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Artículo de método

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

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⸱

DOI:

10.3791/54795

⸱

10 de noviembre de 2016

 ,  ,  , 
1Biological Engineering Department, Utah State University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Las sondas ópticas basadas en nanopartículas han sido diseñadas como un vehículo para la detección de antígenos utilizando espectroscopía Raman y UV-Vis. Aquí describimos un protocolo para preparar dichas sondas para un inmunoensayo de espectroscopía UV-Vis/Raman de tal manera que incorporen futuras capacidades de multiplexación.

Resumen

Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles.

A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados ​​fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados ​​en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes 1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados ​​en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.

Introducción

inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales 2,3. Por el contrario, los sistemas basados en Raman tienen picos de emisión mucho más estrechas que resultan en las capacidades de multiplexación mejoradas con fuentes que afirman la detección simultánea de hasta 100 analitos 2,3.

Muchas fuentes bibliográficas están disponibles que cubren aspectos importantes relacionados con inmunoensayos 4 - 6, como paso a pasodetalles para crear kits ELISA personalizadas. Desafortunadamente, estos protocolos son para la detección fluorescente o colorimétrico, lo que limita la capacidad de multiplexación de inmunoensayos personalizados. Para hacer frente a esta necesidad, se presenta un procedimiento detallado para fabricar el / Raman inmunoensayo UV-Vis previamente publicado 7 para un inmunoensayo directo como se ilustra en la Figura 1B.

Este protocolo incluye la fabricación de sondas basados en nanopartículas de oro funcionalizada, que se ilustra en la Figura 2. El procedimiento para hacer las sondas / UV-Vis Raman comienza por reporteros Raman unión a la superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs son entonces funcionalizados con anticuerpos que se asocian con polietilenglicol (PEG). sitios de unión restantes en la AuNPs se bloquean por la unión de tiol metoxi polietilenglicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar la posterior unión no específica durante el análisis. Las sondas AUNP preparados se prueban mediante la unión a antígenosfijado a los pocillos de una placa de poliestireno, como se ilustra en la Figura 1B. Tras lavar la placa, las sondas AUNP se detectan utilizando espectroscopia UV-Vis, mientras que los reporteros Raman asociados se detectan con la espectroscopia Raman. La combinación de datos UV-Vis y espectral Raman proporciona dos métodos de análisis, la mejora de las capacidades de este inmunoensayo.

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Protocolo

1. Preparación de tampones

  1. Phosphate Buffered Saline (PBS)
    1. Diluir 50 ml de 10x PBS con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración de 1 x PBS. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
    2. Conserve la solución a temperatura ambiente.
  2. Preparación de solución salina tamponada con Tris + Tween 20 (TBST)
    1. Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 10x (TBS) con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración 1x. Añadir 250 l de Tween-20 para un 0,05% (v / v) de Tween-20. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras.
    2. Almacenar a temperatura ambiente.
  3. Preparación de albúmina de suero humano (HSA) de solución de bloqueo
    1. Pesar 0,45 g de HSA en 15 ml de PBS estéril filtrada 1x para hacer un 3% w / v solución de HSA. agitar hasta disolución de HSA se haya disuelto completamente.
    2. Almacenar la solución de HSA a 4 ° C.
      NOTA: albúmina de suero bovino(BSA) también se puede utilizar como una solución de bloqueo.
  4. Preparación de anticuerpo PEGilado solución (PEG-Ab)
    NOTA: La solución de anticuerpo debe estar libre de proteínas portadoras o estabilizantes tales como BSA, que interferirían con las reacciones de conjugación al competir por la N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) sitios de unión. Si el anticuerpo se presenta en una solución de Tris o tampón de glicina, debe someterse a un intercambio de tampón para evitar aminas o sales de amonio de interferir con la reacción de conjugación NHS. Si el anticuerpo está en una forma liofilizada, que se puede resuspender de acuerdo con la recomendación del fabricante a una concentración de 1-10 mg / ml.
    1. Para los anticuerpos en un tampón de Tris o glicina, realizar un intercambio de tampón a bicarbonato de sodio 100 mM usando una columna de desalación. Utilice el tampón de 100 mM para elevar el pH a aproximadamente 8,5 para acelerar la reacción de conjugación.
    2. Hidrato de orto-piridil disulfuro-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) con 100 mM sodium bicarbonato para un volumen de 1 ml a una concentración de 1 mg / ml o mayor.
      NOTA: OPSS-PEG-NHS debe hacerse fresco y usado dentro de aproximadamente 20 minutos. El grupo NHS en el OPSS-PEG-NHS tiene una vida media de aproximadamente 20 min en una solución acuosa a pH 8,5.
    3. Añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de anticuerpo en una relación 2: 1 (PEG: anticuerpo) relación de conjugación que se usa para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir OPSS-PEG-NHS a la solución de antígeno en una proporción de 2: 1 de conjugación para ser utilizado para el control.
      NOTA: La proporción de 2: 1 está asumiendo una eficiencia de conjugación 50%. El objetivo es etiquetar cada anticuerpo con una cadena de PEG. En este paso, el exceso de etiquetado es mejor que en virtud de etiquetado. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados de OPSS-PEG-NHS y solución de anticuerpos:
      figure-protocol-1
      donde V es el volumen, C es la concentración expresada en moléculas o unaticuerpos por ml. Los subíndices PEG y Ab son OPSS-PEG-NHS y el anticuerpo, respectivamente. El volumen final debe ser de aproximadamente 250 l.
    4. Incubar solución de PEG-Ab a 4 ° C durante 8 horas o durante la noche. Conserve la solución en alícuotas de aproximadamente 25 l trabajo a -20 ° C para limitar los ciclos de congelación y descongelación y asegúrese de usar tubos de unión de baja.

