Producción simple y eficiente y purificación de ratón mielina de oligodendrocitos de la glucoproteína de la encefalomielitis autoinmune experimental Estudios

Resumen

Describimos un protocolo simple utilizando solo equipos básicos de laboratorio para generar y purificar grandes cantidades de una proteína de fusión que contiene glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de ratón. Esta proteína se puede utilizar para inducir encefalomielitis autoinmune experimental impulsada por células T y B.

Resumen

< clase p='jove_content'>La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC), que se cree que ocurre como resultado de respuestas autoinmunes dirigidas a la mielina. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más común de enfermedad autoinmune del SNC, y generalmente se induce a través de la inmunización con péptidos cortos que representan epítopos de células T CD4⁺ inmunodominantes de proteínas mielina. Sin embargo, las células B reconocen directamente las proteínas no procesadas, y la inmunización con péptido corto no activa las células B que reconocen la proteína nativa. Dado que los ensayos clínicos recientes de terapias de agotamiento de células B en la EM han sugerido un papel de las células B en la conducción de la enfermedad en los seres humanos, existe una necesidad urgente de modelos animales que incorporen el reconocimiento de autoantígenos por parte de las células B. Con este fin, hemos generado una nueva proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de la versión de ratón de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), así como fusiones N-terminales de una etiqueta His con fines de purificación y la proteína tiorredoxina para mejorar la solubilidad (_etiqueta MOG). Se incorporó un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) para permitir la eliminación de todas las secuencias de marcas, dejando solo el dominio extracelular MOG_1-125 puro. Aquí, describimos un protocolo simple que utiliza solo equipos de laboratorio estándar para producir grandes cantidades de_etiqueta MOG pura o MOG_1-125. Este protocolo genera constantemente más de 200 mg de proteína_{de etiqueta} MOG. La inmunización con_{la etiqueta} MOG o MOG_1-125 genera una respuesta autoinmune que incluye células B patógenas que reconocen el MOG nativo del ratón.

Introducción

MS es una enfermedad humana caracterizada por la inflamación crónica y la neurodegeneración del CNS que se piensa para ser accionado por una respuesta autoinmune dirigida hacia la mielina. La pérdida de mielina y axones a través del tiempo como resultado la disminución gradual de la función cognitiva y motora ^1. "Encefalomielitis autoinmune experimental" es un término general para los modelos animales de enfermedad autoinmune dirigida hacia la mielina del SNC. Como MS humanos, EAE se caracteriza típicamente por la infiltración de células inmunes del sistema nervioso central y, en algunos casos, la desmielinización ^2. Sin embargo, el grado en que....

Protocolo

1. La inducción de proteínas

NOTA: En los pasos siguientes, las bacterias BL21 de Escherichia coli transformadas con un vector pET-32 que contiene la secuencia para la proteína de fusión _tag MOG (véase la referencia ⁵ y la Figura 1) se cultivan a altas densidades y luego se inducen para expresar la proteína _tag MOG . Vea la Figura 2 para la línea de tiempo general - en cuenta que los días son puntos de parada aproximados y suplentes se indican en el protocolo. Si a partir de ADN pET-32 MOG _etiqueta vector purificado, será necesario transformar químicament....

Resultados

Una vez que la purificación es completa, las muestras recogidas en los pasos 1.4, 2.1, 3.4, y el producto final de la etapa 6.4 se deben ejecutar en un gel de proteína (Figura 3A). MOG _etiqueta debe aparecer en primer lugar como una banda de 31,86 kDa en la muestra T _{/ N,} pero no t _0, y debe ser la única banda en el producto puro final. Para probar si la proteína _tag MOG ha plegado correctamente, la proteína _tag MOG .......

Discusión

Aquí, hemos descrito un protocolo para la producción de proteína MOG _etiqueta y cómo generar MOG _1-125 pura de la proteína MOG _etiqueta. Este protocolo se basa tanto en los métodos estándar His-tag base de purificación de proteínas, así como un protocolo previamente descrito para la generación de una proteína de más edad a base de MOG ^15. A pesar de que no se describe aquí, el uso principal de la proteína _etiqueta MOG es inducir EAE mediante inmunización con antígen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Estas bacterias son necesarias para producir la proteína MOGtag. Las reservas de glicerol de estas bacterias están disponibles a pedido.
LB caldo miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicilina	bio básica	AB0028	Reconsimetriza el polvo en 50% etanol / 50% H2O a 100 mg/ml. Almacenar a -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconozca el polvo en H2O a 1M y almacene a -20 °C.
Lisozima de gallina-huevo	Bioshop	LYS702.10	Reconstituir en H2O a 50 mg/ml y almacenar a -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Tecnologías de vida	salina tamponada con fosfato	20012-027	No se requiere solución salina tamponada con fosfato comercial, cualquier solución salina tamponada con fosfato estándar hecha en laboratorio es suficiente.
Cloruro de sodio	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazol	Bioshop	IMD508.100
Guanidina-HCl	Sigma	G3272	La calidad debe ser superior al 98% de pureza.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Sulfato de níquel (II)	Bioshop	NIC700.500
Su resina aglutinante	EMD Millipore	69670-3	Almacenamiento en 20% etanol 80% H2O a 4 & grados; C
Etanol anhidro	Alcoholes comerciales	P016EAAN	diluir con agua según sea necesario.
Ácido acético glacial	Bioshop	ACE222.1
Acetato de sodio trihidrato	Bioshop	SAA305.500
albúmina sérica bovina estándar	Bio-Rad	500-0206
Bio-rad Ensayo de proteínas Bio-rad concentrado de reactivo de colorante	Bio-Rad	500-0006
Etilendiamina ácido tetraacético, sal disódica dihidratada	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Tubo de diálisis de piel de serpiente	Thermoscientific	68700
2-mercaptoetanol	Sigma	M3148-25ml	Este reactivo no debe manipularse fuera de una campana extractora.
AcTEV proteasa	lifetechnologies	12575-015	La producción de su propia proteasa TEV se puede lograr utilizando (https://www.addgene.org/8827/) y purificada como en la referencia 17
Polietilenglicol 3350	Bioshop	PEG335.1
polietilenglicol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp de fondo plano placa de 96 pocillos	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon espectrómetro de microplacas	Biotek	11-120-611	Este equipo utiliza el software de análisis de datos Gen5.
software de análisis de datos Gen5	BioTek
dodecil sulfato de sodio	Bioshop	SDS001
azul de bromofenol		Bioshop BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Columnas de desalinización de proteínas	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
prefabricado 12% poliacrilamida gel	bio-rad	456-1045
Reactivo de tinción rápida	EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Bandeja	de muestras bio-rad 1708272		Se utiliza junto con el generador de imágenes EZ de base de gel para manchas azules de coomassie
Escalera de proteínas	bio-rad	1610375