Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Resumen

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Resumen

Las enfermedades autoinmunes se presentan debido a la pérdida de inmunológica auto-tolerancia. Las células T reguladoras (Tregs) son importantes mediadores de la auto-inmunológica tolerancia. Tregs representan aproximadamente el 5 - 10% de la subpoblación de células T CD4 maduro ⁺ en ratones y humanos, con aproximadamente 1 - 2% de esas células T reguladoras que circulan en la sangre periférica. células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en células T reguladoras funcional, que tienen un potencial para ser utilizado para terapias basadas en células de enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos un método para desarrollar antígeno (Ag) Tregs específicos de células iPS a partir de (es decir, IPSC-Tregs). El método se basa en la incorporación del factor de transcripción FoxP3 y un receptor de células T Ag-específico (TCR) en iPSCs y luego diferenciar en células que expresan Notch OP9 estromales ligandos delta-como (DL) 1 y DL4. Después de la diferenciación in vitro, las células T reguladoras IPSC-expresan CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, y Ag-TCR específico y son capaces de responder a la estimulación Ag.Este método se ha aplicado con éxito a la terapia basada en células de la artritis autoinmune en un modelo murino. La transferencia adoptiva de estas Ag-específica IPSC-Tregs en la artritis inducida por Ag (AIA) ratones llevando los tiene la capacidad de reducir la inflamación articular y la inflamación y para prevenir la pérdida de hueso.

Introducción

La artritis autoinmune es una enfermedad sistémica caracterizada por hiperplasia del tejido sinovial y destrucción progresiva del cartílago articular, hueso y ligamentos¹. La generación o función defectuosa de Tregs en la artritis autoinmune contribuye a la inflamación crónica y la lesión tisular porque las Tregs juegan un papel crucial en la prevención del desarrollo de células inmunitarias autorreactivas.

La manipulación de Tregs es una estrategia ideal para el desarrollo de terapias para suprimir la inflamación de una manera dependiente de Ag. Para la inmunoterapia basada en Treg, la especificidad de las Tregs transferidas es importante para el tratamiento de la autoinmunidad en curso². Para exhibir la actividad supresora, las Tregs necesitan migrar y ser retenidas en la región afectada, lo que puede ser dirigido por la especificidad del TCR para el Ag en esa ubicación³. Aunque las Tregs policlonales pueden contener una pequeña población que contiene esta especificidad de Ag de sus TCR, el número de estas Tregs específicas de Ag suele ser bajo. En consecuencia, las terapias celulares que utilizan Tregs policlonales contra trastornos autoinmunes requieren transferencias adoptivas de un gran número de Tregs^4,5. Debido a que las células madre pluripotentes (PSC) tienen la capacidad de convertirse en cualquier tipo de célula, las PSC-Tregs específicas de Ag pueden resultar buenas candidatas para la inmunoterapia basada en Treg. Estudios anteriores han demostrado el desarrollo exitoso de células T derivadas de PSC, incluidas las Tregs^6-8.

Aquí, describimos un protocolo para desarrollar iPSC-Tregs específicas de Ag. Describimos además una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino utilizando dichas Tregs. Este método se basa en la modificación genética de iPSCs murinas con TCRs específicos de Ag y el factor transcripcional FoxP3. A continuación, las iPSC modificadas se diferencian en Tregs específicas de Ag en las células estromales OP9 que expresan las moléculas de ligandos Notch DL1, DL4 y MHC-II (^{I-A b}) en presencia de las citocinas mFlt3L y mIL-7. Estas iPSC-Tregs específicas de Ag pueden producir citocinas supresoras, como TGF-β e IL-10, cuando se estimulan con Ag, y la transferencia adoptiva de dichas Tregs tiene la capacidad de suprimir el desarrollo de AIA en un modelo murino. El protocolo descrito se puede utilizar para desarrollar Tregs específicas de Ag derivadas de células madre para posibles intervenciones terapéuticas.

Protocolo

Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Colegio de la Universidad Estatal de Pensilvania Cuidado de Animales Medicina (IACUC protocolo # 45470) y se realiza de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care.