2. Preparar UV-Vis / Raman Sondas

  1. Preparar la solución AuNP desnuda
    1. Preparar una solución de AuNPs 2 ml con una concentración de aproximadamente 1 x 10 11 partículas por ml.
      1. Si las AuNPs deben concentrarse, llenar tubos de centrífuga de baja unión con 2.000 l de Stock AuNP y centrifugar a 5000 xg durante 20 minutos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento AuNP.
      2. Se combinan las soluciones AUNP restantes en un tubo y estimar la concentraciónción mediante la obtención de una medición UV-Vis y comparando los valores a concentraciones conocidas ya que esta es una relación lineal.
  2. Determine la relación etiquetado reportero apropiado Raman
    1. Preparar una solución de trabajo del reportero Raman disuelto en metanol. Esta concentración será dependiente de la reportero utilizado. En este trabajo, preparar yoduro de 3,3 'diethylthiatricarbocyanine (DCTC) a una solución de trabajo de 200 mM.
    2. Suponiendo un volumen final de 100 l para cada pocillo, añadir una cantidad suficiente de la solución de reportero de trabajo a cada pocillo de la primera fila de una placa de 96 pocillos de manera que el reportero Raman oscilará en concentraciones de 0,2 M a 10 mM. Añadir suficiente agua de grado HPLC a cada pocillo de tal manera que el volumen es de 80 l. Añadir 20 l de AuNP a cada pocillo hacer un volumen final de 100 l para cada pocillo. Un ejemplo se proporciona en la Tabla 1.
    3. Medir la radiación UV-Vis de 400 a700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis. La concentración apropiada es la concentración más alta con picos definidos para los espectros UV-Vis. Repita el paso 2.2.2 a concentraciones crecientes hasta que la relación de concentración más alta de reporteros Raman para AuNPs se encuentra.
      NOTA: El colorante y la forma AuNP, tamaño y fabricante influyen en la concentración apropiada. Por lo tanto, los pasos que se indican deben ser evaluadas y modificadas en función de los componentes utilizados. Este protocolo implicó el uso de un colorante cargado positivamente. Como tal, la unión entre el AuNP y reportero fue mejorado mediante el uso de AuNPs con carga negativa. Esto se hace mediante el uso de citrato AuNPs tapado. Vea la sección de discusión para más detalles.
  3. Encuadernación reportero Raman y PEG-Ab a AUNP
    1. Preparar dos 1,5 ml lotes de AuNP y reportero Raman a la concentración previamente determinada, lo que permite el reportero Raman para unirse a los AuNPs durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Añadir el anticuerpo PEGilado (PEG-Ab) a un lote de la solución reportero AuNP y Raman para crear un 200: 1 de anticuerpos a partículas. Esta solución será para las muestras de ensayo. En un tubo de microcentrífuga separado, añadir el antígeno PEGilado para el otro lote de la solución reportero AuNP y Raman en un 200: 1 de anticuerpo a partículas para ser utilizado como el control. Incubar las soluciones para 30 min a temperatura ambiente.
      NOTA: La proporción de anticuerpos a partículas será específica para las AuNPs y tinte usado y debe ser optimizada para cada caso individual. El objetivo aquí es tener la mayor proporción de anticuerpos para las sondas AUNP que se unen a al tiempo que evita la agregación de las partículas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos:
      figure-protocol-2
      donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. La aletaal volumen debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
  4. Bloquear los sitios en la superficie AuNP con mPEG-SH restante.
    1. Preparar mPEG-SH por disolución sólida metoxi tiol a una concentración 200 mM usando agua. Vortex la solución hasta que mPEG-SH se disuelva completamente.
    2. Añadir mPEG-SH en un 40,000: 1 relación a la solución AuNP-PEG-Ab hecha en el paso 2.3. Incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 min para asegurar que los sitios restantes de la nanopartícula de oro están bloqueadas. Utilice la siguiente ecuación para determinar los volúmenes apropiados para agregar juntos:
      figure-protocol-3
      donde V es el volumen, C es la concentración expresada en partículas o anticuerpos por ml. El volumen final debe ser de aproximadamente 1,5 ml.
  5. Recuperar sondas funcionalizadas Raman.
    1. partículas de centrifugar a 5.000 g durante 20 min en baja se unen centrifuge tubos o hasta que el sobrenadante es claro. Eliminar el sobrenadante con la pipeta con cuidado de no molestar a los AuNPs.
    2. Volver a suspender las partículas con 1 ml de solución de PBS 1x que se hizo anteriormente. Estimar la concentración AuNP por tomar una medición UV-Vis de un pequeño volumen de solución (3 l) y comparar los resultados con las mediciones de una concentración AuNP conocido. Ajustar el volumen de tal manera que la solución final es de al menos 1 x 10 11 partículas por ml.
    3. Las soluciones se almacenan a 4 ° C hasta que se utiliza para la funcionalización de la placa de inmunoensayo. Utilice las soluciones dentro de una semana.
Los volúmenes de añadir de cada componente (ml)
DCTC concentración final (mM) solución de trabajo DCTC (200 mM) AuNP Agua
0,2 0,1 20 79.9
0,6 0,3 20 79.7
1 0,5 20 79.5
2 1.0 20 79
5 2.5 20 77.5
7 3.5 20 76.5
10 5.0 20 75

