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Artículo de método

El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en

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DOI:

10.3791/54714

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9 de diciembre de 2016

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1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

Resumen

La resistencia a fármacos sigue siendo un problema importante en el tratamiento del cáncer tanto para neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La resistencia intrínseca o adquirida puede ser causada por una variedad de mecanismos, incluyendo el aumento de la eliminación del fármaco, disminución de la captación del fármaco, la inactivación de drogas y alteraciones de objetivos farmacológicos. Los datos recientes muestran que, aparte de por el conocido genética (mutación, amplificación) y epigenética (hipermetilación del ADN, modificación posterior a la traducción de histonas) modificaciones, los mecanismos de resistencia a fármacos también podría ser regulados por las aberraciones de empalme. Este es un campo de rápido crecimiento de la investigación que merece atención en el futuro con el fin de planificar estrategias terapéuticas más eficaces. El protocolo descrito en el presente documento está dirigido a investigar el impacto de corte y empalme aberrante en la resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de varios modelos in vitro a través de RNA-seq y establecered un QRT-PCR basado en el método para validar los genes candidatos. En particular, se evaluó el corte y empalme diferencial de ddx5 y PKM transcripciones. El corte y empalme aberrante detectado por la herramienta computacional MATS fue validado en células leucémicas, lo que demuestra que las diferentes variantes de corte y empalme ddx5 se expresan en las células resistentes frente a los padres. En estas células, también se observó una relación más alta PKM2 / PKM1, que no se detectó en la contraparte gemcitabina resistente Panc-1 en comparación con células parentales Panc-1, lo que sugiere un mecanismo diferente de resistencia a las drogas inducida por la exposición gemcitabina.

Introducción

A pesar de considerables avances en el tratamiento del cáncer, la resistencia de las células malignas a la quimioterapia, ya sea intrínseca o adquirida a la exposición prolongada de drogas, es la razón principal para el fracaso del tratamiento en una amplia gama de leucemia y tumores sólidos 1.

Con el fin de delinear los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos, en los modelos de línea celular in vitro se desarrollan por etapas de selección de las células cancerosas resistentes a los agentes quimioterapéuticos. Este procedimiento imita los regímenes utilizados en los entornos clínicos y por lo tanto permite la investigación en profundidad de los mecanismos de resistencia pertinentes. Las células resistentes que sobreviven al tratamiento son entonces distinguirse de las células sensibles de los padres mediante el uso de ensayos de viabilidad celular / 2 de citotoxicidad. En los perfiles de resistencia a fármacos in vitro de células primarias han demostrado ser significativamente relacionada con la respuesta clínica a la quimioterapia 3.

cytoto de alto rendimientoensayos xicidad constituyen un método conveniente para determinar la sensibilidad a fármacos in vitro. En este documento, la viabilidad de las células se evalúa mediante por ejemplo la 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil bromuro de tetrazolio - ensayo de MTT 4, que se basa en la conversión metabólica de ciertos sustratos (es decir, sales de tetrazolio) en productos de color, lo que refleja así la actividad mitocondrial de las células. Alternativamente, el contenido de proteína celular puede cuantificarse utilizando la sulforodamina B (SRB) de ensayo 5. Aquí, el número de células viables es proporcional a la densidad óptica (DO) medida a una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro, sin necesidad de extensa y consume mucho tiempo procedimientos de recuento de células. La inhibición del crecimiento inducida por un determinado fármaco quimioterapéutico se puede calcular sobre la base de la DO de los pocillos en los que las células fueron tratadas con un agente de ensayo y se compara con el diámetro exterior de las células de control no tratadas. Una curva de dosis-respuesta es obtained por el trazado de las concentraciones de fármaco frente a porcentajes de células viables con respecto a las células control. Finalmente, la sensibilidad al fármaco puede ser reportada como la concentración que da como resultado 50% de inhibición del crecimiento celular en comparación con las células no tratadas (IC 50).

Los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos incluyen muchas anomalías diferentes, tales como las alteraciones que afectan a la expresión de genes de los determinantes de la actividad del fármaco y el metabolismo celular. Estas lesiones moleculares, incluyendo mutaciones, aberraciones en un transcripcional y post-transcripcional, así como la regulación epigenética perturbado a menudo afectan a los genes implicados en el metabolismo de fármacos, ya sea o apoptosis 6.

