La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en Drosophila

Con el aumento de la esperanza de vida, las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson se han convertido en una amenaza creciente para la salud de la población en general. De acuerdo con los Institutos Nacionales de la Salud, 115 millones de personas en todo el mundo se prevé que se afectados por la demencia en 2050. Aunque se han hecho progresos significativos en la identificación de los genes y los factores de riesgo implicados en al menos algunas de estas enfermedades, para muchos de ellos, el subyacente mecanismos moleculares aún no se conocen o no se entiende bien.

Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster ofrecen una variedad de ventajas experimentales para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo un ciclo de corta vida, gran número de progenie, y la disponibilidad de métodos genéticos y moleculares bien establecidos y, a veces únicos ^{1 -12.} Además, estos organismos son susceptibles de imparcialpantallas de interacción que pueden identificar los factores que contribuyen a estas enfermedades por sus efectos agravantes o mejorar en fenotipos neurodegenerativos.

El análisis de estas interacciones genéticas y la evaluación de los efectos del envejecimiento requiere protocolos cuantitativos para detectar la neurodegeneración y para medir su gravedad. Esta evaluación puede hacerse con relativa facilidad en la medición de los aspectos de comportamiento en Drosophila, como el aprendizaje olfativo, geotaxis negativos, o fototaxis rápido, que proporcionan un valor numérico rendimiento ^13-21. También es posible determinar los efectos sobre la supervivencia neuronal contando las neuronas. Sin embargo, esto sólo es posible cuando se centra en una población específica que se pueda identificar claramente, al igual que las neuronas dopaminérgicas que se ven afectados en la enfermedad, e incluso entonces, los resultados han sido controvertidos ^22-24.

El protocolo descrito aquí utiliza el método de cuello para realizar secciones en serie de parafina, un métodoque fue desarrollado originalmente por Heisenberg y Böhl, que lo utilizó para aislar mutantes anatómicas cerebrales en Drosophila ^25. El uso del método de cuello posteriormente se ha adaptado, incluso en criosecciones, vibratome secciones y secciones de plástico ^{de 26-28.} Aquí, se emplea este método para obtener secciones en serie de toda la cabeza de la mosca, que luego se puede utilizar para medir las vacuolas que se desarrollan en las moscas con fenotipos neurodegenerativas ^16,21,29-32. Estas mediciones se pueden hacer en áreas específicas del cerebro o pueden cubrir todo el cerebro; el último enfoque permite identificar incluso débiles fenotipos degenerativas, como se observa durante el envejecimiento. Por último, cuando se utilizan los collares, hasta 20 moscas pueden ser procesados ​​como una preparación, que no sólo es menos tiempo, sino que también permite el análisis de control y las moscas experimentales en la misma preparación, minimizando artefactos debido a ligeros cambios en la preparación.

1. La fijación de la cabeza sobre los cuellos y inclusión en parafina

Nota: Todos los pasos en el proceso de fijación debe hacerse en una campana de humos. Metilbenzoato, mientras que no plantean un riesgo para la salud, tiene un olor muy distinto, que puede ser abrumador si no se manejan en una campana de humos.