Tabla 1. DCTC ejemplo dilución. Varias diluciones de DCTC y los volúmenes asociados de Stock DCTC, solución de nanopartículas de oro, y el agua.

3. Inmunoensayo Placa Preparación

  1. Unirse al antígeno deseado a la placa de inmunoensayo.
    1. Preparar suficiente antígeno diluido (50 g / ml) para llenar los pocillos de poliestireno. Vortex la solución,e inmediatamente añadir la solución a los pocillos de la placa. Permitir que el antígeno se una a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
  2. Lavar los antígenos no unidos.
    1. Retire el exceso de solución de antígeno por la solución de vertido en un contenedor de eliminación de la placa y golpear contra una mesa de toallas de papel cubierto.
    2. Añadir TBST a los pocillos para lavar la superficie a continuación, quitar el lavado de la misma manera como se ha indicado anteriormente. Repita este paso dos veces más.
  3. Bloque restantes sitios de unión en la placa para evitar la unión no específica.
    1. Añadir 70 l de solución de bloqueo HSA a cada pocillo de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Retirar y enjuagar la placa utilizando el mismo procedimiento que se especifica en el paso 3.2. Cubrir la placa y seco para guardar a 4 ° C hasta que esté listo para su uso posterior.
  4. Funcionalizar placa de inmunoensayo.
    1. Añadir 70 l de tque la sonda nanopartículas preparadas en la Sección 2 de la primera columna de una placa de 96 pocillos y diluir columnas subsiguientes usando una dilución 1: 2 en serie. Dejar que la placa se incuba durante al menos 1 hora. Un ejemplo de la forma de preparar la placa de inmunoensayo se da en la Figura 3.
    2. Lavar la placa con TBST cinco veces como se detalla en los pasos 3.2, asegurándose de disponer de las AuNPs adecuadamente. Después del lavado final, añadir 70 l de 1x PBS a cada pocillo y cubrir con una junta de la placa.
      NOTA: Las muestras de control deben ser claros. Si se ha producido la unión no específica, las muestras de control tendrán un color parecido a las muestras de ensayo.
  5. Prueba de la sensibilidad del ensayo UV-Vis y espectroscopía Raman.
    1. Para cada pocillo, medir la UV-Vis espectros que van de 400 a 700 nm utilizando una placa de lectura de UV-Vis espectrofotómetro.
    2. El uso de un microscopio Raman invertida, centrar el objetivo en la superficie del pozo que tiene las sondas AUNP. Transmisión exteriorner un espectro de Raman del pozo. Recoger un espectro que va desde 1.800 cm -1 a 400 cm -1. Repita este paso para todos los pozos.
    3. El uso de un software apropiado espectral, realice una orden de corrección de línea de base polinómica 11ª para los espectros Raman y un polinomio de orden 3º de la radiación UV-Vis.
    4. El uso de un software apropiado espectral, normalizar el Raman y UV-Vis. Ajuste el valor máximo de la escala 1 y todos los demás valores en consecuencia. Para normalizar los espectros Raman, seleccione un pico de poliestireno único y establezca su valor en 1 y la escala de todos los demás valores en consecuencia.
    5. El uso de un software apropiado espectral, lleve a cabo la integración de picos para cada espectro. Para los espectros de Raman, el pico que representa el reportero Raman debe estar en una región ausente de los picos de poliestireno. Para llevar a cabo la integración de picos, especifique los límites integrales para el pico deseado y registrar el área del pico deseado para todas las muestras incluyendo los controles.
    6. plAT el área promedio pico de interés como una función del logaritmo de la concentración AuNP con barras de error para cada punto que indica su desviación estándar asociada. Montar estos puntos de calibración a una curva logística de 4 parámetros.
    7. Determinar el valor medio de la pieza en bruto por el promedio del área del pico de interés para una muestra en blanco. Determinar la desviación típica de estas zonas; esta es la desviación estándar de la pieza en bruto.
    8. Para el mismo pico analizado en el paso anterior, encontrar la desviación estándar de que el área del pico para la concentración más baja.
    9. Calcular el límite del límite de espacio en blanco y el inferior de prueba como se especifica en la sección de resultados Representante. Utilice estos valores con las curvas de calibración para determinar la 4PL LLOD en términos de concentración AuNP.

