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Summary

evaluación no invasiva de la función endotelial en el ser humano puede ser determinada por la técnica de la dilatación mediada por flujo. Aunque miles de estudios han utilizado esta técnica, ningún estudio ha realizado esta técnica no invasiva en ratas. El siguiente artículo describe la medición no invasiva de la dilatación mediada por flujo en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas.

Abstract

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Introduction

El endotelio vascular es una monocapa celular que recubre el lumen de las arterias y es un regulador importante de la función vascular. Hay numerosas moléculas liberadas desde el endotelio que resultan en la modulación de diámetro del vaso sanguíneo. Entre estas moléculas, el óxido nítrico (NO), que parece ser la molécula vasodilatadora primario liberado del endotelio vascular en respuesta a la estimulación (por ejemplo, insulina, la acetilcolina, o cambios en la tensión de cizallamiento) ^1. En el endotelio vascular, NO es producido por la enzima NO sintasa endotelial (eNOS) y se libera posteriormente a partir de células endoteliales ^2. NO se difunde en el músculo liso vascular donde causa la relajación y el aumento de diámetro recipiente ^3.

La disfunción endotelial se puede evaluar de forma no invasiva en humanos utilizando la técnica de ^4,5 dilatación mediada por flujo (FMD). Fiebre aftosa se ha propuesto para representar un bioensayo funcional para derivado del endotelioNO biodisponibilidad en seres humanos, y se evalúa típicamente en la arteria braquial o femoral superficial en respuesta a la hiperemia reactiva siguiente a ~ 5 min de oclusión del miembro ^6. Hiperemia reactiva aumenta las fuerzas de cizalla laminar que se transducen a la célula endotelial ^7, señalización de una liberación de NO ^8. Aunque en los últimos años, la proporción de la vasodilatación iniciado por la liberación de NO se ha debatido ^9,10, la fiebre aftosa es indicativo de la dilatación dependiente del endotelio y consistentemente se ha demostrado para predecir eventos cardiovasculares ^11-13.

Hasta la fecha, miles de estudios han empleado la técnica de la fiebre aftosa para la medición no invasiva de la función endotelial en los seres humanos. Teniendo en cuenta el reciente cambio en el enfoque de la investigación traslacional, directrices para la medición no invasiva de la fiebre aftosa en los roedores serían extremadamente valiosa. Siguiendo con un enfoque traslacional, se estableció este protocolo para la medición de la fiebre aftosa en braquial y supearterias femorales rficial de ratas, como estos sitios se miden más comúnmente en los seres humanos. Este protocolo da como resultado un sólido y repetible respuesta de la fiebre aftosa en ratas, sin embargo, la medición de la fiebre aftosa en ratas es técnicamente exigente y puede ser difícil para que otros investigadores puedan replicarse sin demostración en vídeo. Por lo tanto, el siguiente artículo demostrará un método para la medición no invasiva de la fiebre aftosa en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas.

