Un modelo murino de Grupo B Streptococcus Colonización vaginal

Resumen

El objetivo de este protocolo es imitar grupo humano Streptococcus B (GBS) la colonización vaginal en un modelo murino. Este método se puede utilizar para investigar respuestas inmunes del huésped y factores bacterianos que contribuyen a la persistencia vaginal GBS, así como para poner a prueba estrategias terapéuticas.

Resumen

Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B, GBS), es un Gram-positivo, colonizador asintomática del tracto gastrointestinal humano y el tracto vaginal de 10 a 30% de los adultos. En individuos inmunocomprometidos, incluyendo los recién nacidos, mujeres embarazadas y ancianos, GBS puede cambiar a un patógeno invasivo que causa la sepsis, artritis, neumonía y meningitis. Debido a que el GBS es un patógeno bacteriano líder de los recién nacidos, la profilaxis actual se compone de detección final de la gestación para la colonización vaginal por EGB y el tratamiento con antibióticos periparto posterior de las madres GBS-positivas. carga vaginal abundante GBS es un factor de riesgo tanto para la enfermedad neonatal y la colonización. Por desgracia, poco se sabe acerca del anfitrión y los factores bacterianos que favorecer o permitir la colonización por GBS vaginal. Este protocolo describe una técnica para establecer persistente colonización vaginal GBS utilizando un β-estradiol solo pre-tratamiento y toma de muestras diariamente para determinar loa bacterianare. Aún más detalles métodos para administrar terapias o reactivos de interés adicionales y para recoger el líquido de lavado vaginal y los tejidos del tracto reproductivo. Este modelo de ratón será favorecer la comprensión de la interacción GBS-host dentro del ambiente vaginal, lo que conducirá a posibles dianas terapéuticas para controlar la colonización vaginal de la madre durante el embarazo y para prevenir la transmisión al recién nacido vulnerable. También será de interés para aumentar nuestra comprensión de las interacciones generales bacteriana en host en el tracto vaginal femenino.

Introducción

Streptococcus agalactiae, Streptococcus del grupo B (GBS), es una bacteria encapsulada, Gram-positiva que con frecuencia se aísla de los intestinos y el tracto genitourinario de adultos sanos. En la década de 1970, GBS surgió como el agente principal de mortalidad neonatal infecciosa, con más de 7.000 casos de la enfermedad neonatal por año ^1. La aparición temprana de la enfermedad por EGB (EOD) se produce en las primeras horas o días de vida, surge como neumonía o dificultad respiratoria, y con frecuencia se desarrolla en la sepsis, mientras que la enfermedad de aparición tardía (LOD) sobreviene después de varios meses y se presenta con bacteriemia, que con frecuencia avanza a la meningitis ^2. A partir de 2002, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades recomiendan el cribado universal de la colonización vaginal por EGB en el final de la gestación y la profilaxis antibiótica intraparto (IAP) para las madres GBS-positivas ^1. A pesar de la reducción de la enfermedad de aparición temprana a aproximadamente 1.000 casos en los Estados Unidos anualmente debido a IAP,GBS sigue siendo la principal causa de sepsis neonatal de aparición temprana, y la aparición de inicio tardío no se ve afectada ^1. Ya sea en el útero, durante el parto, o incluso en los casos de aparición tardía, la exposición neonatal a GBS requiere la supervivencia, transversal a través de una serie de entornos y barreras de acogida, la evasión inmune y, en el caso de meningitis, cruce de la sangre altamente regulado ² barrera del cerebro. Aguas arriba de estas interacciones virulentas en el recién nacido es la colonización inicial del tracto vaginal maternal. Materna GBS las tasas de colonización vaginal varían de 8-18% en los países desarrollados y en desarrollo, con una tasa promedio estimado del 12,7% ^3,4. GBS colonización del tracto vaginal durante el embarazo puede ser constante, intermitente, o de naturaleza transitoria entre las mujeres individuales ^5. Curiosamente, a la edad materna> 36 años se asocia con la colonización persistente ^6. Numerosos factores de riesgo biológicos y socio-económico para la colonización vaginal por EGBhan sido identificados. Los factores biológicos incluyen la colonización gastrointestinal GBS y la ausencia de Lactobacillus en el intestino. Sin embargo, el origen étnico, la obesidad, la higiene, y la actividad sexual también se han asociado con EGB ⁷ vaginal.