Splicing alternativo de pre-mRNA y su intrincada regulación han recibido recientemente una atención considerable como una entidad nueva que pueda dictar la resistencia a fármacos de las células cancerosas 7. Hasta 95% de los genes humanos están empalmados alternativamente en las células normales por medio de estafirmemente proceso regulado que produce muchos diferentes isoformas de la proteína a partir del mismo gen. Splicing alternativo es a menudo desregulado en el cáncer y varios tumores se caracterizan por empalme alterada de un número creciente de genes implicados en el metabolismo de fármacos (es decir, la desoxicitidina quinasa, folilpoliglutamato sintetasa, o las proteínas de resistencia a múltiples fármacos) 6,8. Sin embargo, el análisis exhaustivo de los perfiles de empalme de las células resistentes a los fármacos está dolorosamente ausente. Por lo tanto, es imperativo desarrollar métodos de alto rendimiento para el análisis de corte y empalme alternativo. Esto podría ayudar a desarrollar enfoques terapéuticos más eficaces.

Durante la última década, el rápido desarrollo de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) ha enriquecido la investigación biomédica con nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que regulan la regulación de la expresión del genoma y su papel en diversos procesos biológicos 9. RNA-secuenciación (RNA-seq) es un potente sub-aplicaciónde NGS en el campo de la transcriptómica. Permite un perfilado en todo el genoma (cualitativa y cuantitativamente) de los patrones de expresión de miles de genes simultáneamente y es muy adecuado para la caracterización de nuevos mRNAs de codificación así como de larga ARN no codificante, miRNA, siRNA, y otra RNA pequeña clases (por ejemplo, snRNA y Pirna) 10,11.

RNA-Seq tiene muchas ventajas sobre las tecnologías anteriores para la caracterización transcriptoma (por ejemplo, secuenciación Sanger y microarrays de expresión). No se basa en la anotación del genoma existente, que tiene un nivel de un solo nucleótido de la resolución y tiene un rango dinámico más amplio para la estimación del nivel de expresión. En pocas palabras, el flujo de trabajo experimental básico de experimentos de RNA-seq consiste en la selección transcripción poliadenilado (ARNm) y la fragmentación, seguido de la conversión en cDNA, construcción de la biblioteca y la secuenciación profunda finalmente, masivamente paralelo 12,13. Debido a la rápida caída de sequencincostos ga lo largo de los últimos años, el RNA-seq está reemplazando gradualmente a otras tecnologías y se están haciendo esfuerzos significativos para mejorar los protocolos de preparación de la biblioteca. Por ejemplo, ahora es posible retener la información hebra de transcritos de ARNm mediante el marcado de la segunda cadena de ADNc con trifosfato de desoxiuridina (dUTP) y, antes de la PCR de amplificación, la digestión de la hebra marcada con uracil-DNA-glicosilasa (UDG). Este proceso mejora la exactitud de la anotación de genes y la estimación de los niveles de expresión 14,15.

El análisis e interpretación de datos de RNA-seq requieren paquetes de software de cálculo complejas y de gran alcance y su transformación en tuberías bioinformáticas 16,17. En primer lugar, la prima lee someten a control de calidad mediante la eliminación de artefactos técnicos y biológicos y descartar (recorte) las secuencias que no llegan a estrictos requisitos de calidad. Posteriormente las lecturas para cada muestra se asignan a un genoma de referencia e indexadoen-nivel de genes, a nivel de exón, o a nivel de transcripción, con el fin de determinar la abundancia de cada categoría. Dependiendo de la aplicación, los datos refinados se calculan entonces a través de modelos estadísticos para la identificación de la expresión específica de alelo, splicing alternativo, fusiones de genes y polimorfismos de nucleótido único (SNP) 12. Finalmente, el análisis diferencial en el nivel seleccionado (es decir, la expresión de genes o corte y empalme alternativo) se puede utilizar para comparar las muestras obtenidas en diferentes condiciones.

El análisis diferencial de empalme se describen las diferencias en el uso del sitio de empalme entre dos muestras. Un número creciente de paquetes de software dedicados a este propósito están disponibles basadas en diferentes modelos estadísticos, actuaciones y la interfaz de usuario 18. Entre estos, MATS (análisis multivariante de la transcripción de empalme) emerge como una herramienta computacional de libre disposición y precisa sobre la base de un marco estadístico Bayesiano y diseñados para detectar diferential eventos de empalme de forma de datos de ARN-ss finales individuales o pareadas. A partir de los archivos alineados (.bam), MATS puede detectar todos los tipos de eventos alternativos de empalme (salto de exón, alternativa 'del sitio de empalme alternativo, 5' del sitio de empalme 3, mutuamente excluyentes exones e intrones de retención - véase también la Figura 1).