1. Antes de anestesiar las moscas, conforman 50 ml de solución de Carnoy mediante la adición de 15 ml de cloroformo y 5 ml de ácido acético glacial y 30 ml de etanol al 99% (no mezcle el cloroformo y ácido acético). Se vierte en un recipiente de vidrio con un fondo plano, como por ejemplo un plato de cristalizar, para asegurar que los collares pueden quedar plano y están completamente cubiertas por la solución.
2. Anestesiar las moscas con CO ₂ o éter.
3. moscas de rosca (hasta 20 con la mayoría de los collares) por sus cuellos en los cuellos utilizando fórceps. Recuerde que debe alinear todas las cabezas en la misma orientación, como se ve en la figura 1A, y ser suave para asegurar que no se produzcan daños en la cabeza o los ojos.
4. Incluir moscas seno oculis (flechas, Figura 1A) en posiciones aleatorias por lo que el orden de las moscas pueden ser fácilmente identificados en las secciones. Además, si las moscas experimentales tienen un color de ojos claros o blancos, enhebrar algunas moscas de ojos rojos, como el tipo salvaje, entre ellos para garantizar que el pigmento está presente suficiente para teñir la diapositiva. Registrar el orden de las moscas en una hoja de protocolo junto con el número de cuello si se utiliza más de un collar.
5. Una vez que un collar se ha terminado, colocarlo en la solución de Carnoy preparado durante 3,5 - 4 h.
6. Volcar la solución de Carnoy en el recipiente eliminación adecuada y comenzar los lavados de etanol. Asegúrese de verter lentamente a fin de no perturbar la colocación de los collares en el contenedor.
7. Lavar los cuellos de 30 min en 99% de etanol dos veces.
8. Lavar los collares en 100% de etanol durante 1 h. Asegúrese de cambiar los lavados a tiempo para evitar overdehydration.
9. Poner los collares en metilbenzoatoO / N a temperatura ambiente. Sellar el recipiente con parafilm para evitar la evaporación de la metilbenzoato de metilo.
10. Verter la methylbenozate en el recipiente desechable adecuado en la campana de humos. Añadir una mezcla previamente preparada de 1: 1 punto de fusión bajo (56 - 57ºC) cera de parafina y benzoato de metilo. A partir de ahora, los collares necesitan ser mantenidos en una incubadora a 65 ° C para asegurarse de que la parafina no se endurece.
11. Vierte el methylbenozate y la mezcla de parafina en el recipiente desechable adecuada, y se vierte cera fundida de parafina pura, se mantiene a 65 ° C, en los cuellos.
12. Cambiar la parafina después de 30 minutos y repetir esto por lo menos 5 veces. Al menos 6 - 8 lavados deben realizarse.
13. Una vez que los lavados son completos, colocar los collares en una bandeja de cubitos de hielo de goma con ranuras aproximadamente del tamaño de los collares. Verter la parafina fundida sobre ellos hasta que esté completamente cubierto y deje que se endurezca O / N (tratar de evitar burbujas de aire).
14. Retire los bloques de parafina contaiNing los collares de la bandeja de cubitos de hielo. Separar el bloque de parafina desde el collar usando una hoja de afeitar, rompiendo suavemente del collar. Las cabezas estarán en el bloque de parafina, mientras que los cuerpos permanecerán en el cuello. Los bloques se pueden mantener a temperatura ambiente.
15. Para limpiar los collares, remojar en un agente deparafinization a 65 ° C para eliminar la parafina, limpio, con luz de lavado, y se lava en etanol antes de reutilizar.