Aunque conocidos por causar infecciones neonatales, GBS también causa una variedad de infecciones maternas ambos periparto y posparto. GBS carro se incrementa en mujeres que se presentan con vaginitis ⁸ y, en algunos casos, incluso puede ser la entidad de la enfermedad ^9. Además, GBS ascensión del tracto reproductivo durante el embarazo puede resultar en una infección intra-amniótica o corioamnionitis ^10. Por otra parte, en un máximo de 3,5% de los embarazos, GBS difunde a la vejiga urinaria para causar una infección del tracto urinario o la bacteriuria asintomática ^11. bacteriuria por GBS durante el embarazo se asocia con un mayor riesgo de fiebre intraparto, corioamnionitis, parto prematuro y premature rotura de las membranas ^12. En su conjunto, la presencia de GBS dentro del tracto vaginal está vinculada a las infecciones de múltiples tejidos del huésped, y la capacidad de eliminar GBS de este nicho es imprescindible tanto para la salud materna y neonatal.

Hasta hace poco, la mayoría del trabajo de examinar las interacciones de GBS con el tracto cervicovaginal se limita a los modelos celulares in vitro ^13-15. Estos experimentos in vitro han revelado factores bacterianos que son importantes para la adhesión, incluyendo proteínas de superficie Tal pili y rico en serina repite ^17,18, así como los sistemas de regulación de dos componentes ^15,19 y la respuesta transcripcional global del epitelio vaginal para GBS ^19. Sin embargo, para dilucidar plenamente las interacciones huésped-microorganismo en el tracto vaginal, un modelo animal robusto es necesario. Los primeros trabajos demostraron que GBS se puede recuperar a partir del tracto vaginal de ratones inoculados ^20,21 y ratas ^{22 en ambas condiciones embarazadas y no embarazadas. En 2005, a corto plazo la colonización vaginal por EGB se modeló en ratones para examinar la eficacia de una enzima del fago lítico realizar un tratamiento vaginal durante un período de 24 horas 23. Varios años más tarde, un modelo de ratón de GBS colonización vaginal de larga duración fue desarrollado para estudiar anfitrionas bacterianas y factores que regulan GBS persistencia. Este modelo ha identificado numerosos factores que contribuyen a la colonización por GBS, incluyendo apéndices superficiales 17,18 y sistemas de dos componentes de GBS 19,24. Este modelo ha contribuido a la identificación de los mecanismos de respuesta de acogida 19,25 y fue utilizado para probar varias estrategias terapéuticas, incluyendo péptidos inmunomoduladores 26 y 27 probióticos. Este protocolo da la orientación necesaria para inocular GBS en el tracto vaginal del ratón y posteriormente realizar un seguimiento de la colonización y recoger muestras para análisis posteriores.}

Protocolo

Todos los animales de trabajo fue aprobado por la Oficina de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad Estatal de San Diego y lleva a cabo bajo las normas veterinarias aceptados. Los ratones hembra, edad 8 - 16 semanas, se utilizaron para el desarrollo de este método.

1. Preparación y la inyección intraperitoneal de β-estradiol

1. Medir β-estradiol (0,5 mg / ratón) en un peso de papel mientras que use el equipo de protección personal (EPP) apropiado. PRECAUCIÓN: β-estradiol puede ser absorbido por la piel y las mucosas.
2. Transferencia β-estradiol a un tubo cónico de 15 ml y agitar hasta que todos los grumos se eliminan y el β-estradiol es un polvo fino. Elaborar aceite de sésamo (100 l / ratón) en una jeringa de 10 ml. aceite de sésamo Jeringa-filtro en el tubo cónico de 15 ml que contiene la β-estradiol usando un filtro de 0,45-micras. Vortex el tubo cónico de 15 ml hasta que el β-estradiol es una suspensión homogénea en el aceite de sésamo.
3. Elaborar los ß-EStradiol suspensión en una nueva jeringa de 10 ml. Con un 18 G, 1-in. aguja, alícuota de 100 l de la suspensión en jeringas de tuberculina de 1 ml. Preparar una jeringa para cada ratón. Colocar una nueva, estéril 26 G, ½ pulg. aguja en cada jeringa de tuberculina.
4. Administrar 0,5 mg de la β-estradiol en suspensión en 100 l de aceite de sésamo (5 mg / ml) a cada ratón 24 hr antes de la inoculación bacteriana. Inyectar cada ratón dentro de la cavidad peritoneal, en los cuadrantes abdominales inferiores, justo a la derecha oa la izquierda de la línea media, como se ha descrito previamente ^28.
   NOTA: No hay limpieza o el recorte del sitio de la inyección es necesario.