1. Stem Cell Culture

1. Se incuba una placa de 10 cm con 10 ml de gelatina al 0,1% durante al menos 30 minutos a 37 ° C (incubadora) con el fin de cubrir la placa.
2. Retire la gelatina de la cápsula y la placa 3 x 10 ⁶ irradiadas SNL76 / 7 células e incubar durante un día a 37 ° C (incubadora) utilizando 10% de medio DMEM (10% de FBS y 1% penicilina estreptomicina).
3. Retire el papel de la placa y iPSCs cultivo descongelado sobre el curso / 7 células capa de alimentación SNL76 uso de los medios de IPSC (medio DMEM que contiene 15% de suero fetal bovino, 0,1 mmol / L de los aminoácidos no esenciales, 1 mmol / L de L-glutamina, y 0,1 mmol / L β-mercaptoetanol) ^9. El li células iPS de ratón-MEF-Ng-20D-17ne, que fue inducida a partir de fibroblastos de embriones de ratón por transfección viral retro de Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-Myc, se obtuvo del Dr. Shinya Yamanaka (Instituto de Ciencias Médicas de la frontera, la Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón).
4. Cambiar el soporte en el día 3 por medio nuevo y observar colonias IPSC bajo el microscopio.
   NOTA: Estas colonias son grupos pequeños, brillantes o células redondas con una demarcación clara que muestra la expresión de GFP en un microscopio fluorescente.

2. La diferenciación in vitro de Ag-específicas IPSC-Treg

1. Generar las construcciones a utilizar en la transducción retroviral por sub-clonación de los genes OT-II de TCR y FoxP3 en el plásmido MIDR ¹⁰ vinculado con la auto-escisión de péptido 2A para hacer que el constructo MIDR-TCRα-2A-TCR-2A-FoxP3.
2. Realizar la transducción retroviral ⁹ de iPSCs utilizando células Plat E como la línea celular de empaquetamiento.
3. En el día 0, células ^B de semillas OP9-DL1-DL4-IA adensidad mínima ta de 10 ⁴ células / cm ² mediante el uso de medios de comunicación OP-9 medios de comunicación (α-MEM que contiene 20% de FCS y 2,2 g / L de bicarbonato de sodio. placa 1 x 10 ⁶ células por placa de 10 cm.
4. El día 3, cuando las células ^B OP9-DL1-DL4-IA se convierten en un 80-90% de confluencia, retirar los medios y las semillas de 0,5 - 1 x 10 ⁵ células iPS sobre OP9-DL1-DL4 - IA células ^B en la OP-9 medios de comunicación.
   NOTA: Esto establece el co-cultivo de células iPS en las células ^B OP9-DL1-DL4-IA y es considerado como el día 0 de la diferenciación ^9.
5. El día 5, extraiga el soporte de la placa de 10 cm por aspiración, se lavan las células con 10 ml de PBS 1x, y aspirar el PBS. Añadir 4 ml de 0.25% de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 10 min. Añadir otros 8 ml de medio de IPSC a las células, volver a suspender ellos, y se centrifuga a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   1. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de medio de IPSC. Incubar estas células resuspendidas en un plato fresco 10 cmy volver a la incubadora durante 30 min.
      NOTA: Retire las células alimentadoras ^b OP9-DL1-DL4-IA y mantener las células iPS diferenciadores que flotan en los medios de comunicación. Mantener ^las células ^B OP9-DL1-DL4-IA continuamente para alcanzar el 80 - 90% de confluencia para su posterior co-cultivo.
   2. Después de 30 min, recoger las células flotantes, filtrado a través de un filtro de células de 70 m, y contar las células con un hemocitómetro.
6. Seed 5 x 10 ⁵ de iPSCs a un nuevo máximo 80 - 90% confluente de células ^B OP9-DL1-DL4-IA en los medios OP9. Suplemento los medios de comunicación con mFlt-3L a una concentración final de 5 ng / ml.
7. En el día 8, recoger iPSCs diferenciadas parcialmente por lavado de la placa con los medios de comunicación de la propia cápsula, utilizando una pipeta de 10 ml. Utilice otros 5 ml de OP-9 medios de comunicación en el plato para lavar suavemente las células semi-adherentes por cuidado de pipeteado, contundente a fin de no romper la monocapa OP9 en la parte inferior del plato. Repetir el lavado con 10 ml de PBS para cosechar todos los semi-adherent diferenciación de las células.
   1. Combinar ambos lavados, centrifugar a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente, volver a suspender en 10 ml de medio OP9 contiene mFlt-3L (5 ng / ml) y mIL-7 (1 ng / ml), y filtrar con un 70 filtro de células micras.
8. Transferencia de las células en una placa de cultivo de 6 pocillos que contiene 80 - 90% confluente OP9-DL1-DL4-IA ^b células, como en el paso 1.1. La transferencia de células cosechadas a partir de una placa de 10 cm en un pocillo de la placa de 6 pocillos.
9. En el día 10, el cambio medio de los medios de comunicación de las células a los medios OP9 fresco suplementado con mFlt-3L (5 ng / ml) y mIL-7 (1 ng / ml). Repita este paso cada dos días.
10. Cada 4-6 días, dependiendo del crecimiento, re-semilla de las células iPS diferenciadores sobre las placas con una nueva capa de células ^B OP9-DL1-DL4-IA, tal como se describe en el paso 1.1.

