Name: La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprende a cuantificar la neurodegeneración en cerebros de Drosophila mediante histología de masas sin tinción específica. Este método minimiza errores sistemáticos al procesar moscas control y experimentales como una sola muestra.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones a D.K. de la Fundación de Investigación Médica de Oregón y de NIH/NINDS (NS047663). E.S. fue apoyado por una beca de capacitación de los NIH (T32AG023477).

1. La fijación de la cabeza sobre los cuellos y inclusión en parafina Nota: Todos los pasos en el proceso de fijación debe hacerse en una campana de humos. Metilbenzoato, mientras que no plantean un riesgo para la salud, tiene un olor muy distinto, que puede ser abrumador si no se manejan en una campana de humos. <ol><li> Antes de anestesiar las moscas, conforman 50 ml de solución de Carnoy mediante la adición de 15 ml de cloroformo y 5 ml de ácido acético glacial y 30 ml de etanol al 99% (no mezcle el cloroformo y ácido acético). Se vierte en un recipiente de vidrio con un fondo plano, como por ejemplo un plato de cristalizar, para asegurar que los collares pueden quedar plano y están completamente cubiertas por la solución. </li><li> Anestesiar las moscas con CO 2 o éter. </li><li> moscas de rosca (hasta 20 con la mayoría de los collares) por sus cuellos en los cuellos utilizando fórceps. Recuerde que debe alinear todas las cabezas en la misma orientación, como se ve en la figura 1A, y ser suave para asegurar que no se produzcan daños en la cabeza o los ojos. </li><li> Incluir moscas seno oculis (flechas, Figura 1A) en posiciones aleatorias por lo que el orden de las moscas pueden ser fácilmente identificados en las secciones. Además, si las moscas experimentales tienen un color de ojos claros o blancos, enhebrar algunas moscas de ojos rojos, como el tipo salvaje, entre ellos para garantizar que el pigmento está presente suficiente para teñir la diapositiva. Registrar el orden de las moscas en una hoja de protocolo junto con el número de cuello si se utiliza más de un collar. </li><li> Una vez que un collar se ha terminado, colocarlo en la solución de Carnoy preparado durante 3,5 - 4 h. </li><li> Volcar la solución de Carnoy en el recipiente eliminación adecuada y comenzar los lavados de etanol. Asegúrese de verter lentamente a fin de no perturbar la colocación de los collares en el contenedor. </li><li> Lavar los cuellos de 30 min en 99% de etanol dos veces. </li><li> Lavar los collares en 100% de etanol durante 1 h. Asegúrese de cambiar los lavados a tiempo para evitar overdehydration. </li><li> Poner los collares en metilbenzoatoO / N a temperatura ambiente. Sellar el recipiente con parafilm para evitar la evaporación de la metilbenzoato de metilo. </li><li> Verter la methylbenozate en el recipiente desechable adecuado en la campana de humos. Añadir una mezcla previamente preparada de 1: 1 punto de fusión bajo (56 - 57ºC) cera de parafina y benzoato de metilo. A partir de ahora, los collares necesitan ser mantenidos en una incubadora a 65 ° C para asegurarse de que la parafina no se endurece. </li><li> Vierte el methylbenozate y la mezcla de parafina en el recipiente desechable adecuada, y se vierte cera fundida de parafina pura, se mantiene a 65 ° C, en los cuellos. </li><li> Cambiar la parafina después de 30 minutos y repetir esto por lo menos 5 veces. Al menos 6 - 8 lavados deben realizarse. </li><li> Una vez que los lavados son completos, colocar los collares en una bandeja de cubitos de hielo de goma con ranuras aproximadamente del tamaño de los collares. Verter la parafina fundida sobre ellos hasta que esté completamente cubierto y deje que se endurezca O / N (tratar de evitar burbujas de aire). </li><li> Retire los bloques de parafina contaiNing los collares de la bandeja de cubitos de hielo. Separar el bloque de parafina desde el collar usando una hoja de afeitar, rompiendo suavemente del collar. Las cabezas estarán en el bloque de parafina, mientras que los cuerpos permanecerán en el cuello. Los bloques se pueden mantener a temperatura ambiente. </li><li> Para limpiar los collares, remojar en un agente deparafinization a 65 ° C para eliminar la parafina, limpio, con luz de lavado, y se lava en etanol antes de reutilizar. </li></ol> 2. seccionamiento y de