2. seccionamiento y de montaje

1. Calentar una placa de calentamiento a 50 ° C. Colocar los portaobjetos (o bloques de montaje de metal) y hojas de afeitar en la placa y dejar que se caliente.
2. Dependiendo de la orientación deseada para seccionar, sujetar el bloque de parafina, ya sea con las cabezas hacia el lado (por secciones horizontales) o hacia arriba (para secciones frontales) a un bloque de montaje calentada (fusión brevemente el bloque en el lado de contacto). Retire el bloque de la placa de calentamiento y dejar que se enfríe durante al menos 10 millasn de asegurar que la parafina se ha endurecido lo suficiente para un sellado adecuado en el bloque de montaje. Mantenga la fila de cabezas alineadas en paralelo con la superficie del bloque tanto como sea posible para evitar que las secciones irregulares.
3. Tome una hoja de afeitar y recortar el exceso de parafina lejos de las cabezas de la mosca de modo que sólo una pequeña fila con las cabezas incrustadas permanece (la hoja de afeitar puede ser calentado por el recorte más fácil). Asegúrese de no recortar demasiado para que la parafina no se rompa durante el corte (más ajuste se puede hacer durante el corte).
4. Coloque el bloque de montaje en el soporte objeto de la microtomo y asegurarse de que la alineación de la fila de cabezas es lo más paralelo posible al borde de la hoja.
5. Preparar portaobjetos de microscopio cubriéndolos con una capa delgada de solución de poli-L-lisina (PLL) y dejarlos secar durante 5 minutos. Cubrirlos con agua poco antes de su uso.
6. Cortar 7 micras secciones y transferir la cinta de las secciones a la diapositiva flotando en el agua. <br /> NOTA: Para obtener todo el cerebro para las secciones horizontales, recogemos la cinta desde el momento de iniciar el corte en el ojo hasta que la cabeza ha sido completamente cortada (corte de la trompa en el cerebro). Más de una diapositiva puede ser necesario para toda la cabeza.
7. Colocar el portaobjetos en una placa de calor a 37 ° C y deje que la cinta se expanda durante aproximadamente 1 minuto.
8. Eliminar el exceso de agua (mediante el vertido de su alimentación o el uso de un pañuelo de papel) y secar el portaobjetos S / N.
9. Quitar la cera de parafina de la diapositiva mediante la colocación de las diapositivas en una, vertical tarro deslizable tinción alto lleno de un agente deparafinization (cubriendo completamente las secciones). Realizar 3 lavados de 30 min - 60 min cada uno.
10. Retire el porta del lavado final. Colocar 2 gotas de medios de incrustación sobre el portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos grande.

3. Fotografiar y análisis de las Secciones

1. Dejar que las muestras preparadas se sequen durante 1 - 2 d. Entonces, examinarlas en un microsc de fluorescenciaope bajo luz azul.
2. Use un aumento menor para determinar la orientación de las moscas y para encontrar la región de interés si se centra en una región específica.
   NOTA: Para los moscas SWS (ver Figura 2), nos encontramos con la sección que contiene el gran comisura y tomar una imagen (por lo general a un aumento de 40X). Al analizar el cerebro entero (como en la figura 3), que desplazarse por todas las secciones de una cabeza y, o bien fotografiar la sección con el fenotipo más grave o todas las secciones que muestran vacuolas.
3. Para un análisis doble ciego, tomar y número de imágenes sin conocer el genotipo y registrar el número de cuello y la posición de la cabeza de la fila para identificarlos más tarde.
4. Una vez que se han tomado las imágenes, analizarlos utilizando un software de imágenes.
5. Contar el número de vacuolas por sección o por cabeza. Para medir el tamaño vacuola, abrir las imágenes en un programa de software y seleccione las vacuolas con una selección demasiadol. Determinar la cantidad de píxeles en las vacuolas seleccionados.
6. Para la conversión a ² micras, tomar una foto de una diapositiva de calibración micrómetro en el aumento que se usa para la adquisición de fotos. Determinar la cantidad de píxeles de 100 micras ² para calcular un factor de conversión.
7. Convertir el número total de píxeles en micras ² dividiendo el número de píxeles por el factor de conversión calculada en el paso anterior.

Utilizando los resultados método descrito en secciones seriadas teñidas por el pigmento del ojo 33 que abarcan toda la cabeza de la mosca. A parte de esto se muestra en la Figura 1B, donde las secciones de una cabeza individuales se muestran de arriba a abajo. Las secciones de diferentes moscas son vistos de izquierda a derecha en este ejemplo. Para facilitar la orientación y la identificación de las moscas, una mosca sin ojos (oculis sinusoidales) se inserta como un marcador en la posición 3 (flecha, Figura 1B).