3. Evaluación in vitro de diferenciación y maduración Treg

1. Los cambios morfológicos de células iPS diferenciadores.
   1. Mesnitor el co-cultivo de células iPS con células ^B OP9-DL1-DL4-IA cotidiana mediante la observación de células vivas con un microscopio de campo claro convencional (20X). Durante el día 5, observar las colonias con características similares a mesodermo, tales como células aplanadas. En el día 8, observar pequeños grupos de células redondas, que representan células que se diferencian.
   2. Utilice el método de exclusión de azul de tripano para contar las células para detectar el número y el porcentaje de células vivas. Calcular la viabilidad celular como el número de células viables dividido por el número total de células dentro de las cuatro rejillas en el hemocitómetro. Si las células se ocupan de azul de tripano, considerarlos muertos o no viables. Registre el número de células vivas recolectadas a partir del cultivo.
2. La citometría de flujo análisis de la diferenciación de células iPS.
   1. En los días 5, 7, 11, 15, 19, 21, y 28 de co-cultivo, eliminar las células con 0,25% de tripsina como en el paso 25.
   2. Antes de la tinción de la superficie con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo, incubate 1 x 10 ⁶ células con 100 l de Fc 2.4G2 bloqueador diluido en PBS (concentración final 10 mg / ml) a 4 ° C durante 20 min para evitar la unión del anticuerpo al receptor de Fc en la superficie celular.
   3. En los días 5, 7, 11, 15, 19, 21, y 28, usar 1 x 10 ⁶ células por citometría de flujo con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo para detectar los marcadores de superficie celular, incluyendo CD3, TCR, CD4, CD8, CD25, y CTLA4.
   4. A continuación del bloque Fc, lavar las células con 10 ml de PBS y mancha con diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo durante 20 minutos a 4 ° C, y luego realizar el análisis de citometría de flujo con el 15-color de citómetro de flujo. Utilice 0,200 g de anticuerpo por 10 ⁶ células diluidas en 100 l de PBS.
   5. En el día 28, analizar las células por citometría de flujo ¹¹ y la puerta a ⁺ células CD4 CD8 ⁺ utilizando CD4 y CD8 tinción conjugado a un fluorocromo; analizar para la expresión de TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, Y FoxP3 (Figura 1). Para la tinción de FoxP3, fijar las células y permealize ellos y luego realizar la tinción de anticuerpos ^11.
3. En la estimulación antigénica in vitro de iPSCs.
   1. En el día 28 de co-cultivo, cosecha IPSC-Treg a partir de cultivos mediante la recopilación de las células flotantes. Tripsinizar el resto de las células con 0,25% de tripsina (como en el paso 2.5) y volver a suspender las células en 8 ml de medio de IPSC. Se centrifuga durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente, aspirar los medios de comunicación, y de nuevo volver a suspender las células en 10 ml de medio.
      1. Se incuban las células se resuspendieron en una nueva placa de 10 cm a 37 ° C durante 30 min y recoger las células flotantes. Se lavan las células con PBS frío.
   2. Incubar 3 x 10 ⁶ esplenocitos a partir de bazos de C57BL / 6 Rag1 - / - ratones con 5 mM péptido de ovoalbúmina en 200 l de los medios de comunicación (OVA _323-339) a 4 ° C durante 30 min en una placa de 96 pocillos ^11.
