El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cáncer

Resumen

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

Resumen

La resistencia a fármacos sigue siendo un problema importante en el tratamiento del cáncer tanto para neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La resistencia intrínseca o adquirida puede ser causada por una variedad de mecanismos, incluyendo el aumento de la eliminación del fármaco, disminución de la captación del fármaco, la inactivación de drogas y alteraciones de objetivos farmacológicos. Los datos recientes muestran que, aparte de por el conocido genética (mutación, amplificación) y epigenética (hipermetilación del ADN, modificación posterior a la traducción de histonas) modificaciones, los mecanismos de resistencia a fármacos también podría ser regulados por las aberraciones de empalme. Este es un campo de rápido crecimiento de la investigación que merece atención en el futuro con el fin de planificar estrategias terapéuticas más eficaces. El protocolo descrito en el presente documento está dirigido a investigar el impacto de corte y empalme aberrante en la resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de varios modelos in vitro a través de RNA-seq y establecered un QRT-PCR basado en el método para validar los genes candidatos. En particular, se evaluó el corte y empalme diferencial de ddx5 y PKM transcripciones. El corte y empalme aberrante detectado por la herramienta computacional MATS fue validado en células leucémicas, lo que demuestra que las diferentes variantes de corte y empalme ddx5 se expresan en las células resistentes frente a los padres. En estas células, también se observó una relación más alta PKM2 / PKM1, que no se detectó en la contraparte gemcitabina resistente Panc-1 en comparación con células parentales Panc-1, lo que sugiere un mecanismo diferente de resistencia a las drogas inducida por la exposición gemcitabina.

Introducción

A pesar de considerables avances en el tratamiento del cáncer, la resistencia de las células malignas a la quimioterapia, ya sea intrínseca o adquirida a la exposición prolongada de drogas, es la razón principal para el fracaso del tratamiento en una amplia gama de leucemia y tumores sólidos ^1.

Con el fin de delinear los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos, en los modelos de línea celular in vitro se desarrollan por etapas de selección de las células cancerosas resistentes a los agentes quimioterapéuticos. Este procedimiento imita los regímenes utilizados en los entornos clínicos y por....

Protocolo

1. Caracterización de los perfiles de resistencia a los medicamentos a través de Ensayos de citotoxicidad

1. Leucémica Cultura línea celular
   1. Mantener el parental de células T línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), así como sus sublíneas resistentes a los fármacos, incluyendo CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3, en 25 cm ² en medio de 10 ml de RPMI-1640 que contiene 2,3 M de ácido fólico suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina.
   2. Cultivar las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C en una incubadora de _CO2 al 5%.
   3. Permitir el crecimie....

Resultados

Los ensayos de citotoxicidad descritos en el protocolo proporcionan un método fiable y robusto para evaluar la resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos in vitro. Mediante el ensayo de MTT, se determinó la sensibilidad a la Dex en cuatro líneas T-ALL de células, incluyendo las células CEM-WT parentales Dex-sensibles, y tres sublíneas Dex-resistentes: CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3. Dos rangos de concentración diferentes tuvieron que ser utilizado debid.......

Discusión

Aquí se describe un nuevo método que combina las técnicas de detección de citotoxicidad bien establecidos y de gran alcance transcriptómica basada en NGS análisis para identificar los eventos de corte y empalme diferencial en relación con la resistencia a fármacos. Ensayos espectrofotométricos son de alto rendimiento métodos convenientes y robustas para evaluar la sensibilidad a fármacos en modelos de cáncer in vitro y representan la primera opción para muchos laboratorios que realizan pruebas de detección de c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sulforhodamina B	Sigma-Aldrich	230162
Ácido tricloroacético	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, EE. UU	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, EE. UU	ATCC CRL-1469
DMEM alta glucosa	Lonza, Basilea, Suiza	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU	. 11875093
Suero fetal de bovino y ternero	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania	758093
sulfato de estreptomicina G de penicilina	Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.	15140122
Tris(hidroximetil)-aminometano	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Países Bajos		Espectrofotómetro de placas UV-Vis de 96 pocillos
Greiner CELLSTAR Placas de 96 pocillos	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Solución de tripsina/EDTA 100 ml	Lonza, Basilea, Suiza	CC-5012
Matraces de cultivo celular CELLSTAR 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania	82051-074
CELLSTAR Matraces de cultivo celular 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania	82050-856
Solución salina tamponada con fosfato (NaCl 0,9%)	B.Braun Melsungen AG, Alemania	362 3140

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