Para cuantificar la neurodegeneración, medimos la formación de vacuolas que se pueden detectar en estas secciones. Las vacuolas se definen como redondo, manchas oscuras que están dentro del neurópila verde fluorescente (puntas de flecha en la Figura 2 y 3) o de la corteza y que son visibles en al menos 2 secciones consecutivas del cerebro de la mosca. La cuantificación de la neurodegeneración porvacuolas de medición o bien se puede hacer por centrarse en una región específica del cerebro o mediante el análisis de todo el cerebro. La limitación del análisis a una región específica del cerebro es útil en los casos en que una mutación solamente afecta a una región específica, como los lóbulos olfativos en el futsch 'olk mutante 34, pero también se puede utilizar cuando hay degeneración severa en todos o muchos regiones del cerebro. Un ejemplo de esto último es el queso suizo (SWS) mutante (Figura 2), donde la medición de todas las vacuolas sería demasiado tiempo. Por lo tanto, tomamos sólo una imagen y, para asegurar que las mediciones se realizaron siempre en el mismo nivel, tomamos todas las imágenes a nivel de la gran comisura (GC, figura 2A), que sólo está contenida en una o dos secciones. Mientras que no se detectó la formación de vacuolas en SWS 1 día de edad '1 Las moscas (datos no mostrados), un alelo de pérdida de función 35, algunas vacuolas eran detectables in 7 días de edad SWS '1 Las moscas (puntas de flecha, Figura 2A). Envejecimiento las moscas a 14 d (Figura 2B) y 21 d (Figura 2C) aumentado aún más este fenotipo, mostrando su naturaleza progresiva. Contar el número de vacuolas en el neuropilo deutocerebral (dn) utilizando el método descrito confirmó un aumento significativo en el número de vacuolas con la edad. Además, el área combinada comprendida por vacuolas aumentó significativamente con el envejecimiento (Figura 2D).

Sin embargo, no todos los mutantes muestran un fenotipo tan severa como SWS, y en esos casos, las diferencias en la degeneración son difíciles de determinar cuando se centra en un área pequeña. Del mismo modo, la degeneración que se produce durante el envejecimiento es bastante suave (Figura 3A - C) y por lo tanto, se analizó la totalidad del cerebro cuando la cuantificación de este fenotipo. La determinación de la suma de todas las vacuolas en el cerebro reveladoun aumento significativo con la edad, y esto también fue el caso cuando se mide el área combinada de estas vacuolas (Figura 3D).

Figura 1. parafina secciones en serie. A) Usando el método de cuello, moscas experimentales y de control se pueden procesar como una muestra enroscando ellos en una sola collar. Sin ojos moscas oculis seno se insertan de orientación (flechas). B) Esquema que muestra la orientación de las cabezas de moscas en el cuello. C) En esta imagen, las secciones de diferentes cabezas de moscas están orientados de izquierda a derecha en la diapositiva. De arriba a abajo en la diapositiva, las secciones de serie de la misma cabeza de mosca se pueden ver. En este caso, una mosca oculis sine se insertó en la posición tres (flecha). Las secciones se tiñeron por el pigmento fluorescente ojo que lava sobre el secciones después del corte. La barra de escala en A = 5 mm y en C = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. La neurodegeneración progresiva en el mutante queso suizo. Jefe de sección de parafina de 7-día-(A), 14-día-(B) y 21-día-(C) viejos SWS '1 Las moscas. Las puntas de flecha apuntan a vacuolas que se han desarrollado con el envejecimiento. La degeneración relacionada con la edad se cuantificó contando el número de vacuolas y midiendo su área combinada (D). El SEM y el número de moscas analizadas se indica. La barra de escala = 25 micras. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La neurodegeneración se produce con la edad. Sección de la cabeza de parafina de 10-día-(A), 30-día-(B) y 60-día-(C) de edad de tipo salvaje moscas. Las puntas de flecha apuntan a vacuolas que se han desarrollado en las moscas de edad. La degeneración relacionada con la edad se cuantificó contando el número de vacuolas y midiendo su área combinada (D). El SEM y el número de moscas analizadas se indica. La barra de escala = 25 micras. *** P <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ A>

Los autores no tienen nada que revelar.