En primer lugar, se identifica el software lee la cual soporta un determinado evento de empalme, por ejemplo la omisión de exón, y los clasifica en dos tipos. "La inclusión lee" (para el evento de empalme canónica) mapear dentro del exón investigado y abarcan las uniones entre las que el exón específico y los dos exones que flanquean aguas arriba y aguas abajo. "Skipping lee" (para el evento de corte y empalme alternativo) abarcan la unión entre los dos exones que flanquean. Posteriormente, MATS devuelve el nivel de inclusión normalizada, tanto para los eventos canónicas y alternativa y compara los valores entre las muestras o condiciones. En última instancia, se calcula un valor de pnd tasa de falso descubrimiento (FDR), suponiendo que la diferencia en la relación variante de un gen entre dos condiciones excede un umbral definido por el usuario determinado para cada caso de empalme 19,34.

Tras el análisis diferencial de empalme en conjunción con ARN-ss, una extensa validación experimental se justifica con el fin de identificar genes candidatos verdaderos positivos 18. Reacción en cadena de la polimerasa transcrita inversa cuantitativa (QRT-PCR) es el método más comúnmente utilizado y óptima en la validación de los candidatos obtenidos a partir de análisis de ARN-Seq 20. El objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología sólida para investigar los perfiles de empalme relacionados con la resistencia a los fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Nuestro enfoque utiliza ARN-ss-a base de perfiles de transcriptoma de los modelos de líneas celulares seleccionadas de cánceres resistentes a los fármacos en combinación con un método de QRT-PCR establecido para la validación de genes candidatos implicados en la resistencia a los medicamentos.

Los modelos de líneas celulares de leucemia humana utilizados en este estudio incluyen pediátrica de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), sus dos glucocorticoides (GC) -resistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) y CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 y el metotrexato (MTX) sublínea -resistant CEM / R30dm 23. Aunque las terapias actuales basados ​​en GCs y MTX establecen beneficio clínico en aproximadamente 90% de los casos, la aparición de GC-resistencia representa todavía un problema sin resolver con un mecanismo molecular poco clara. Para aislar GC resistente sub-clones, las células CEM-WT se cultivaron en 1 dexametasona mu M (Dex) de 2 a 3 semanas. sublínea resistente a MTX-CEM / R30dm se desarrolló a través de corto plazo repetida (24 horas) la exposición de las células CEM-peso a 30 M MTX como un imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta línea celular también muestra resistencia cruzada a Dex (resultados no publicados) para el cual el mecanismo no se entiende completamente.

El sólido tumo modelo investigado en el presente estudio es el adenocarcinoma ductal pancreático, conocido por su extraordinaria refractariedad a la quimioterapia. Con este fin, se seleccionaron línea Panc-1 célula y su gemcitabina resistente sub-clon Panc-1R obtenido por incubación continua con 1 M de la droga 24. Aquí se describe un enfoque para descubrir nuevos mecanismos subyacentes in vitro resistencia a los medicamentos mediante la combinación de tres protocolos: los ensayos de citotoxicidad colorimétricos para evaluar la sensibilidad al fármaco en las células leucémicas y células cancerosas de los tumores sólidos, tubería de ARN-basada en la SEC para identificar nuevas variantes de empalme relacionados con sensibilidad a los fármacos / resistencia y RT-PCR y análisis de QRT-PCR para validar los posibles candidatos.