Protocol

Todos los animales procedimientos conformes a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y 14 fueron aprobados por la Universidad de Utah y Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Cuidado de Animales y el empleo. 1. Preparación de los animales Lugar de los animales en la cámara de inducción de la anestesia que contiene 3% de isoflurano en oxígeno al 100%. Dejar al animal en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. Retire el animal de la cámara de inducción y colocarlo sobre una mesa de examen climatizada equipada con electrodos de electrocardiograma (ECG). Mantener la anestesia en el 3% isoflurano en oxígeno al 100%. arteria femoral y braquial superficial de la fiebre aftosa no se puede realizar de forma simultánea. Por lo tanto, las instrucciones de preparación para cada medición se enumeran a continuación. 2. Preparación de la arteria braquial Coloque el supina animal y frenar el miembro superior izquierdo y cada miembro inferior de la unatremo de la mesa de examen con cinta quirúrgica. Restringir el miembro superior derecho del animal, de modo que la porción inferior del miembro superior se eleva ligeramente (~ 0,2-0,5 cm) por encima de la plataforma. Aplicar agente depilatorio (por ejemplo, Nair) para miembro superior derecho del animal para eliminar el vello. Posicionar un manguito de oclusión (10 mm de diámetro de la luz de oclusión vascular estándar) a la derecha distal del miembro superior hasta el codo. No se apoye con el oclusor en la plataforma, ya que la inflación / deflación mover la extremidad y perturbar las imágenes de ultrasonido. Ajuste la máquina de ultrasonido a modo B usando el teclado de ultrasonido. Aplicar una pequeña cantidad de gel de ultrasonido para la extremidad superior del animal, proximal al manguito oclusión. alinear manualmente un transductor de ultra-alta frecuencia lineal unido a un soporte estereotáctico con la extremidad superior. La arteria braquial debe ser visible 2-3 mm de profundidad. Para confirmar que la arteria braquial, no la vena braquial, se estáfotografiado, cambiar a PW-modo de usar el teclado de ultrasonido. La arteria tendrá flujo sanguíneo pulsátil en oposición a la vena adyacente que tendrá el flujo de sangre continuo. 3. Preparación de la arteria femoral superficial Coloque el supina animal y frenar las extremidades superiores y el miembro inferior izquierda a la mesa de examen con cinta quirúrgica. Frenar el miembro inferior derecho del animal a una posición elevada (~ 0,5-1 cm) por encima de la plataforma utilizando una almohadilla (por ejemplo, toallas de papel plegadas). Aplicar agente depilatorio (por ejemplo, Nair) a la derecha del animal miembro inferior para eliminar el vello. Después de la eliminación del vello de la vena femoral debe ser claramente visible en la parte interior del muslo. Posicionar un manguito de oclusión (10 mm de diámetro de la luz de oclusión vascular estándar) proximal al tobillo derecho. No se apoye con el oclusor en la plataforma, ya que la inflación / deflación se moverá el miembro inferior y perturbar las imágenes de ultrasonido. Configurar la máquina de ultrasonido paraB-mode. Aplicar una pequeña cantidad de gel de ultrasonido a la extremidad inferior del animal, proximal al manguito oclusión. alinear manualmente un transductor de ultra-alta frecuencia lineal unido a un soporte estereotáctico con la vena femoral, que es visible a través de la piel. La arteria femoral superficial debe ser visible <1 mm de profundidad. Para confirmar que la arteria femoral superficial, no la vena femoral, se está formando la imagen, cambiar a PW-mode. La arteria tendrá flujo sanguíneo pulsátil en oposición a la vena adyacente que tendrá el flujo de sangre continuo. 4. fase basal Optimizar la imagen en modo B, similar a la forma en que se llevaría a cabo en humanos 15. Asegúrese de que se observa una imagen horizontal longitudinal del buque con la íntima-media visualizados en ambas paredes. Optimizar la imagen ajustando ligeramente la colocación de la sonda de ultrasonido para asegurar que la mayor cantidad de la arteria como sea posible es visible en la ventana de captura. Como alternativa, ajustar la configuración de ultrasonido para obtener una imagen mejor al cambiar el brillo / contraste, zonas focales, frecuencia, rango dinámico, y la densidad de líneas. Hay otras maneras de optimizar la imagen de ultrasonido, pero descripción detallada de los están más allá del alcance de este protocolo. Después de la optimización de las imágenes de las arterias, gire en el ECG-gating para mostrar sólo las imágenes capturadas durante la onda R para asegurar que sólo un marco de diámetro se recoge son en cada porción diastólica de un ciclo cardiaco. NOTA: ECG-gating está disponible en la máquina de ultrasonido utilizado en este protocolo mediante la selección de ECG-gating en la opción de ajustes fisiológicos, sin embargo, esta característica no esté disponible en todas las máquinas de ultrasonido. ECG-gating debe ser activado después de que la imagen está optimizado, ya que es difícil obtener una imagen a velocidades de cuadro más bajas (es decir, una vez por la onda R). Sin ECG-gating, la combinación de una alta frecuencia cardiaca en ratas y el requisito de un bastidor de altatasa para capturar la parte diastólica del ciclo cardíaco sólo permite ~ 10-20 segundos de clips. El tamaño engorroso y cantidad de datos en cada clip aumenta la carga de análisis sustancialmente. La ficha 60 segundos de datos de referencia utilizando el modo B. NOTA: La máquina de ultrasonido siempre está grabando, sin embargo, no todas las imágenes se almacenan en la máquina de ultrasonido, ya que hay un límite en el número de fotogramas que se pueden grabar en un clip de ultrasonido. La longitud del clip (es decir, número de tramas) se puede ajustar en la configuración. Se sugiere establecer para el número máximo de fotogramas por clip. Cuando la grabación está en el extremo de un clip (es decir, el número máximo de tramas alcanza), la grabación continúa, pero el clip rollos hacia adelante la captura de los fotogramas más recientes. En este caso, las tramas anteriores que fueron capturados fuera del límite máximo de la trama se eliminan posteriormente. Si bien estas complejidades en la grabación difieren entre las máquinas, puede ser necesario un ajuste de la duración de la grabación. Switch a PW-mode. Coloque el cursor en el centro del lumen. puertas de ejemplo se colocan automáticamente en referencia al cursor, pero se pueden ajustar para la anchura utilizando el teclado de ultrasonido. Mantener un ángulo de insonación ≤ 60 °. Ajustar el ángulo insonación alterando el ángulo del haz Doppler. Hacer ajustes precisos en el ángulo mediante el teclado de ultrasonido. Si ninguno de ellos proporcionan un ángulo adecuado para la medición, ajustar manualmente la sonda de ultrasonido por la inclinación de la arteria de un ángulo de más óptima. Si no se realiza ningún ajuste del ángulo de ultrasonido, recuperar imágenes en modo B. Grabar 10 segundos de datos de velocidad. 5. Fase de Oclusión Inflar el oclusor vascular utilizando una jeringa de 10 ml llena de aire. Para mantener constante la presión de aire en el dispositivo de oclusión vascular, doble el tubo sobre sí mismo y colocar un clip de la carpeta en el tubo plegado. Cambiar a PW-mode para confirmar la oclusión del manguito, como lo demuestrauna gran reducción de velocidad de la sangre. Cambiar a los datos en modo B y el récord en 60 segundos de clips, hasta las 4:45 min de oclusión. Cambiar a PW-mode. Mantener un registro de la frecuencia cardíaca y el tiempo de cada clip de ultrasonido para su análisis. 6. Fase hiperemia Suelte el manguito durante la grabación en el modo PW-quitando el clip de la carpeta del tubo plegado. La ficha 5 segundos antes y 5 segundos después de la liberación del manguito. Cambiar a los datos en modo B y el récord en 60 segundos de clips de hasta 3 minutos después de la oclusión. Mantener un registro de la frecuencia cardíaca y el tiempo de cada clip de ultrasonido para su análisis. Después de la terminación de la fiebre aftosa retire al animal de la mesa de examen y seguimiento hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. 7. Análisis Para el análisis, el ultrasonido de exportación como archivos DICOM a un equipo fuera de línea equipado con el software de detección de bordes, que permite imparcial disuadirminación del diámetro de la arteria en cada fotograma. El análisis es posible en la máquina de ecografía, sin embargo, no es recomendable, ya que es extremadamente intensiva en tiempo y sujeto a sesgo del investigador. Analizar los datos de diámetro de la arteria en 60 segundos segmentos durante la fase de línea de base y la oclusión, y en 10 segundos segmentos durante la fase de hiperemia. Analizar los datos de velocidad de la sangre utilizando las capacidades de análisis de flujo del software automatizado de detección de bordes. Determinar la velocidad media de la sangre mediante la medición de 5 o más formas de onda consecutivos de apariencia uniforme durante las fases iniciales y de oclusión. Determinar la velocidad media de la sangre durante la hiperemia reactiva para velocidades de la sangre inmediatamente después de la liberación del manguito. La forma de onda con la más alta velocidad de la sangre se considera la velocidad sanguínea alta.