2. La inoculación vaginal con GBS

1. Un día antes de la inoculación, crecer un cultivo líquido durante la noche de 5 ml de una cepa de GBS de interés, tal como A909 (serotipo Ia), en caldo de Todd Hewitt (THB) a 37 ° C.
2. Subcultura del cultivo de una noche de GBS en un volumen 1:10 en THB fresca y se incuba a 37 ° C. hacer crecer ellas bacterias hasta fase semilogarítmica (OD ₆₀₀ = 0,4-0,5). NOTA: Esto normalmente tomar 2 - 3 horas, dependiendo de la cepa de GBS.
3. Transferir el subcultivo en un tubo estéril bacterias y pellets cónicos de 15 ml a 3000 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el sedimento bacteriano en 200 l de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS).
4. Utilizando el sedimento resuspendido, llevar 3 - 5 ml de PBS (1 ml por cada 10 ratones) exactamente a OD ₆₀₀ = 0,4 en un nuevo tubo de cultivo de 5 ml. Esta será una concentración de 1 x 10 ~ ⁸ unidades formadoras de colonias (UFC) / ml. Traslado a un nuevo tubo cónico de 15 ml y se re-sedimentar las bacterias a 3000 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
5. Resuspender el sedimento en PBS a 1/10 del volumen original. Por ejemplo, si se sedimentó 3 ml de OD ₆₀₀ = 0,4, a continuación, volver a suspender en 300 l de PBS. NOTA: Este es el final de suspensión bacteriana (~ 1 × 10 ⁹ UFC / ml) que se utiliza para la inoculación de los animales.
6. Reserva 50 l de esta suspensión para la dilución en serie y en placas sobre agar THB para determinar el inóculo exacta.
7. Inocular cada ratón con 10 l de la suspensión bacteriana final de modo que 1 × 10 ⁷ CFU se administra a cada ratón.
   1. Para inocular, restringir el ratón manualmente, asegurando la piel suelta en la piel del cuello entre el dedo pulgar del controlador y el dedo índice y luego inmovilizar la cola, como se ha descrito previamente ^28.
   2. Elaborar 10 l de la EGB preparados en la etapa 2.6 en una punta de pipeta de carga de gel de 200 l. Inserte la punta 5 a 10 mm en el lumen vaginal y dispensar los 10 l de inóculo.
      NOTA: puntas de carga de gel se prefieren sobre los consejos de 200-l estándar para minimizar el riesgo de trauma o lesión de órganos, en particular en los ratones más jóvenes o más pequeños.
   3. Inmediatamente después de la inoculación, suelte la piel del cuello y elevar el extremo trasero del ratón, levantando el ratón por la cola y walking las patas delanteras sobre una superficie dura para ~ 1 min.
   4. una inspección visual de la abertura vaginal para cualquier reflujo de inóculo. Si se observa un flujo de retorno, una punta de pipeta nueva se puede usar para manipular o agrandar la abertura vaginal, facilitando la absorción de el reflujo en el lumen. Además, el reflujo puede ser aspirado a través de la pipeta y re-inoculadas.
      NOTA: Si la administración de agentes tópicos, organismos probióticos, o proteínas de interés, un volumen de hasta 20 l en un tampón fisiológico se puede dar en el tracto vaginal.

3. Frotar en el lumen vaginal para cuantificar GBS carga

1. Prever un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por ratón mediante la adición de 100 l de PBS. Justo antes de hisopado, humedecer previamente el hisopo en PBS.
2. Restringir el ratón como se describe en el paso 2.7.1 e inserte el hisopo de 10 mm en el lumen vaginal. gire suavemente el hisopo 4 veces en sentido horario y 4 veces en sentido antihorario, ejerciendo una ligera presión a la pared vaginal.
3. Transferir el hisopo en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con 100 l de PBS. Antes de chapado, vórtice del tubo de microcentrífuga durante ~ 15 segundos para liberar las bacterias del bastoncillo. En serie diluir cada muestra en PBS y la placa 20 l de diluciones 1:10 a 1: 10.000 en placas de agar medio diferencial preparados según las instrucciones del fabricante. Incubar las placas a 37 ° C durante 24 horas. GBS colonias van a aparecer ya sea de color rosa brillante o malva en color. Otros flora endógena se inhibirán o aparecerán como colonias azules, blancas o grises.

4. Recoger el líquido de lavado vaginal

1. Restringir el ratón como se describe en el paso 2.7.1. Usando una pipeta de punta de carga de gel de 200 l, pipeta de 20 l de PBS en el lumen vaginal. pipetear suavemente todo el volumen arriba y abajo 4 veces dentro de la luz y, a continuación retirar todo el volumen de la misma punta de la pipeta. NOTA: Si el líquido de lavado está lleno de mucosa, una punta de pipeta estándar de 200 lpuede ser utilizado para recoger el líquido de lavado final.
2. Si el ahorro de líquido de lavado para el análisis de citoquinas o cuantificación de UFC, se distribuye en un tubo de microcentrífuga de 0,7 ml. Si se determina la fase de estro, dispensar al menos 5 l de líquido de lavado en un portaobjetos de vidrio y observar las células bajo un aumento de 100X en un microscopio de luz. NOTA: Para ver ejemplos de etapas de celo, véase la figura 1.