montaje <ol><li> Calentar una placa de calentamiento a 50 ° C. Colocar los portaobjetos (o bloques de montaje de metal) y hojas de afeitar en la placa y dejar que se caliente. </li><li> Dependiendo de la orientación deseada para seccionar, sujetar el bloque de parafina, ya sea con las cabezas hacia el lado (por secciones horizontales) o hacia arriba (para secciones frontales) a un bloque de montaje calentada (fusión brevemente el bloque en el lado de contacto). Retire el bloque de la placa de calentamiento y dejar que se enfríe durante al menos 10 millasn de asegurar que la parafina se ha endurecido lo suficiente para un sellado adecuado en el bloque de montaje. Mantenga la fila de cabezas alineadas en paralelo con la superficie del bloque tanto como sea posible para evitar que las secciones irregulares. </li><li> Tome una hoja de afeitar y recortar el exceso de parafina lejos de las cabezas de la mosca de modo que sólo una pequeña fila con las cabezas incrustadas permanece (la hoja de afeitar puede ser calentado por el recorte más fácil). Asegúrese de no recortar demasiado para que la parafina no se rompa durante el corte (más ajuste se puede hacer durante el corte). </li><li> Coloque el bloque de montaje en el soporte objeto de la microtomo y asegurarse de que la alineación de la fila de cabezas es lo más paralelo posible al borde de la hoja. </li><li> Preparar portaobjetos de microscopio cubriéndolos con una capa delgada de solución de poli-L-lisina (PLL) y dejarlos secar durante 5 minutos. Cubrirlos con agua poco antes de su uso. </li><li> Cortar 7 micras secciones y transferir la cinta de las secciones a la diapositiva flotando en el agua. &lt;br /&gt; NOTA: Para obtener todo el cerebro para las secciones horizontales, recogemos la cinta desde el momento de iniciar el corte en el ojo hasta que la cabeza ha sido completamente cortada (corte de la trompa en el cerebro). Más de una diapositiva puede ser necesario para toda la cabeza. </li><li> Colocar el portaobjetos en una placa de calor a 37 ° C y deje que la cinta se expanda durante aproximadamente 1 minuto. </li><li> Eliminar el exceso de agua (mediante el vertido de su alimentación o el uso de un pañuelo de papel) y secar el portaobjetos S / N. </li><li> Quitar la cera de parafina de la diapositiva mediante la colocación de las diapositivas en una, vertical tarro deslizable tinción alto lleno de un agente deparafinization (cubriendo completamente las secciones). Realizar 3 lavados de 30 min - 60 min cada uno. </li><li> Retire el porta del lavado final. Colocar 2 gotas de medios de incrustación sobre el portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos grande. </li></ol> 3. Fotografiar y análisis de las Secciones <ol><li> Dejar que las muestras preparadas se sequen durante 1 - 2 d. Entonces, examinarlas en un microsc de fluorescenciaope bajo luz azul. </li><li> Use un aumento menor para determinar la orientación de las moscas y para encontrar la región de interés si se centra en una región específica. NOTA: Para los moscas SWS (ver Figura 2), nos encontramos con la sección que contiene el gran comisura y tomar una imagen (por lo general a un aumento de 40X). Al analizar el cerebro entero (como en la figura 3), que desplazarse por todas las secciones de una cabeza y, o bien fotografiar la sección con el fenotipo más grave o todas las secciones que muestran vacuolas. </li><li> Para un análisis doble ciego, tomar y número de imágenes sin conocer el genotipo y registrar el número de cuello y la posición de la cabeza de la fila para identificarlos más tarde. </li><li> Una vez que se han tomado las imágenes, analizarlos utilizando un software de imágenes. </li><li> Contar el número de vacuolas por sección o por cabeza. Para medir el tamaño vacuola, abrir las imágenes en un programa de software y seleccione las vacuolas con una selección demasiadol. Determinar la cantidad de píxeles en las vacuolas seleccionados. </li><li> Para la conversión a 2 micras, tomar una foto de una diapositiva de calibración micrómetro en el aumento que se usa para la adquisición de fotos. Determinar la cantidad de píxeles de 100 micras 2 para calcular un factor de conversión. </li><li> Convertir el número total de píxeles en micras 2 dividiendo el número de píxeles por el factor de conversión calculada en el paso anterior. </li></ol>