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Protocolo

1. Caracterización de los perfiles de resistencia a los medicamentos a través de Ensayos de citotoxicidad

  1. Leucémica Cultura línea celular
    1. Mantener el parental de células T línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), así como sus sublíneas resistentes a los fármacos, incluyendo CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3, en 25 cm 2 en medio de 10 ml de RPMI-1640 que contiene 2,3 M de ácido fólico suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina.
    2. Cultivar las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
    3. Permitir el crecimiento celular a concentraciones de entre 2 - 3 x 10 6 células / ml.
    4. Dividir las células dos veces a la semana a una concentración inicial de 0,3 x 10 6 células / ml (por ejemplo, si la concentración de células es de 3 x 10 6 células / ml, la transferencia de suspensión de células 1 ml en un nuevo matraz que contenía 9 ml de medio fresco). Desechar el cultivo después de 20 pases consecutivos.
  2. Carcinoma de células de páncreas Cultura Line
    NOTA: Mantener la línea celular de carcinoma pancreático humano Panc-1 en 75 cm 2 frascos de cultivo en 10 ml de medio DMEM con alta glucosa y L-glutamina suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina . La variante resistente a los medicamentos, Panc-1R, se cultiva en el mismo medio de cultivo que contiene 1 M gemcitabina disueltos en agua estéril. Se proporcionan más detalles en el 24.
    1. Cultivar las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
    2. Dividir las células cada 2 - 3 días en una proporción de 1: 5 cuando las células alcanzan la confluencia de aproximadamente 90%.
    3. Para dividir las células, se lava dos veces con la solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadir 1 ml de Tripsina / EDTA por 75 cm 2 frasco de cultivo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
    4. Añadir 9 ml de medio y cosechar las células separadas en un tubo de 15 ml. Semilla suspensión celular de 2 ml en un matraz de nuevo contacaniza 8 ml de medio. Desechar el cultivo después de 20 pases consecutivos.
  3. MTT ensayo de células leucémicas
    1. Prepararse de antemano la solución de MTT: se disuelven 500 mg de MTT formazano en 10 ml de PBS y agitación (protegido de la luz) con un agitador magnético durante aproximadamente 1 hora. Esterilizar la solución con un filtro de 0,22 micras. NOTA: La solución se puede almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 ° C. Proteger de la luz directa después de la descongelación.
    2. Preparar con antelación el isopropanol acidificado: añadir 50 ml de HCl 2 a 2,5 l de isopropanol. NOTA: Guarde la solución durante al menos un mes a temperatura ambiente antes de su uso. Si el isopropanol no se acidifica correctamente, puede formar precipitados con el medio y poner en peligro la lectura espectrofotométrica.
    3. Preparar un fondo plano de 96 pocillos separada "día 0" (control) placa para asegurar la estimación más precisa de la inhibición del crecimiento: dedicar 3 a 6 pocillos por cada línea celular, añadir 30 l de crecimientomedio y 120 l de suspensión de células (8.000 células) por cada l pocillos y 150 del medio de cultivo a los pocillos correspondientes a los espacios en blanco (sin células). Proceder de la etapa 1.3.9 al paso 1.3.13 de esta sección para medir la densidad óptica (OD). NOTA: Se proporcionan más detalles en 4.
    4. Preparar una placa experimental de 96 pocillos de fondo plano: dedicar 30 pozos a concentraciones de fármaco (10 concentraciones, cada una por triplicado), 10 pozos para el control de las células y los 10 pozos de control de medio sin células (espacios en blanco) y preparar una serie de diluciones de fármaco de dexametasona ( Dex) utilizando dimetil sulfóxido como disolvente.
      NOTA: Para las células CEM-WT el intervalo de dilución Dex está entre 2 micras y 0,97 nM. Para las células CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3 el intervalo de dilución Dex está entre 640 mM y 0,33 nM.
    5. Añadir 30 l de cada dilución de Dex en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de incluir cada concentración en un triplicado.
    6. Añadir 30 l de medio de crecimiento a biens que corresponde a las células de control y 150 l de medio de crecimiento a pocillos correspondientes a los espacios en blanco.
    7. Cosecha de las células y resuspender en crecimiento exponencial en su concentración óptima de la siembra.
      NOTA: Para determinar las concentraciones óptimas de células de partida, se recomienda para evaluar el perfil de crecimiento de cada línea celular de la línea celular en una placa de 96 pocillos mediante la siembra de células a varias concentraciones y midiendo diariamente durante al menos 4 días. Elija una concentración de siembra que impide el crecimiento excesivo de las células después de 72 horas, ya que influirá en el experimento mediante la saturación de los valores de DO. Para CEM-WT, CEM-C5 y CEM-R5 la concentración óptima de siembra es de 8.000 células / pocillo, mientras que para el CEM / R30dm es 5.000 células / pocillo.