   3. Mezclar las células T reguladoras con OVA _323-339 -pulsed esplenocitos en una proporción de 1: 4 (utilizan 0,75 x 10 ⁶ células T reguladoras). Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ durante 40 h. En la última de 4 horas, añadir 4 l de diluirse Brefeldina A en la cultura (1.000 x concentración real, se diluyó en medio de cultivo 1x).
   4. Células de la cosecha con 0,25% de tripsina (como en el paso 2.5), lavar con 10% NaN ₃ y una solución de 0,5 M EDTA (tampón FACS), el bloque con 100 l de diluido (concentración final 10 mg / ml) Fc 2.4G2 bloqueador, y las manchas para los marcadores de superficie, CD4, CD8, TCRVα2, y TCRVβ5 como en los pasos 3.2.3-3.2.4.
   5. Fijar las células con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS y permeabilizar con 100 l de tampón de permeabilización 1x después de la tinción de la superficie celular. ¡Atención! El paraformaldehído es alergénico, carcinogénico y toxicidad.
   6. Teñir las células con fluorocromo conjugado con TGF-β y IL-10 durante 20 min en la oscuridad. Utilice 0,200 g de anticuerpo / 10 ⁶ células diluted en 100 l de PBS. Detectar la producción intracelular de TGF-β y IL-10 con el 15-color de citómetro de flujo (Figura 2).
   7. Se lavan las células tres veces con tampón FACS frío antes del análisis de citometría de flujo ^11.
4. Persistencia in vivo de Ag-específica IPSC-Treg.
   1. Después de 8 días de co-cultivo de células ^B OP9-DL1-DL4-IA, transferir IPSC derivados de pre-células T reguladoras (Thy 1.2) como en el paso 3.3.1 en Tus 1.1 congenic ratones (4-6 semanas de edad) a través de una inyección en la vena de la cola sin anestesia. Antes de realizar la inyección en la vena de la cola, dilatar la vena de la cola usando una lámpara de infrarrojos para 5 min. Después de la dilatación de la vena de la cola, colocar el ratón en un retenedor y la transferencia adoptiva 3 x 10 ⁶ células se volvieron a suspender en 200 l de PBS mediante la inyección a través de la vena de la cola.
   2. Seis semanas después de la transferencia de Treg, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO ₂ seguido por dislocación cervical. Asegúrese de que el mice no está respirando. Abra la cavidad peritoneal mediante la reducción de la piel exterior del peritoneo usando tijeras y pinzas y suavemente tirando de él hacia atrás para exponer la piel interior que recubre la cavidad peritoneal. Aislar el bazo y los ganglios linfáticos periféricos de Thy 1.1 congenic ratones inyectados.
   3. Recoger las células de los ganglios linfáticos y bazo utilizando rotura mecánica para producir una única suspensión celular. Se incuban las células con 5 ml de tampón de lisis ACK de 5 min a TA para lisar las células rojas de la sangre. Recoger y lavar los esplenocitos o linfocitos restantes con 10 ml de tampón FACS frío.
   4. Tras el lavado, el tratamiento de células con el bloqueador de 2.4G2 Fc a 4 ° C durante 20 min como en el paso 3.2.2 y mancha con 100 l de anticuerpos anti-Thy 1.2 conjugados con fluorocromo diluidos.
   5. Lavar las células con 10 ml de tampón de FACS y proceder a análisis de citometría de flujo ^11.