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<li>Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+mediates+tau-induced+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila.</a> J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).</li>
<li>Kretzschmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+expression+of+polyglutamine+proteins+induce+behavioral+changes+and+aggregate+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila.</a> Glia. 49, 59-72 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito proporciona un medio para cuantificar la neurodegeneración en el cerebro de Drosophila. Mientras que otros métodos, como contar un tipo celular específico, se pueden utilizar para identificar la neurodegeneración, la ventaja de este método es que se puede aplicar de forma más general. Contando las células requiere que estas células pueden ser identificados de forma fiable utilizando un anticuerpo específico o la expresión de un marcador específico de célula, lo que no siempre está disponible....

Con el aumento de la esperanza de vida, las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson se han convertido en una amenaza creciente para la salud de la población en general. De acuerdo con los Institutos Nacionales de la Salud, 115 millones de personas en todo el mundo se prevé que se afectados por la demencia en 2050. Aunque se han hecho progresos significativos en la identificación de los genes y los factores de riesgo implicados en al menos algunas de estas enfermedades, para muchos de ellos, el subyacente mecanismos moleculares aún no se conocen o no se entiende bien. Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster ofrecen una variedad de ventajas experimentales para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo un ciclo de corta vida, gran número de progenie, y la disponibilidad de métodos genéticos y moleculares bien establecidos y, a veces únicos 1 -12. Además, estos organismos son susceptibles de imparcialpantallas de interacción que pueden identificar los factores que contribuyen a estas enfermedades por sus efectos agravantes o mejorar en fenotipos neurodegenerativos. El análisis de estas interacciones genéticas y la evaluación de los efectos del envejecimiento requiere protocolos cuantitativos para detectar la neurodegeneración y para medir su gravedad. Esta evaluación puede hacerse con relativa facilidad en la medición de los aspectos de comportamiento en Drosophila, como el aprendizaje olfativo, geotaxis negativos, o fototaxis rápido, que proporcionan un valor numérico rendimiento 13-21. También es posible determinar los efectos sobre la supervivencia neuronal contando las neuronas. Sin embargo, esto sólo es posible cuando se centra en una población específica que se pueda identificar claramente, al igual que las neuronas dopaminérgicas que se ven afectados en la enfermedad, e incluso entonces, los resultados han sido controvertidos 22-24. El protocolo descrito aquí utiliza el método de cuello para realizar secciones en serie de parafina, un métodoque fue desarrollado originalmente por Heisenberg y Böhl, que lo utilizó para aislar mutantes anatómicas cerebrales en Drosophila 25. El uso del método de cuello posteriormente se ha adaptado, incluso en criosecciones, vibratome secciones y secciones de plástico de 26-28. Aquí, se emplea este método para obtener secciones en serie de toda la cabeza de la mosca, que luego se puede utilizar para medir las vacuolas que se desarrollan en las moscas con fenotipos neurodegenerativas 16,21,29-32. Estas mediciones se pueden hacer en áreas específicas del cerebro o pueden cubrir todo el cerebro; el último enfoque permite identificar incluso débiles fenotipos degenerativas, como se observa durante el envejecimiento. Por último, cuando se utilizan los collares, hasta 20 moscas pueden ser procesados ​​como una preparación, que no sólo es menos tiempo, sino que también permite el análisis de control y las moscas experimentales en la misma preparación, minimizando artefactos debido a ligeros cambios en la preparación.