    8. Añadir 120 l de suspensión celular a cada ya sea la solución de fármaco que contiene bien o el medio de crecimiento (pozos correspondiente a las células de control). Llenar los pocillos externos vacíos de la placa con 150 l de PBS para asegurar una buena humedad en la placa e incubar THplacas electrónicas para 72 horas a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular.
    9. Añadir 15 l de la solución MTT a cada pocillo y agitar la placa durante 5 min con una placa-agitador hasta un máximo de 900 batidos / min.
    10. Colocar las placas de nuevo a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular y se incuba durante otra 4-6 hr.
    11. Añadir 150 ml de isopropanol acidificado la a cada pocillo y mezclar bien con una pipeta multicanal para volver a suspender a fondo todos los cristales de formazán. Comience con los pocillos de blanco y asegúrese de enjuagar bien las puntas antes de pasar a otra fila de la placa.
    12. Se incuba la placa a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
    13. El uso de un lector de microplacas, determinar la DO a 540 y 720 nm para asegurar una medición precisa mediante la corrección para el fondo OD. A continuación, guarde los datos en un archivo de hoja de cálculo y analizarlo 4.
  4. SRB Ensayo para células pancreáticas Carcinoma
    1. Disolver reactivo SRB en ácido acético al 1% a una concentración final de 0,4% (w / v).
    2. Disolver ácido tricloroacético (TCA) en agua ultrapura a una concentración final de 50% (w / v).
    3. Disolver Tris aminometano (hidroximetil) en agua ultrapura a una concentración final de 10 mM.
    4. Preparar una placa de fondo de control "día 0" plana separada de 96 pocillos para asegurar una estimación más precisa de la inhibición del crecimiento: la semilla 6 pocillos con células en crecimiento en fase exponencial de 100 l de medio a una concentración de siembra apropiada y añadir 100 l de medio sólo para pozos correspondientes a espacios en blanco. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 para asegurar la adhesión adecuada de las células a la placa. A continuación, añadir 100 l de medio a todos los pocillos y proceder a los pasos 1.4.8 - 1.4.16 de esta sección.
    5. Preparar una placa experimental de 96 pocillos de fondo plano: células de semillas en crecimiento en fase exponencial por triplicado en 96 pozos de placas de fondo plano a una densidad apropiada en 100 l de míDium utilizando una pipeta multicanal.
      NOTA: Para determinar las concentraciones óptimas de células de partida, se recomienda para evaluar el perfil de crecimiento de cada línea celular de la línea celular en una placa de 96 pocillos mediante la siembra de células a varias concentraciones y midiendo diariamente durante al menos 4 días. Elija una concentración de siembra que impide el crecimiento excesivo de las células después de 72 horas, ya que influirá en el experimento mediante la saturación de los valores de DO. Para las células Panc-1 y Panc-1R, la concentración óptima de siembra es de 8000 células / pocillo.
    6. Añadir 100 l de medio a medio-sólo pocillos e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 para asegurar la adhesión adecuada de las células a la placa.
    7. Preparar una serie de diluciones de fármaco de gemcitabina entre 1 M y 10 nM para Panc-1 y 1 mM y 100 nM para las células Panc-1R. Añadir 100 ml de cada dilución en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Asegúrese de tener cada concentración por triplicado. En adición,añadir 100 l de medio a las medianas sólo los pozos y las células de control. Incubar a 37 ° C con 5% de CO2 durante 72 hr.
    8. Añadir 25 l solución de TCA frío a los pocillos utilizando una pipeta multicanal y se incuban las placas durante al menos 60 min a 4 ° C con el fin de precipitar y fijar las proteínas en el fondo de los pocillos.
    9. Vaciar la placa eliminando el medio y seca brevemente en un pañuelo de papel.
    10. Lavar 5 veces con agua del grifo, a continuación, vaciar la placa y dejar secar a temperatura ambiente.
    11. Añadir 50 l solución de SRB por pocillo mediante el uso de una repetición-pipeta y las manchas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    12. Vaciar la placa mediante la eliminación de la mancha SRB.
    13. Lavar 4 veces con ácido acético al 1%, a continuación, vaciar la placa y dejar secar a temperatura ambiente.
    14. Añadir 150 l solución de Tris por pocillo usando una pipeta multicanal y se mezcla durante 3 min en una placa-agitador hasta un máximo de 900 batidos / min.
    15. Leer la densidad óptica a 540 nm (o 492 nm si tél OD valores son demasiado altos).
    16. Analizar los datos.
  5. Análisis de los datos de MTT y SRB Ensayos
    1. Calcular los valores de DO de las células en el "día 0" mediante la siguiente fórmula: Día OD = 0 células de control OD - pocillos de blanco DO promedio
    2. Calcular el porcentaje de células supervivientes para cada concentración de fármaco de acuerdo con la siguiente fórmula:% de células tratadas = [células tratadas OD - pocillos de blanco DO promedio - Day OD 0] Media / [células de control OD - pocillos de blanco DO promedio - OD Day0] * 100
    3. Trazar la curva de dosis-respuesta (concentración de fármaco frente a la inhibición del crecimiento en%).
    4. Calcular la concentración del fármaco que inhibe el crecimiento de células en un 50% (IC 50), utilizando la curva de dosis-respuesta.