5. disección de tejido y homogeneización

1. Para cada ratón, se preparan tres tubos de 2 ml con tapón de rosca (uno para cada tejido: la vagina, el cuello uterino y el útero). Llenar cada tubo con amplias (0,4 a 0,5 g) de 1,0 mm de perlas de óxido de circonio para cubrir la parte inferior de forma cónica del tubo.
2. Esterilizar en autoclave los tubos preparados antes de recoger el tejido durante 30 minutos a 121 ° C, especialmente si la cuantificación de la carga bacteriana. Añadir 500 l de PBS estéril a cada tubo. Pese cada tubo después de la esterilización en autoclave y el registro para una futura referencia para calcular el peso del tejido recuperado.
3. Sacrificio del ratón usando métodos institucionales aprobados tales como asfixia con _CO2 y dislocación cervical. Rocíe el abdomen ventral con EtOH al 70%. Con unas tijeras estériles, abrir la cavidad abdominopélvica, levantar la piel de la espalda y los músculos abdominales, y desplazar a los intestinos, de manera que está expuesto el aparato reproductor.
4. Esterilizar las tijeras con EtOH al 70%, limpiar si es necesario, y cortar en ambos cuernos uterinos media distancia entre el cuerpo del útero y los ovarios. El uso de tijeras y pinzas, la grasa visceral separada, membranas, y la vejiga urinaria lejos del tracto reproductivo, moviéndose en sentido caudal.
5. Esterilizar las tijeras como se describe en el paso 5.4. Transversalmente cortar la vagina tan cerca de la vulva como sea posible para separar el tracto reproductivo del cuerpo. Levante y retire el tracto reproductivo intacto y colocarlo en una placa de Petri estéril.
6. Usando una nueva hoja de afeitar, separar el útero del cuello del útero en un corte transversal. Esterilizar la hoja de afeitar con 70%EtOH, y luego separar el cuello uterino de la vagina en un corte transversal. NOTA: No habrá una cantidad mínima de tejido uterino todavía unido al cuello uterino. No habrá una cantidad mínima de tejido vaginal todavía unido al cuello uterino.
7. El uso de pinzas estériles, transferir cada uno de los tejidos en sus respectivos tubos de 2 ml con PBS y homogeneizando los granos. Limpiar la pinza con EtOH al 70% entre el manejo de cada tejido.
8. Pesar cada 2 ml tubo de tapón de rosca y restar el peso original de tubo para determinar el peso del tejido. pesos de los tejidos típicamente varían entre 20 - 100 mg. sellar herméticamente los tubos de tapón de rosca y homogeneizar los tejidos durante 1 min a velocidad máxima en un homogeneizador de tejidos.
9. Para cuantificar la carga bacteriana, en serie se diluye 25 l de homogeneizado de tejido y las diluciones en placas 01:10 a 1: 10.000 en placas de agar medio diferencial. Se incuban las placas como se describe en el paso 3.3. Para almacenar las muestras para la cuantificación de citoquinas, congelar tejido homogeneizado en -20 ° C.

Resultados

Durante el desarrollo de este modelo, se hicieron varias observaciones acerca de los factores que afectan a la duración de la colonización vaginal por EGB. Para determinar cómo etapa estral en impactos de inoculación bacteriana GBS persistencia, los ratones se llevaron a cabo en el día de la inoculación a través de líquido de lavado vaginal. La Figura 1 ilustra las cuatro etapas del ciclo estral de ratón, como se determina por mojado de montaje en el líquido de lavado va...

Discusión

Para promover el avance de la comprensión de las interacciones con el GBS tanto el anfitrión y otros microbios en el contexto del huésped, se requiere un modelo animal. Este trabajo describe los aspectos técnicos del establecimiento de la colonización vaginal por EGB en ratones. Este protocolo logra> 90% colonización de ratones sin el uso de anestésicos para inocular bacterias o para recoger muestras de frotis, inmunes supresores para permitir la colonización, pre-lavado vaginal, o aditivos para espesar el inóculo. P...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aceite de sésamo	Sigma Aldrich	S3547-250ML
β-Estradiol	Sigma Aldrich	E8875-1G	PRECAUCIÓN: Use el EPP adecuado. El estradiol puede absorberse a través de la piel y las superficies mucosas.
200 μ l Puntas de pipeta de carga de gel	USA Scientific	1252-0610
Hisopos uretrogenitales, estériles, de alginato de calcio	Puritan	25-801 A 50
CHROMagar StrepB	DRG International	SB282
Todd Hewitt Caldo	Hardy Diagnostics	7161C
18 G, agujas de 1,5 pulgadas	BD	305199
26 G, agujas de 0,5 pulgadas	BD	305111
Jeringas de 10 ml	BD 309604
Jeringas de 1 ml	BD	309659
0,45 μ m Filtros de jeringa PVDF	Whatman	6900-2504
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x	Corning	21-031-CV