La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

Resumen

enfermedades neurodegenerativas progresivas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (EP) son una amenaza creciente para la salud humana en todo el mundo. Aunque los modelos de mamíferos han aportado importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la patogenicidad, la complejidad de los sistemas de mamíferos, junto con sus altos costos están limitando su uso. Por lo tanto, la simple pero bien establecido modelo de sistema de Drosophila ofrece una alternativa para la investigación de las vías moleculares que se ven afectados en estas enfermedades. Además de anomalías de comportamiento, enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por fenotipos histológicos tales como la muerte neuronal y axonopatía. Para cuantificar la degeneración neuronal y para determinar cómo se ve afectada por factores genéticos y ambientales, usamos un enfoque histológico que se basa en la medición de las vacuolas en el cerebro de moscas adultas. Para minimizar los efectos del error sistemático y la comparación directa de las secciones de control y experimental moscas en una preparación, que utilizan el método de "cuello" de las secciones de parafina. La neurodegeneración se evalúa a continuación, midiendo el tamaño y / o número de vacuolas que se han desarrollado en el cerebro de la mosca. Esto se puede hacer ya sea centrándose en una región específica de interés o mediante el análisis de todo el cerebro mediante la obtención de secciones en serie que abarcan la cabeza completa. Por lo tanto, este método permite medir no sólo la degeneración severa, pero también fenotipos relativamente suaves que sólo son detectables en algunas secciones, como ocurre durante el envejecimiento normal.

Introducción

Con el aumento de la esperanza de vida, las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson se han convertido en una amenaza creciente para la salud de la población en general. De acuerdo con los Institutos Nacionales de la Salud, 115 millones de personas en todo el mundo se prevé que se afectados por la demencia en 2050. Aunque se han hecho progresos significativos en la identificación de los genes y los factores de riesgo implicados en al menos algunas de estas enfermedades, para muchos de ellos, el subyacente mecanismos moleculares aún no se conocen o no se entiende bien.

Simples organismos modelo de invertebrados como....

Protocolo

1. La fijación de la cabeza sobre los cuellos y inclusión en parafina

Nota: Todos los pasos en el proceso de fijación debe hacerse en una campana de humos. Metilbenzoato, mientras que no plantean un riesgo para la salud, tiene un olor muy distinto, que puede ser abrumador si no se manejan en una campana de humos.

1. Antes de anestesiar las moscas, conforman 50 ml de solución de Carnoy mediante la adición de 15 ml de cloroformo y 5 ml de ácido acético glacial y 30 ml de etanol al 99% (no mezcle el cloroformo y ácido acético). Se vierte en un recipiente de vidrio con un fondo plano, como por ejemplo un plato de cristalizar, para asegurar que los collare....

Resultados

Utilizando los resultados método descrito en secciones seriadas teñidas por el pigmento del ojo ³³ que abarcan toda la cabeza de la mosca. A parte de esto se muestra en la Figura 1B, donde las secciones de una cabeza individuales se muestran de arriba a abajo. Las secciones de diferentes moscas son vistos de izquierda a derecha en este ejemplo. Para facilitar la orientación y la identificación de las moscas, una mosca sin ojos (oculis sinusoidales) se.......

Discusión

El método descrito proporciona un medio para cuantificar la neurodegeneración en el cerebro de Drosophila. Mientras que otros métodos, como contar un tipo celular específico, se pueden utilizar para identificar la neurodegeneración, la ventaja de este método es que se puede aplicar de forma más general. Contando las células requiere que estas células pueden ser identificados de forma fiable utilizando un anticuerpo específico o la expresión de un marcador específico de célula, lo que no siempre está disponible........

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo/equipo	Número	catálogo
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	Estamos utilizando collares hechos a medida que están hechos de una sola pieza de metal en lugar de capas como los de Genesee. Una descripción sobre cómo hacer collares se puede encontrar en http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Bandeja de cubitos de hielo de goma para incrustar		para el hogar	El tamaño se puede hacer a medida pegando paredes adicionales
Plato de cristalización	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroformo	Fisher Scientific Company	C298-500
Ácido acético glacial	Fisher Scientific Company	A38-212
Metilbenzoato	Fisher Scientific Company	M205-500	Olor distintivo - ¡Uso en campana extractora!
Cera de parafina de bajo punto de fusión	Fisher Scientific Company	T565	Asegúrese de mantener extra derretido en un 65° C
Microtomo	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific Company	12-550D
Cubierta de cristal del microscopio	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Tres recipientes diferentes para lavados
Tarro de tinción vertical con Portada	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Solución de poli-L-lisina (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500

de de la empresa Tienda de baño de agua