2. Aislamiento de ARN y preparación de la biblioteca de ARN de secuenciación

  1. Muestra Collreflexión y aislamiento de ARN
    1. Para células CEM: cosechar 10 6 células directamente del medio de cultivo.
    2. Para Panc-1 y Panc-1R: eliminar medio, se lavan las células dos veces con PBS y separar mediante la adición de tripsina-EDTA y la incubación a 37 ° C durante 3 min. Añadir medio de cultivo y la cosecha de 10 6 células.
    3. Centrifugar las muestras a 300 xg durante 3 min, eliminar el sobrenadante y extraer mRNA total usando columnas de centrifugación de la membrana de sílice disponibles comercialmente, siguiendo el protocolo del fabricante de.
    4. Determinar la concentración y pureza del ARN total mediante el uso de un espectrofotómetro de UV-Vis.
      NOTA: el ARN se considera de alta pureza si la relación de absorbancia 260 nm / 280 nm está por encima de 1,8. Las muestras pueden ser almacenadas a - 80 ° C.
    5. Evaluar la integridad de ARN total por electroforesis de 200 ng de la muestra en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
      NOTA: La detección de dos bandas intactas correspondiente a mamíferos 28S y 18S rRNAs aproximadamente a las2 kb y 1 kb de tamaño es indicativo de una buena integridad de ARN total.
  2. Preparación secuenciación Biblioteca
    1. Utilizar 2 g de ARNm total por cada muestra. Siga mRNA protocolo de preparación de la biblioteca de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Determinar la calidad y la concentración de cada biblioteca mediante el uso de un sistema Bioanalyzer. Se combinan las bibliotecas en una sola muestra hasta una concentración final de 10 nmol / L y medirlo con el Bioanalyzer.
    3. Utilizar el sistema de secuenciación de alto rendimiento con el único modo de lectura de 100 pb.
      NOTA: Lee longitud de> 80 pb es necesaria para la identificación de las isoformas de la transcripción.

3. Detección de empalme diferencial de lecturas de secuenciación

  1. Alineación de Lee a la referencia del genoma y la comprobación de la calidad
    1. Compilar una anotación de genes (archivo .gtf) de la tabla NCBI refGene utilizando UCSC navegador mesa (25.963 genes).
    2. Realizaralineamiento con huecos anotación consciente de secuenciación lee en el genoma de referencia (GRCh37) utilizando STAR.
    3. Ordenar e indexar los archivos de alineación resultantes con herramientas Picard.
    4. Realizar el control de calidad posterior a la asignación de notificaciones mediante RSeQC y samtools.
  2. La detección diferencial de empalme entre los grupos de la muestra
    1. Instalar Python y las correspondientes versiones de NumPy y SciPy. Descargar e instalar samtools. Descargar e instalar pajarita y sombrero de copa,
    2. Añadir los directorios Python, bowtie, sombrero y una samtools a la variable de entorno $ PATH. Descarga pre-construido índices bowtie (hg19). Descargar rMATS versión 3.0.9.
      Nota: Para más detalles acerca de rMATS se proporcionan en el 19 y el 34.
    3. Detectar eventos de splicing alternativo mediante la comparación de cada línea celular Dex resistente al CEM-WT y Panc-1 a Panc-1R en MATS separada discurre según la Figura 5A.
    4. Para detectar eventos de splicing diferenciales de Previously secuenciación alineado lee (archivos .bam), esteras de ejecución mediante los comandos de la figura 5B para el CEM-WT vs CEM-C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm y Panc1 a Panc- comparaciones 1R.
      NOTA: MATS creará una carpeta de salida con dos archivos .txt con resultados por tipo de empalme caso analizado (SE - omisión de exón, A5SS - alternativa 'del sitio de empalme, A3SS - la alternativa 3' del sitio de empalme 5, MEX - exones mutuamente excluyentes y RI - intrón retención): contienen los resultados de un solo archivo basados ​​en el recuento sólo de unión y un segundo archivo con los resultados basados ​​en el recuento de unión y se lee en el blanco. Por otra parte, un archivo .txt adicional con una visión general resultado se genera en la misma carpeta.
    5. Por SE, A5SS, A3SS e importación de RI a hojas de los archivos .txt en base a los recuentos de unión y lee en el blanco. Para MEX importar los archivos .txt en base a sólo cuenta unión.
      NOTA: el archivo de salida MATS está ordenada por orden ascendente los valores de P y contiene varios parámetros: Identificación de genes, genes símbolo, El cromosoma y la posición hebra, genómica coordenadas de los fragmentos empalmados alternativamente, cuenta, así como la longitud de la inclusión y saltar formas para ambas muestras analizadas, la longitud de la inclusión y saltarse forma utilizada para la normalización, p-valor, la tasa de falso descubrimiento (FDR ), nivel de inclusión para cada muestra en función de los recuentos normalizados y la puntuación de inclusión diferencial (promedio (IncLevel1) - media (IncLevel2)).
    6. Seleccionar los genes candidatos estadísticamente significativas con un FDR <10% para una validación adicional (por ejemplo, ddx5 y PKM2).
    7. Visualizar eventos de splicing alternativo con Integrativa Genómica Visor (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), como se informó en la Figura 5.

