Method Article

Un protocolo optimizado para el radiomarcaje eficaz de nanopartículas de oro mediante el uso de una 125 Azida grupo prostético marcado con I

DOI:

10.3791/54759

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October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un procedimiento detallado para la síntesis de una azida marcado con I125 y el radiomarcado de dibenzocyclooctyne (DBCO) -grupo-conjugados, las nanopartículas de oro de 13 nm de tamaño utilizando una reacción clic libre de cobre.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, demostramos un protocolo detallado para la radiosíntesis de un grupo protésico de azida marcado con 125I y su aplicación al radiomarcaje eficiente de nanopartículas de oro funcionalizadas con el grupo DBCO utilizando una reacción de clic sin cobre. La radioyodación del precursor estanilado (2) se llevó a cabo utilizando [125I]NaI y cloramina T como oxidante a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la purificación del producto crudo por HPLC, se obtuvo la azida marcada con 125I purificada (1) con un alto rendimiento radioquímico (75 ± 10%, n = 8) y una excelente pureza radioquímica (>99%). Para la síntesis de nanopartículas de oro radiomarcadas de 13 nm de tamaño, las nanopartículas de oro funcionalizadas con DBCO (3) se prepararon utilizando un polímero de polietilenglicol tiolado. Una reacción de clic sin cobre entre 1 y 3 dio a las 125nanopartículas de oro marcadas con I (4) con más del 95% de rendimiento radioquímico determinado por cromatografía de capa radiofina (radio-TLC). Estos resultados indican claramente que el método actual de radiomarcaje que utiliza una reacción de clic libre de cobre promovida por deformación será útil para el radiomarcaje eficiente y conveniente de nanomateriales que contienen el grupo DBCO.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La reacción de clic sin cobre promovida por tensión entre azidas y ciclooctinos se ha aplicado ampliamente al etiquetado bioortogonal eficiente de una amplia gama de biomoléculas, nanomateriales y sujetos vivos1-7. Debido a la excelente especificidad del sitio y la rápida velocidad de reacción de esta reacción de conjugación, también se ha utilizado para sintetizar trazadores radiomarcados. Se han preparado unos pocos 18grupos protésicos de azida o DBCO marcados con F para el marcaje in vitro de varios cánceres dirigidos a péptidos y anticuerpos, así como para la obtención de imágenes predirigidas in vivo de tumores8-13. Además de estos ejemplos, la misma reacción de conjugación se aplicó al marcaje de radioisótopos metálicos de nanomateriales para estudios de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET)14-16.

Durante varias décadas, los yodos radiactivos se han utilizado para la investigación biomédica y los ensayos clínicos a través de imágenes PET (124I), imágenes de tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT) (123I, 125I) y tratamiento del cáncer de tiroides (131I)17-21. Por lo tanto, un método eficiente para el marcaje de yodo radiactivo es fundamentalmente importante para diversas investigaciones, incluidos los estudios de imágenes moleculares, el análisis de la distribución de biomoléculas en los órganos, la identificación de biomarcadores y el desarrollo de fármacos. Se podría utilizar una estrategia de reacción de clic sin cobre en el marcaje de yodo radiactivo. Sin embargo, esta aplicación no se ha investigado tan extensamente como 18biomoléculas marcadas con F22-23. Aquí, proporcionaremos un protocolo paso a paso para la síntesis de una azida marcada con 125I para el radiomarcaje de moléculas derivadas del grupo DBCO. Los procedimientos descritos en el presente informe incluirán la yodación radioactiva del precursor anonimizado, las etapas de purificación con HPLC y la extracción en fase sólida. También demostramos un radiomarcaje eficiente de nanopartículas de oro de 13 nm de tamaño modificadas con el grupo DBCO utilizando la azida marcada con 125I. El protocolo detallado de este informe ayudará a los químicos sintéticos a comprender una nueva metodología de radiomarcaje para la síntesis de productos radiomarcados.

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Protocol

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Precaución: La forma oxidada de yodo radiactivo es bastante volátil y debe ser manejado con escudos de plomo adecuados y viales de plomo. Todos los pasos radioquímica deben llevarse a cabo en una campana con filtro de carbón bien ventilado, y los procedimientos experimentales deben ser supervisados ​​por los dispositivos de detección de radiactividad.

1. Preparación de los productos químicos y el cartucho de fase inversa para la Síntesis de la azida marcado con I125

  1. Preparación de los reactivos en disolución
    1. Disolver 1 mg del precursor de azida (2) en 150 ml de etanol absoluto (Figura 1).
      NOTA: Un procedimiento sintético detallado para el precursor de la azida (2) se informó en el documento anterior 22.
    2. Disolver 1 mg de cloramina T en 20 l de 1x solución salina tampón de fosfato (pH = 7,4).
    3. Disolver metabisulfito de sodio 2 mg en 20 l H 2 O.
  2. PREPARAción del cartucho
    1. Lavar el cartucho TC18 con 10 ml de etanol absoluto seguido de 10 ml H 2 O. No seque la matriz del cartucho con el aire.