4. En Vivo Maduración y represión de la artritis autoinmune

1. Generar las construcciones como en el paso 2.1.
2. Realizar la transducción retroviral ⁹ como en el paso 2.2.
3. En la diferenciación in vivo y la inducción de artritis en ratones.
   1. Diferenciar OT-II TCR / CMPI FoxP3 transducidas (OT-II-FoxP3 / iPSCs), iPSCs FoxP3 transducidas, y DsRed iPSCs transducidas en las células ^B del estroma OP9-DL1-DL4-IA en la presencia de citoquinas mFlt-3L y mIL-7 durante 8 días como se describe en los pasos 2.1 - 2.6.
   2. Trypisinize los tres tipos de células de la placa de 10 cm y células de cada placa de 10 cm volver a suspender en 10 ml de medio fresco. Añadir a las células a una placa fresca 10 cm y volver al incubador durante 30 min. Después de 30 min, recoger las células flotantes.
   3. Pasar las células a través de un filtro de células de 70 micras para eliminar grupos de células y contar con un hemocitómetro. Ajustar las células a una concentración de 1,5 x 10 ⁷ células / ml en PBS frío y filtrar de nuevo si es necesario. Mantener las células en hielo hasta que la transferencia adoptiva de células en ratones.
   4. Inyectar 200 l de la suspensión celular (3 x 10 ⁶ células) en tres diferentes grupos de 4 a 6 semanas de edad, ratones C57BL / 6 hembra a través de la vena de la cola como se describe en 3.4.1
   5. En el día 10 después de la transferencia de células, inyectar ratones con 100 mg de mBSA emulsionado en adyuvante completo de Freund en la base de la cola mediante el uso de una jeringa de 1 ml.
   6. En el día 17, anestesiar a los ratones utilizando un vaporizador de isoflurano (de acuerdo con las directrices del IACUC). Utilizar 4-5% de isoflurano para la inducción y 1 - 2% para el mantenimiento. Inducir artritis mediante inyección intraarticular de 20 mg mBSA en 10 l de PBS en la rodilla izquierda y conjunta de 20 mg y 100 mg mBSA toda OVA en 10 l de PBS en la articulación de la rodilla derecha. Alimentos y un gelpack se pueden colocar en el suelo después de ropa de cama de la artritis se ha desarrollado. Los ratones se sometieron a eutanasia: la condición corporal (BCS) de 2/5 o moribundos, caquexia severa y / o decúbito persistente (un período de 24 horas), y la puntuación de la gravedad 4. En la puntuación4, eritema y tumefacción severa abarcan el tobillo, el pie y los dígitos, o anquilosis de la extremidad.
4. Caracterización de las células iPS OT-II TCR / transducidas Foxp3.
   1. Utilizar un microscopio de fluorescencia (20X) para visualizar las células DsRed ⁺ GFP ⁺ en vivo no fijadas.
   2. Examinar la integración y expresión génica tanto por Western blot y citometría de flujo ^11.
5. el desarrollo y la maduración Treg.
   1. En las semanas 2, 4 y 6 después de la transferencia de células, la eutanasia a los ratones. Para la eutanasia, en cada jaula usar 1 - 2 litros de CO ₂ en la primera etapa. Una vez que el animal ha perdido el conocimiento, aumentar la velocidad de flujo de _CO2 en un 4 - 5 L / min. La eutanasia a los ratones por inhalación de _CO2. Aislar el bazo y drenar los ganglios linfáticos cortando la piel exterior del peritoneo usando tijeras y pinzas y suavemente tirando de él hacia atrás para exponer la piel interior que recubre la cavidad peritoneal.
   2. Recoger la suspensión de células individuales from el bazo y los ganglios linfáticos por avería mecánica usando un filtro de células y una jeringa de 1 ml en 1% de medios IPSC. Centrifugar el tubo cónico que contiene los medios de comunicación a 400 g durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 5 ml de tampón de lisis ACK para lisar las células rojas de la sangre. Re-centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular y se lavan los esplenocitos o linfocitos restantes con tampón FACS frío. Siga los pasos 3.4.4 - 3.4.5 y proceder a fluir el análisis de citometría.
6. tinción intracelular.
   1. En el día 50 después de la estimulación, aislar el bazo y drenar los ganglios linfáticos de los ratones (como en el paso 4.5.1) después de la eutanasia mediante inhalación de _CO2, seguido por dislocación cervical.
   2. Recoger la suspensión de células individuales a partir del bazo y los ganglios linfáticos por avería mecánica usando un filtro de células y una jeringa de 1 ml. Incubar los esplenocitos a temperatura ambiente durante 5 min con 5 ml de tampón de lisis ACK para lisar las células rojas de la sangre. Recoger y lavar los restantes splenocytes o linfocitos con tampón FACS frío. Siga los pasos 3.2.3 - 3.2.4, pero se tiñen con los marcadores de superficie CD4, CD8, CD25, y TCRVβ5.
   3. Procede a fijar las células para la tinción intracelular como se describe en 3.3.5 - 3.3.7 y analizar la producción intracelular de citoquinas (TGF-β e IL-10) de células T reguladoras derivadas de IPSC y la puerta a las células en vivo CD4 ⁺ CD25 ^+.