4. La validación de los resultados por RT-PCR y QRT-PCR ensayos

  1. Diseño de cebadores
    NOTA: Con el fin de proporcionar una validación fiable de los resultados obtenidos utilizando el gasoducto bioinformáticas, el ARNm transcriptas que resultan de eventos de empalme alternativos se amplifican mediante el uso de RT-PCR y se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. Cyanine tinte verde SYBR como QRT-PCR ensayo verde se utiliza para cuantificar empalme variantes específicas con respecto a un gen de mantenimiento. La Figura 7 representa la estrategia aplicada para visualizar el evento de la omisión del exón 12 del gen ddx5 y para cuantificar la mutuamente excluyentes exón 9 y el exón 10 del gen PKM.
    1. Para el ensayo de RT-PCR, pares de cebadores que hibridan con el diseño exones constitutivos (exón 10 y el exón 13) situados aguas arriba y aguas abajo de los sitios de splicing alternativo (Figura 7A).
      NOTA: El tamaño de amplificación debe cubrir entre 100 y 800 pares de bases con el fin de garantizar una clara separación de los productos de PCR en gel de agarosa predichos. La temperatura de hibridación de los cebadores debe estar entre 55 y 65 ° C y el contenido de GC no debe exceder de 60%.
    2. Ensayo con verde de cianina (Figura 7B).
      1. Compruebe la homología de secuencia de los dos exones que se excluyen mutuamente y el diseño de dos pares de cebadores cada uno de los cuales específicamente y exclusivamente detecta sólo una de las dos variantes de empalme.
        NOTA: Para PKM, el cebador inverso se hibrida con el exón 11 común a ambas variantes, mientras que los cebadores directos son la variante específica y recocido para el exón 9 (PKM1) o el exón 10 (PKM2).
      2. Con el fin de detectar ddx5 gen de longitud completa, fijar el iniciador inverso dentro del exón omitido (exón 12).
        NOTA: Para la detección específica de la variante ddx5 ΔEx12, el cebador inverso se extiende por la frontera exon11 / exon13. Utilice el mismo cebador directo que se hibrida con el exón constitutiva 10 para ambas reacciones.
        NOTA: El tamaño de amplificación debe estar entre 80 y 200 pb.
  2. La primera cadena de cDNA Synthesis
    1. Configurar la transcripción inversa de 1 mg del ARN aislado en ADNc mediante el uso de 200 / l de Virus Moloney de la leucemia murina rever U (M-MLV)se transcriptasa en su tampón de reacción se diluyó 1: 5 con agua estéril. Añadir DTT 1 M, 0,05 g de hexámeros al azar, mezcla de desoxinucleótidos (dNTP) 1 mM, y 40 U / l de inhibidor de ribonucleasa.
    2. Vortex brevemente e incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 2 hr.
    3. Incubar la mezcla de reacción a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa, transferir la mezcla en hielo y girar hacia abajo utilizando una microcentrífuga. Las muestras se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a - 20 ° C.
  3. La reacción RT-PCR en gel de agarosa y
    1. Configurar la reacción de PCR en un tubo de PCR por cada muestra mediante la mezcla de 12,5 l de 2x concentra mezcla maestra de PCR, 1,25 l de 10 mM cebador directo y la misma cantidad para el cebador inverso hasta un volumen final de 25 l con agua estéril.
    2. Añadir 1 l de cDNA a la mezcla y colocar los tubos en el termociclador. Ejecutar el programa de la siguiente manera: desnaturalización inicial: 95 ° C durante 2 min.Reiterar los pasos siguientes durante 35 ciclos: desnaturalización a 95 ° C durante 25 s; recocido a 52 ° C durante 35 s; extensión a 72 ° C durante 1 min. Conjunto de extensión final a 72 ° C durante 5 min.
    3. Preparar 1% en gel de agarosa mediante la disolución de 1 g de agarosa en 100 ml de 1x tampón TBE. Añadir 2,5 l de bromuro de etidio a la solución. PRECAUCIÓN: bromuro de etidio es cancerígeno, manejar con cuidado mediante el uso de una campana de extracción química.
    4. Cargar las muestras y ejecutar el gel en tampón TBE 1x a 100 V durante aproximadamente 30 min en un sistema de electroforesis.
    5. Revelar el gel con una cámara digital UV y guardar la imagen.
  4. QRT-PCR y análisis de datos
    1. Configurar la reacción de PCR verde Cyanine por cada muestra mediante la mezcla de 12,5 l de 2x verde PCR Mastermix, 2 l de cebador directo 5 micras y con la misma cantidad para el cebador inverso hasta un volumen final de 15 l con agua estéril en un tubo de PCR . Preparar una mezcla para cada empalme específicavariante a ser detectado (PKM1, PKM2, ddx5 longitud completa, ddx5 ΔEx12) y para la limpieza de genes (GUS).
    2. Cargar la mezcla maestra en una placa de 96 pocillos blanca y preparar duplicados por cada muestra.
    3. Diluir el ADNc de 10x en agua, añadir 5 l de cada mezcla y colocar la placa en el termociclador. Ejecutar el programa como sigue: desnaturalización inicial: 95 ° C durante 5 min. Reiterar los pasos siguientes durante 45 ciclos: desnaturalización a 95 ° C durante 10 s; recocido a 58 ° C (para ddx5 y ddx5 ΔEx12 mezcla) o 60 ° C (para PKM1 y PKM2 mezcla) durante 20 s. Conjunto de extensión final a 72 ° C durante 20 s. Set de fusión curva mediante la aplicación de un gradiente de 65 a 97 ° C.
    4. Con el fin de evaluar la especificidad de los conjuntos de cebadores a su objetivo, comprobar las curvas de fusión y verificar que un solo pico se forma por cada conjunto de cebadores.
    5. Calcular los segundos valores derivados de las curvas de amplificación y exportar los valores de ciclo umbral (Ct).
    6. Calculate los niveles de expresión relativos (REL) del empalme mRNA variantes en comparación con el servicio de limpieza GUS (de referencia) de genes en cada muestra mediante el método de "delta Ct (Ct)". La fórmula es: REL = 2 -? Ct, donde Ct = Ct diana variante de empalme - gen de referencia Ct
    7. Con el fin de cuantificar la abundancia relativa de variantes de empalme, calcular la relación REL mediante el uso de la fórmula: Relación de REL ratio = REL variante de empalme 1 / REL empalme variante 2.

