A continuación, describimos un método de proteómica cuantitativa mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para analizar los efectos de la infección por VIH-1 en proteomas exosomal anfitrión. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a las células bajo diferentes condiciones de estrés o infección.
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Artículo de método
SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas
En este artículo
Resumen
Resumen
La proteómica es el análisis a gran escala de proteínas. Las técnicas proteómicas, como la cromatografía líquida y la espectroscopia de masas en tándem (LC-MS/MS), pueden caracterizar miles de proteínas a la vez. Estas poderosas técnicas nos permiten tener una comprensión sistémica de los cambios celulares, especialmente cuando las células se someten a diversos estímulos, como infecciones, estrés y condiciones de prueba específicas. Incluso con los desarrollos recientes, el análisis del proteoma exosomal lleva mucho tiempo y, a menudo, implica metodologías complejas. Además, el gran conjunto de datos resultante a menudo necesita un análisis sólido y simplificado para que los investigadores realicen estudios posteriores. En este trabajo describimos un protocolo basado en SILAC para caracterizar el proteoma exosomal cuando las células están infectadas con el VIH-1. El método se basa en el marcaje simple de isótopos, el aislamiento de exosomas de células marcadas diferencialmente y el análisis de espectrometría de masas. A esto le sigue la minería de datos detallada y el análisis bioinformático de los impactos proteómicos. Los conjuntos de datos y candidatos resultantes son fáciles de entender y, a menudo, ofrecen una gran cantidad de información que es útil para el análisis posterior. Este protocolo es aplicable a otros compartimentos subcelulares y a una amplia gama de condiciones de prueba.
Introducción
Muchas enfermedades humanas, incluyendo las infecciones virales, a menudo se asocian con procesos celulares distintivas que tienen lugar en y alrededor de las células afectadas. Proteínas, actuando a menudo como los efectores celulares en última instancia, a mediar en estos procesos. El análisis de las proteínas a menudo puede proporcionar información muy valiosa sobre el medio ambiente local de las células afectadas y nos ayudan a comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad. Entre las diversas técnicas de análisis de proteínas, proteómica es válido especialmente una gran promesa. Como una herramienta de gran alcance, a gran escala, la prote....
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Protocolo
1. Cultivo celular y la infección por VIH-1
NOTA: Antes de comenzar los experimentos, se recomienda comprobar la viabilidad de las células mediante la tinción de azul de tripano 11 y su proliferación a través de un ensayo de MTT 12. También es fundamental utilizar medio SILAC recién preparado. Varias líneas celulares se pueden utilizar, siempre y cuando se encuentren en una fase activa de proliferación, y son susceptibles a la infección por VIH-1, o la condición de prueba de elección. En este protocolo, utilizar la línea celular H9 como el ejemplo.
- Semilla 2 x 10 6 célu....
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Resultados
La figura 1A es un diagrama de flujo esbozar el procedimiento de etiquetado SILAC 21. Con el fin de purificar los exosomas, las muestras deben ser centrifugadas a través de la centrífuga. La Figura 1B muestra las etapas de purificación por ultracentrifugación exosome de serie 21. Una vez purificados, los exosomas son objeto de un análisis proteómico experimental como se indica en el procedimiento.
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Discusión
En los procedimientos descritos en este documento, hemos demostrado la aplicación de la técnica SILAC para investigar el efecto de la infección por VIH-1 en el proteoma exosomal anfitrión. Inicialmente, las células infectadas no infectados y el VIH-1 son diferencialmente marcado con isótopo. Los exosomas diferencialmente marcadas se purificaron entonces antes de realizar la extracción de proteínas. A continuación, se emplea cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas para analizar el proteoma exosomal. Final.......
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Divulgaciones
Los autores no han declarado ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un suplemento de ARRA a la vida útil / Tufts / Castaño CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, y K24HD080539 a la BR. Este trabajo también fue apoyado por el Fondo de Investigación Piloto Vida útil (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969), y los NIH COBRE URI / RIH Investigación Piloto Grant (P20GM104317) a ML. Agradecemos a James Myall y Vy Dang para obtener ayuda con la preparación del manuscrito y la figura.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Línea celular H9 | ATCC | HTB-176 | |
| Azul de tripano | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT | Thermo Fisher | V13154 | |
| Suero bovino fetal dializado (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| Kit de cuantificación de proteínas SILAC – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM versión (89983) |
| L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 para SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lisina-2HCl, 13C6 para SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| VIH-1 NL4-3 Programa de | reactivos para el SIDA de los NIH | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Kit ELISA de antígeno | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Centrífuga refrigerada de alta velocidad | Eppendorf | 22628045 | |
| Ultracentrífuga refrigerada | Beckman Coulter | 363118 | Debería poder alcanzar 100.000 x g |
| 50 mL Tubos de centrífuga cónicos | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Tubos de ultracentrífuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Rotor Ti | Beckman Coulter | 369694 | |
| tampón RIPA | Thermo Fisher | 89900 | |
| Cócteles inhibidores de proteasa | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | de ensayo de | Eppendorf | |
| BCA | Espectrofotómetro Thermo | Fisher 23250 | |
| Biorad | 1702525 | ||
| SDS PAGE Aparato de gel | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Reactivo de tinción en gel | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Tripsina modificada de grado de secuenciación | Promega | V5111 | |
| Concentrador SpeedVac | Thermo Fisher SPD131DDA | ||
| Anticuerpo contra la anexina A5 humana | Abcam | ab14196 | |
| Anticuerpo contra la cadena B de lactato deshidrogenasa humana | Abcam | ab53292 | |
| Sistema de software gráfico y estadístico | SigmaPlot | o prisma GraphPad | |
| Paquete de software de proteómica cuantitativa | Instituto Max Planck de Bioquímica | Maxquant | |
| Software y bases de datos | Varios proveedores | Consulte el texto principal para obtener más información |
Referencias
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exo....
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Reimpresiones y permisos