7. La infiltración de células T reguladoras Ag-específicas en las rodillas y la supresión de la artritis.
   1. Siguiendo los pasos (4.3 - 4.3.6) en los días 7 - 14 de inducción después de la artritis, la eutanasia a los ratones por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical (de acuerdo con las directrices del IACUC). Eliminar el vello de las rodillas con una maquinilla eléctrica y extirpar las rodillas por el procedimiento quirúrgico.
   2. Quitar la piel de las piernas al hacer una incisión en la pata trasera con unas tijeras de punta roma y cortar la piel a través del muslo y hasta el tobillo. Con cuidado, la piel sobre la pierna y el pie para exponer el músculo. retirarel músculo de la pierna con cuidado, sin dañar la articulación de la rodilla.
      1. Cortar la pata trasera justo por encima de la articulación de la pelvis / cadera y cortar la tibia usando las tijeras de disección afilados.
   3. Fijar las rodillas en formalina al 4% durante 48 horas. Decalcify las rodillas mediante el uso de ácido fórmico 2,5 M; enjuagar tres veces en xileno durante 3 min, enjuague dos veces en etanol al 100%, enjuague dos veces en etanol al 95%, enjuague dos veces en agua desionizada durante 2 min, y descalcificar en EDTA 1 mM. Tratar a una temperatura sub-ebullición (90 ° C) durante 20 min.
   4. Enfriar el tejido fijado durante 30 min. Enjuagarlo con 1x PBS durante 4 min y incrustarla en parafina. Deshidratar los tejidos a través de una serie de baños de etanol para desplazar el agua y, a continuación, infiltrarse con cera. Luego integrar los tejidos infiltrados en bloques de cera. Realizar tanto de corte vertical y horizontal para la tinción. Preparar 4 micras secciones con un micrótomo de deslizamiento.
   5. Realizar la tinción de inmunofluorescencia de las secciones después de procedimientos estándar de deparaffización y la rehidratación utilizando xileno y etanol ^12.
   6. Bloquear la actividad peroxidasa endógena mediante la inmersión de la corredera en una cantidad suficiente de solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 3 min después de la recuperación de Ag. diapositivas de bloque para la unión no específica en el 3% de BSA en PBS a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante 60 minutos.
   7. secciones se tiñen con 200 l de anticuerpo conjugado a un fluorocromo TCRVβ5 diluidos 1: 100 en la solución de bloqueo. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en un 75 - 100% cámara humidificada, y se lava 5 veces en 1X PBS durante 5 min.
   8. CONTRATINCIÓN los portaobjetos para tinción nuclear con un reactivo que contiene DAPI antifade. Añadir aproximadamente 300 l de la solución de tinción DAPI diluido (300 nM en 1X PBS) al cubreobjetos, asegurándose de que toda cubreobjetos está cubierto. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3).
8. ensayo de supresión de la artritis
   1. Medir la hinchazón de las rodillas de los ratones antes de la inducción de la artritis mediante el uso de un calibrador de línea de calibre para establecer una línea de base.
   2. Siga los pasos (4.3 - 4.3.6) para la inducción de la artritis y la transferencia de Treg. Medir las rodillas de ratón con una línea de vía de transferencia de pinza post-Treg.
   3. Calcular el porcentaje de aumento en el diámetro de la rodilla: por ciento de aumento = (diámetro de la rodilla en el día 1 - diámetro de la rodilla en el día 0) / diámetro de la rodilla en el día 0.
9. La medición de la destrucción de las articulaciones y la infiltración de células inflamatorias en las rodillas por la histología (Figura 4).
   1. En el día 7 después de la inducción-artritis, la eutanasia a los ratones como se describió anteriormente y extirpar las rodillas por el procedimiento quirúrgico. Vea el paso 4.7.1 - 4.7.2.
   2. Fijar las rodillas en formalina al 4%, decalcify en EDTA, e incrustar en parafina. Vea el paso 4.7.3
   3. Retire las dos rodillas, fijar en formol al 10%, y se calcifican en Formical-4. Incrustar los tejidos en parafina, sección a 4 micras, y la mancha con hematoxyly eosina (H & E) o safranina O tinción (como en el paso 4.7.7) y observar con un microscopio.
   4. Utilice tinción H & E para evaluar la erosión del hueso con un sistema de puntuación semicuantitativo (0: no hay erosiones; 4: erosiones extendidas y destrucción del hueso). Utilice safranina O tinción para evaluar la pérdida de proteoglicanos y la puntuación con un sistema de puntuación semicuantitativo (0: no pérdida de proteoglicanos; 3: pérdida completa de la tinción de los proteoglicanos).
      1. Utilice un sistema de puntuación semicuantitativo para anotar la infiltración de células inflamatorias en portaobjetos H & E manchadas (0: sin infiltración celular; 4: abundado infiltración de células). Evaluar las puntuaciones mediante el examen de las dos rodillas en una forma ciega.