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Resultados

Los ensayos de citotoxicidad descritos en el protocolo proporcionan un método fiable y robusto para evaluar la resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos in vitro. Mediante el ensayo de MTT, se determinó la sensibilidad a la Dex en cuatro líneas T-ALL de células, incluyendo las células CEM-WT parentales Dex-sensibles, y tres sublíneas Dex-resistentes: CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3. Dos rangos de concentración diferentes tuvieron que ser utilizado debid...

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Discusión

Aquí se describe un nuevo método que combina las técnicas de detección de citotoxicidad bien establecidos y de gran alcance transcriptómica basada en NGS análisis para identificar los eventos de corte y empalme diferencial en relación con la resistencia a fármacos. Ensayos espectrofotométricos son de alto rendimiento métodos convenientes y robustas para evaluar la sensibilidad a fármacos en modelos de cáncer in vitro y representan la primera opción para muchos laboratorios que realizan pruebas de detección de c...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al prof. J.J. McGuire, al prof. R. Kofler y al dr. K. Quint por proporcionar las líneas celulares resistentes utilizadas en este trabajo. El estudio ha sido financiado por subvenciones de la Fundación Cancer Center Amsterdam (CCA) (a JC, EG y RS), la fundación KiKa (Children Cancer-free grant for AW), las Oficinas Legales de Peter G. Angelos Grant de la Fundación de Investigación Aplicada al Mesotelioma (a VEG y EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), y Regione Toscana Bando FAS Salute (a EG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sulforhodamina BSigma-Aldrich230162
Ácido tricloroacéticoSigma-Aldrich251399
CCRF-CEMATCC, Manassas, VA, EE. UUATCC CCL-119
Panc-1ATCC, Manassas, VA, EE. UUATCC CRL-1469
DMEM alta glucosaLonza, Basilea, Suiza12-604F
RPMI-1640 Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU. 11875093
Suero fetal de bovino y terneroGreiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania758093
sulfato de estreptomicina G de penicilinaGibco, Carlsbad, CA, EE. UU.15140122
Tris(hidroximetil)-aminometanoSigma Aldrich252859
MTT formazanSigma AldrichM2003
Anthos-Elisa-reader 2001Labtec, Heerhugowaard, Países BajosEspectrofotómetro de placas UV-Vis de 96 pocillos
Greiner CELLSTAR Placas de 96 pocillosGreiner/SigmaM0812-100EA
Solución de tripsina/EDTA 100 mlLonza, Basilea, SuizaCC-5012
Matraces de cultivo celular CELLSTAR 25 cm2Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania82051-074
CELLSTAR Matraces de cultivo celular 75 cm3Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania82050-856
Solución salina tamponada con fosfato (NaCl 0,9%)B.Braun Melsungen AG, Alemania362 3140
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Referencias

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