavemente tocarlo con las pinzas bipolares en ambos lados sin levantar el vaso.
- Coagular la arteria proximal y distal a la bifurcación del vaso.
- Espere durante 30 segundos, y luego tocar la arteria suavemente para asegurar que el flujo sanguíneo se interrumpe de forma permanente. Repetir la electrocoagulación si se observa una recanalización.
- Fijar el músculo temporal con 1 o 2 puntos de sutura en la inserción del músculo para cubrir el defecto óseo, si es posible.
- Suturar la herida y colocar al animal en el cuadro de recuperación climatizada. En general, la recuperación de los animales rápidamente después anest volátileshesia.
- Para la sustitución de volumen, se aplican por vía subcutánea 0,5 ml de solución salina estéril, como se describe en el paso 1,16.
- Después de la cirugía, permitir que los animales permanecen en la jaula de recuperación se calienta durante 90 minutos. Espere hasta que los animales son conscientes antes de dejarlos sin vigilancia. Sólo devolverlos a una jaula con otros animales cuando están completamente recuperados.
- Repetir la sustitución de volumen, como se explica en el paso 1.16, después de 12 horas.
- Aplicar la analgesia postoperatoria través del agua potable (por ejemplo, paracetamol (10 mg / ml) u otros fármacos anti-inflamatorios no esteroideos).
- Compruebe el estado de salud de los animales todos los días después de la cirugía. Proporcionar alimentos animales puré en una placa de Petri en el suelo para simplificar el comer y para reducir al mínimo la pérdida de peso postoperatorio.
3. Tratamiento Sham
- Realizar todos los procedimientos de forma idéntica a los pasos 1 y 2 descritos anteriormente, incluyendo CW-preparación-excepto que no coagular el ar cerebral media expuestabatería.
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Resultados
La línea de tiempo y los resultados representativos se muestran en las figuras 2 y 3. La preparación de ventana del cráneo, con una pequeña ventana lateral craneal al seno sagital superior (Figura 2 B, C, D) se traduce en una tasa de mortalidad y morbilidad muy baja cuando se lleva a cabo por un cirujano experimentado. Todos los 10 animales sobrevivieron, y todos CW crónica se podría utilizar para obtener imágenes de alta calidad, inclus...
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Discusión
Accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad a largo plazo y la muerte en todo el mundo 1. Más allá de tratamiento agudo, la investigación de nuevos enfoques y mecanismos para acelerar y mejorar la recuperación después del accidente cerebrovascular sigue siendo un objetivo primordial médica 7. investigadores ictus experimentales emplean con frecuencia modelos de roedores de isquemia cerebral focal. De hecho, los modelos que inducen transitoria o permanente MCAO imitan ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
VP participa en el Programa de Científicos Clínicos Charité, financiado por la Charité - Universitätsmedizin Berlin y el Instituto de Salud de Berlín. TB es becario de movilidad postdoctoral de SNSF. Los autores reciben una beca de EinsteinStiftung/A-2012-153 para PV.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio quirúrgico binocular | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Fuente de luz para microscopio | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Almohadilla térmica con sonda rectal | FST | 21061-10 | |
| Marco estereotáctico | Kopf | Modelo 930 | |
| Sistema de anaethesia para isoflurano | Draeger | ||
| Isoflurano | Pinzas Abott | ||
| Dumont #5 | FST | 11251-10 | |
| Pinzas Dumont #7 | FST | 11271-30 | |
| Pinzas bipolares | Erbe | 20195-501 | |
| Pinzas bipolares | Erbe 20195-022 | ||
| Microdrill | FST 18000-17 | ||
| Portaagujas | FST | 12010-14 | |
| 5-0 sutura de seda | Feuerstein, Suprama | ||
| 7-0 sutura de seda | Feuerstein,Suprama | ||
| 8-0 sutura de seda | Feuerstein, Suprama | ||
| cámara de recuperación veterinaria | Peco Services | V1200 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
