Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.
Artículo de método
Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.
Las enfermedades autoinmunes se presentan debido a la pérdida de inmunológica auto-tolerancia. Las células T reguladoras (Tregs) son importantes mediadores de la auto-inmunológica tolerancia. Tregs representan aproximadamente el 5 - 10% de la subpoblación de células T CD4 maduro + en ratones y humanos, con aproximadamente 1 - 2% de esas células T reguladoras que circulan en la sangre periférica. células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) pueden diferenciarse en células T reguladoras funcional, que tienen un potencial para ser utilizado para terapias basadas en células de enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos un método para desarrollar antígeno (Ag) Tregs específicos de células iPS a partir de (es decir, IPSC-Tregs). El método se basa en la incorporación del factor de transcripción FoxP3 y un receptor de células T Ag-específico (TCR) en iPSCs y luego diferenciar en células que expresan Notch OP9 estromales ligandos delta-como (DL) 1 y DL4. Después de la diferenciación in vitro, las células T reguladoras IPSC-expresan CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, y Ag-TCR específico y son capaces de responder a la estimulación Ag.Este método se ha aplicado con éxito a la terapia basada en células de la artritis autoinmune en un modelo murino. La transferencia adoptiva de estas Ag-específica IPSC-Tregs en la artritis inducida por Ag (AIA) ratones llevando los tiene la capacidad de reducir la inflamación articular y la inflamación y para prevenir la pérdida de hueso.
La artritis autoinmune es una enfermedad sistémica caracterizada por hiperplasia del tejido sinovial y destrucción progresiva del cartílago articular, hueso y ligamentos1. La generación o función defectuosa de Tregs en la artritis autoinmune contribuye a la inflamación crónica y la lesión tisular porque las Tregs juegan un papel crucial en la prevención del desarrollo de células inmunitarias autorreactivas.
La manipulación de Tregs es una estrategia ideal para el desarrollo de terapias para suprimir la inflamación de una manera dependiente de Ag. Para la inmunoterapia basada en Treg, la especificidad de las Tregs transferidas es....
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Todos los experimentos con animales han sido aprobados por el Colegio de la Universidad Estatal de Pensilvania Cuidado de Animales Medicina (IACUC protocolo # 45470) y se realiza de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care.
1. Stem Cell Culture
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Como se muestra aquí, en el día 28, Ag-específica Tregs expresa sustancialmente CD3 y Ag-específica TCR, dos marcadores de células T. La población CD3 + + TCRVβ5 expresa CD4. La mayoría de las células CD3 + CD4 + TCRVβ5 + también expresan CD25, CD127, y CTLA-4, que se expresan típicamente en niveles elevados en origen natural, reglas T (nTregs) y en células T que expresan FoxP3 ectópica. FoxP3 expresión en las células deri.......
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En este protocolo, un paso crítico es la diferenciación in vitro de TCR / FoxP3 iPSCs de genes transducidos. In vitro de señalización Notch induce el desarrollo hacia el linaje de células T. Para diferenciar células iPS en CD4 + FoxP3 + células T reguladoras, hemos utilizado las células B OP9-DL1 / DL4 / IA, que MHC II (IA b) moléculas altamente exprés. La mayoría de las iPSCs se diferencian en células CD4 +. Sin embargo, después de la expresión de.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Este proyecto fue financiado, en parte, en virtud de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI121180, R21AI109239 y K18CA151798), la Asociación Americana de la Diabetes (1-16-IBS-281), y el Departamento de Salud de Pensilvania (Fondos del Acuerdo de Tabaco) a JS
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones C57BL/6j | Laboratorio Jackson | 664 | |
| B6.129S7 Rag1tm1Mom/J | Laboratorio Jackson | 2216 | |
| Anticuerpo anti-CD3 (2C11) | BD Pharmingen | 553058 | |
| Anticuerpo anti-CD28 (37.51) | BD Pharmingen | 553295 | |
| Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5) | Biolegend | 100417 | |
| Anti-CD8 ( 53 y ndash; 6.7) anticuerpo | Biolegend | 100714 | |
| Anti-CD25 (3C7) | Anti-101912 | ||
| Biolegend Anti-TCR-β (H57597) anticuerpo | Biolegend | 109220 | |
| Anti-IL10 | Biolegend | 505010 | |
| Anti-TGFβ | Biolegend | 141402 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| Genejammer | Ciencia integrada | 204130 | |
| Tampón de lisis ACK | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | peprotech | 217-17 | |
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148-500G | Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico |
| Tampón de permeabilización | Biolegend | ||
| mBSA | Sigma | A7906 | |
| Albúmina de óvulos | Avantor | 0440-01 | |
| CFA | Difco | 2017014 | |
| Restrainer Braintree | scientific | RTV 150-STD |
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