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Resultados

En este estudio, se utilizaron 60 partículas de oro nm para espectroscopía UV-Vis. UV-Vis espectros de absorción de 400 a 700 nm fueron recogidos y las áreas de los picos correspondientes a cada concentración AuNP se determinaron usando un software de análisis espectral de código abierto 8. Antes de pico de integración, los espectros recogidos se sometió a corrección de línea base usando un ajuste polinómico de tres puntos. Áreas de los picos se utilizaron para generar una curva de calibración logarítmica com...

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Discusión

En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superficial p...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por un Premio Catalizador de Investigación de la Universidad Estatal de Utah. Los autores desean agradecer a Annelise Dykes, Cameron Zabriskie y Donald Wooley por sus contribuciones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nanopartícula de oro de 60 nmTed Pella, Inc.15708-6Se trata de nanopartículas de oro recubiertas de citrato. Por favor, consulte la discusión para conocer la relación entre el reportero Raman y la carga superficial de AuNP y su importancia para la selección adecuada del reportero AuNP y/o Raman.
Bicarbonato de sodioFisher ScientificS233-500
MetanolPharmco-Aaper339000000
Tris Solución salina tamponada (10x) pH 7.5Scy TekTBD999
Unidad de filtración de tapa de botellaVWR97066-202
Tween 20 (polisorbato 20)Scy TekTWN500Se utiliza como agente emulsionante para las etapas de lavado.
Solución salina tamponada con fosfato 10x concentrado, pH 7.4Scy TekPBD999
Protein LoBind Tube 2.0  mlLos tubos Eppendorf 22431102tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.
Tubo LoBind de proteínas 0.5  mlLos tubos Eppendorf 22431064tubos LoBind evitan la unión de proteínas y AuNPs a las superficies de los tubos.
Dispositivos de microplacas UniSealGE Healthcare7704-0001Se utiliza para sellar y almacenar placas funcionalizadas.
Placa de ensayo, con tapa de baja evaporación, fondo plano de 96 pocillosCostar3370
Agua de grado HPLCSigma Aldrich270733-4L
3,3′-yoduro de dietiltiatricarbocianina (DTTC)Sigma Aldrich381306-250MGRaman reportero
mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gramoLaysan Bio, Inc.MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1  gramoLaysan Bio, Inc.OPSS-PEG-SVA-5000-1gOPSS-PEG-SVA tiene un extremo NHS.
IgG de ratón, control de molécula enteraThermo Fisher Scientific31903Antígeno
cabra anti-IgG de ratón (H + L) Anticuerpo secundario adsorbido cruzadoThermo Fisher Scientific31164Anticuerpo
Solución de bloqueo de albúmina sérica humanaSigma AldrichA1887-1Gsu lugar, se puede utilizar albúmina de suero bovino.
Mini centrífugaFisher Schientific12-006-900
Espectrofotómetro UV-VisThermo ScientificNanodrop 2000c
Espectrofotómetro UV-VisBioTekSynergy 2
Columnas de desalinizaciónThermor Scientific87766
Fabricación propia 785  Unidad de microscopio Raman invertidoN/AN/AUn microscopio Raman invertido es el mejor para enfocar correctamente la superficie de la placa de pocillo. De lo contrario, se utilizará un aumento muy bajo debido a la altura de la placa de 96 pocillos. Se utilizó un sistema construido internamente, ya que era más barato que comprar a un proveedor. Sin embargo, se puede utilizar cualquier sistema de microscopio Raman invertido disponible en el mercado.
de En

Referencias

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