2. Radiosíntesis de la azida Prótesis Grupo marcado con 125I

  1. Reacción Radioyodación del precursor
    1. Añadir la solución de precursor azida (1 mg en 150 ml de etanol absoluto) y ácido acético (10 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Añadir 150 MBq de [125I] NaI en NaOH 0,1 M (50 l) a la mezcla de reacción.
    3. Añadir una solución de cloramina T (1 mg en 20 l de 1x solución salina tamponada con fosfato) y cierre la mezcla de reacción del tubo de microcentrífuga que contiene.
    4. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min hasta que se complete la reacción de radioyodado.
    5. Añadir una solución de metabisulfito de sodio (2 mg en 20 l H 2 O) a la mezcla de reacciónpara extinguir la reacción de radioyodado.
    6. Retirar 0,2 l de el producto bruto y entonces se diluye con 100 l de solución de (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) para el análisis HPLC.
      NOTA: Para todos los experimentos de HPLC, utilice 0,1% de ácido fórmico que contiene H 2 O (solvente A) y 0,1% de ácido fórmico que contiene acetonitrilo (disolvente B) como eluyentes.
    7. Analizar el producto en bruto se diluyó mediante el uso de una fase inversa analítica de radio-HPLC (columna C18 de fase inversa; velocidad de flujo: 1 ml / min; eluyente en gradiente: 20% de disolvente B para 0-2 min, 20 a 80% de disolvente B para 2-22 min, 80-100% de disolvente B para 22 a 23 min, y 100% de disolvente B para 23 a 28 min; tiempo de retención: 16,4 min) (Figura 2).
  2. La purificación del producto bruto con una HPLC preparativa
    NOTA: proporciona suficiente protección de plomo alrededor de piezas de HPLC tales como el inyector, columna, detector, viales de recogida, y el contenedor en el que se recoge el efluente.
    1. retirar THe toda la mezcla de reacción en un vial de HPLC. Enjuague el tubo de reacción con acetonitrilo (0,5 ml) y añadir el enjuague en el mismo vial de inyección. Se diluye la solución recogida con H 2 O (1 ml).
    2. Inyectar el producto bruto sobre una preparativa de radio-HPLC (columna C18 de fase inversa; caudal: 10 ml / min; gradiente de eluyente: 20% de disolvente B para 0-2 min, 20 a 80% de disolvente B para 2 a 22 min, 80-100% de disolvente B para 22 a 23 min, y 100% de disolvente B para 23 a 28 min).
    3. Se recoge el pico radiactivo que representa la azida marcado con I-125 (1) (tR bajo estas condiciones de HPLC es 17,8-18,8 min) en un tubo de ensayo de vidrio (Figura 2).
    4. Medir el rendimiento radioquímico de la fracción utilizando un calibrador de dosis de radiactividad de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    5. Inyectar el producto purificado en una radio-HPLC analítica usando las mismas condiciones de HPLC para la determinación de la pureza radioquímica del producto.
  3. Extracción en fase sólida del producto
    1. Diluir la fracción que contiene el producto deseado (1) con 40 ml pura H 2 O.
    2. Añadir la solución diluida en un cartucho previamente acondicionado TC18.
    3. Lavar el cartucho con un adicional de 15 ml de H2O
    4. Eluir el producto (1) atrapado en el cartucho con 2 ml de acetona en un vial de vidrio de 10 ml que está protegida por un escudo de plomo. Medir la radiactividad del producto eluido usando un calibrador de dosis de radiactividad de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      NOTA: sulfóxido de dimetilo (DMSO) o etanol absoluto también se pueden utilizar para la elución del producto desde el cartucho. Aproximadamente 5 a 10% de la radiactividad se pega normalmente al cartucho, y el producto radiomarcado restante no puede ser totalmente eluyó mediante el uso de cantidades en exceso de disolvente orgánico.
    5. Se evapora el acetona con una corriente de nitrógeno o gas argón.
    6. Se disuelve el reSIDUE con DMSO (100 a 200 l) para la siguiente etapa de radiomarcaje.