Representative Results

la dilatación mediada por flujo se realizó en el braquial y la arteria femoral superficial de 8 ratas Wistar. Posicionamiento de una rata se muestra en la Figura 1. Las imágenes por ultrasonido representativas de la arteria femoral superficial se muestran en la Figura 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54762/54762fig1.j…

Discussion

En el presente estudio, la medición no invasiva de la fiebre aftosa se demostró en el brazo y las arterias femorales superficiales de las ratas. Al igual que en los seres humanos ^6, después de un período de oclusión 5 min, hubo un rápido aumento de la velocidad de la sangre (es decir, la hiperemia reactiva) lo que aumenta la velocidad de cizallamiento en la pared arterial, lo que dio lugar a la vasodilatación posterior de la arteria. La fiebre aftosa se observó tanto en el braquial y femoral superfici…

Materials

Vevo 2100 High Resolution Micro-Ultrasound Imaging System	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
MicroScan Ultra-High Frequency Linear Array Transducer – MS-700 30-70 MHz	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Vevo Imaging Station	VisualSonics, Toronto, ON, CAN
Thermasonic gel warmer	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	82-03	Optional
Signacreme electrode cream	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA	17-05
Transpore surgical tape	3M, Maplewood, MN, USA	1527-1
Depilatory cream (e.g., Nair)	General supply
Cotton swabs	General supply
Ultrasound gel	General supply
Standard vascular occluder, 10 mm lumen diameter	Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA	62-0115
10 ml syringe with Luer-Lok tip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Paperclip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Hypodermic needle – 18 gauge	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus
Medium binder clip	General Supply		Used for occlusion cuff apparatus