5. La medición de la pérdida ósea en las rodillas con el sistema computado-micro-tomografía de alta resolución (micro-CT)

1. En el día 10 después de la inducción-artritis, anestesiar a los ratones con isoflurano al 2% y prepararse para la imagen.
2. posición del micrófonoe con las rodillas hacia arriba en la cámara.
3. Utilice un sistema de micro-CT de alta resolución para adquirir imágenes in vivo de la arquitectura de hueso alrededor de las rodillas de los ratones.
4. Realizar análisis de micro-CT con una longitud de 2,2 mm, incluyendo las articulaciones de rodilla de ratón con los siguientes parámetros: 10,5 micras de tamaño de voxel a 55 kv, 145 mu 200 ms de tiempo de integración, 211 imágenes.
5. Importación de imágenes de micro-CT y captura imágenes planas frontal tras su posterior procesamiento de imágenes (representación de volumen y transformación) (Figura 5).

Resultados

Como se muestra aquí, en el día 28, Ag-específica Tregs expresa sustancialmente CD3 y Ag-específica TCR, dos marcadores de células T. La población CD3 ^{+ +} TCRVβ5 expresa CD4. La mayoría de las células CD3 ⁺ CD4 ⁺ TCRVβ5 ⁺ también expresan CD25, CD127, y CTLA-4, que se expresan típicamente en niveles elevados en origen _{natural, reglas} T (nTregs) y en células T que expresan FoxP3 ectópica. FoxP3 expresión en las células deri...

Discusión

En este protocolo, un paso crítico es la diferenciación in vitro de TCR / FoxP3 iPSCs de genes transducidos. In vitro de señalización Notch induce el desarrollo hacia el linaje de células T. Para diferenciar células iPS en CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ células T reguladoras, hemos utilizado las células ^B OP9-DL1 / DL4 / IA, que MHC II (IA ^b) moléculas altamente exprés. La mayoría de las iPSCs se diferencian en células CD4 ^+. Sin embargo, después de la expresión de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones C57BL/6j	Laboratorio Jackson	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Laboratorio Jackson	2216
Anticuerpo anti-CD3 (2C11)	BD Pharmingen	553058
Anticuerpo anti-CD28 (37.51)	BD Pharmingen	553295
Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5)	Biolegend	100417
Anti-CD8 ( 53 y ndash; 6.7) anticuerpo	Biolegend	100714
Anti-CD25 (3C7)	Anti-101912
Biolegend Anti-TCR-β (H57597) anticuerpo	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Ciencia integrada	204130
Tampón de lisis ACK	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatina	Sigma	G9391
Paraformaldehído	Sigma	P6148-500G	Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico
Tampón de permeabilización	Biolegend
mBSA	Sigma	A7906
Albúmina de óvulos	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Restrainer Braintree	scientific	RTV 150-STD