3. Síntesis de DBCO grupo conjugado con nanopartículas de oro

  1. Modificación de la superficie de oro de 13 nm de tamaño nanopartículas con glicol de polietileno que contiene grupos-DBCO
    1. Preparar nanopartículas de oro de sodio-citrato-estabilizado (3) (tamaño promedio = 13 nm) de acuerdo con un informe anterior 24.
    2. Añadir una solución acuosa de Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) a las nanopartículas de oro estabilizadas con citrato (10 nM, 15 ml). Agitar la solución durante 20 min en un agitador orbital.
    3. Añadir una solución acuosa de DBCO que contiene grupo tiol-polietilenglicol (peso molecular promedio = 5000, 100 M, 1,5 ml). Agitar la solución durante 2 horas en un agitador orbital.
  2. La purificación de las nanopartículas de oro DBCO-grupo-modificado
    1. Purificar las nanopartículas de oro DBCO-grupo-modificada (4) </ Strong> por centrifugación sucesivos (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Se decanta el sobrenadante y añadir agua pura para la resuspensión de los sedimentos de nanopartículas de oro.

4. El radiomarcado de DBCO-grupo modificado nanopartículas de oro a través de la libre-Cobre Haga clic Reacción

  1. Síntesis de nanopartículas de oro 125 I-etiquetados utilizando la azida marcado con I-125 (1)
    1. Preparar una solución concentrada de nanopartículas de oro DBCO grupos modificado mediante el uso de centrifugación (11.400 xg, 15 min), y ajustar la concentración de las nanopartículas de oro a 2 mM.
    2. Añadir 4,1 MBq de la azida marcado con I 125 (1) en DMSO (5 l) a una suspensión de nanopartículas de oro (4) (2 M, 50 l).
    3. Incubar la mezcla de reacción resultante a 40 ° C durante 60 min.
    4. Retirar una alícuota (0,2 l) del producto bruto y aplicarlo sobre una sílice-cocromatografía en capa fina ated (TLC) de placa.
    5. Desarrollar la placa de TLC usando acetato de etilo como fase móvil.
    6. Coloque la placa de TLC en un escáner de radio-TLC y ejecutar el escáner para controlar la reacción de radiomarcado (Figura 3) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. La purificación del producto crudo
    1. Se purifica la mezcla de reacción que contiene los 125 nanopartículas marcado con I de oro (4) por centrifugación (11.400 xg, 15 min).
    2. Se decanta el sobrenadante y añadir agua pura para la resuspensión de los sedimentos de nanopartículas de oro.
    3. Retirar una alícuota (0,2 l) a partir del producto purificado y aplicarlo sobre una placa de TLC de sílice recubierto.
    4. Desarrollar la placa de TLC usando acetato de etilo como fase móvil.
    5. Coloque la placa de TLC en un escáner de radio-TLC y ejecutar el escáner para determinar el rendimiento radioquímico y la pureza radioquímica del gol marcado con I125d nanopartículas (4) (Figura 3) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

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Results

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La reacción de radioyodado del precursor estanilado (2) se llevó a cabo utilizando 150 MBq de [125I] NaI, ácido acético, y la cloramina T a temperatura ambiente durante 15 min para proporcionar el producto radiomarcado (1). Después de la purificación por HPLC preparativa de la mezcla de crudo, se obtuvo el producto deseado con 75 ± 10% (n = 8) de rendimiento radioquímico. HPLC analítica reveló que la pureza radioquímica del producto marcado co...

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Discussion

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En general, el rendimiento radioquímico observado de la purificada 125 azida marcado con I (1) fue 75 ± 10% (n = 8). El radiomarcaje se realizó con 50-150 MBq de radiactividad, y los resultados radioquímica son bastante consistentes. Si [125 I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) que se sometió a la desintegración radiactiva durante más de un mes se utilizó en la reacción de radioyodado, se observó el rendimiento radioquímico de 1 a ser disminuido ligeramente ...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Investigación de Corea, financiada por el gobierno de la República de Corea, (subvenciones nos. 2012M2B2B1055245 y 2012M2A2A6011335) y por el Centro RI-Biomics del Instituto de Investigación de Energía Atómica de Corea.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloramina T trihidratoSigma402869
[125I]NaI en aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Metabisulfito de sodio SigmaS9000
Ácido fórmicoSigma251364
Sep-Pak tC18 plus cartuchoWatersWAT036800
Dimetilsulfóxido SigmaD2650
AcetonaSigma 650501
EtanolSigma459844
Cloruro de Oro (III) trihidratoSigma 520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5.000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC gel de sílice 60 F254Merck
HPLC analíticaAgilent1290 InfinityNúmero de modelo
HPLC preparativaAgilent1260 InfinityNúmero
de modelo Columna analítica de fase inversa C18AgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Columna preparativa de fase inversa C18AgilentPrepHT XDB-C18
Radio Escáner TLCBioscanAR-2000Número de modelo
Calibrador de dosis de radioisótoposCapintec, IncCalibrador de dosis CRC -25RNúmero de modelo

References

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