<table><tbody><tr><td>Nombre del reactivo/equipo</td><td>Número</td> de <td>catálogo</td><td></td>de la empresa</tr><tr><td>Collar</td><td>Genesee Scientific</td><td>TS 48-100</td><td>Estamos utilizando collares hechos a medida que están hechos de una sola pieza de metal en lugar de capas como los de Genesee. Una descripción sobre cómo hacer collares se puede encontrar en http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html&nbsp;</td></tr><tr><td>Bandeja de cubitos de hielo de goma para incrustar</td> Tienda <td></td><td>para el hogar</td><td>El tamaño se puede hacer a medida pegando paredes adicionales&nbsp;</td></tr><tr><td>Plato de cristalización</td><td>Fisher Scientific company</td><td>08-762-3</td><td></td></tr><tr><td>Ether</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>E138-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Choloroformo</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Metilbenzoato</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>M205-500</td><td>Olor distintivo - ¡Uso en campana extractora!</td></tr><tr><td>Cera de parafina de bajo punto de fusión</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>T565</td><td>Asegúrese de mantener extra derretido en un 65&deg; C</td></tr><tr><td>Microtomo</td> de baño de agua <td>Leica Biosystems</td><td>Reichert Jung 2040 Autocut</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-550D</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de cristal del microscopio</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>SafeClear</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>314-629</td><td>Tres recipientes diferentes para lavados</td></tr><tr><td>Tarro de tinción vertical con Portada</td><td>Ted Pella Inc.&nbsp;</td><td>432-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-L-lisina (PLL)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P8290-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; drosophila</em

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

enfermedades neurodegenerativas progresivas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (EP) son una amenaza creciente para la salud humana en todo el mundo. Aunque los modelos de mamíferos han aportado importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la patogenicidad, la complejidad de los sistemas de mamíferos, junto con sus altos costos están limitando su uso. Por lo tanto, la simple pero bien establecido modelo de sistema de Drosophila ofrece una alternativa para la investigación de las vías moleculares que se ven afectados en estas enfermedades. Además de anomalías de comportamiento, enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por fenotipos histológicos tales como la muerte neuronal y axonopatía. Para cuantificar la degeneración neuronal y para determinar cómo se ve afectada por factores genéticos y ambientales, usamos un enfoque histológico que se basa en la medición de las vacuolas en el cerebro de moscas adultas. Para minimizar los efectos del error sistemático y la comparación directa de las secciones de control y experimental moscas en una preparación, que utilizan el método de &quot;cuello&quot; de las secciones de parafina. La neurodegeneración se evalúa a continuación, midiendo el tamaño y / o número de vacuolas que se han desarrollado en el cerebro de la mosca. Esto se puede hacer ya sea centrándose en una región específica de interés o mediante el análisis de todo el cerebro mediante la obtención de secciones en serie que abarcan la cabeza completa. Por lo tanto, este método permite medir no sólo la degeneración severa, pero también fenotipos relativamente suaves que sólo son detectables en algunas secciones, como ocurre durante el envejecimiento normal.

Utilizando los resultados método descrito en secciones seriadas teñidas por el pigmento del ojo 33 que abarcan toda la cabeza de la mosca. A parte de esto se muestra en la Figura 1B, donde las secciones de una cabeza individuales se muestran de arriba a abajo. Las secciones de diferentes moscas son vistos de izquierda a derecha en este ejemplo. Para facilitar la orientación y la identificación de las moscas, una mosca sin ojos (oculis sinusoidales) se...

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la neurodegeneración en el cerebro de Drosophila, provocada por diversos factores incluyendo la edad, modificaciones genéticas o influencias ambientales, sin necesidad de tinciones específicas. Este método es muy útil para analizar preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, tales como ¿qué genes o factores ambientales causan o contribuyen a estas enfermedades?La principal ventaja de este método es que evita o minimiza los errores sistemáticos porque las moscas de control y las moscas experimentales se tratan como una sola muestra. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, ya que se requiere práctica para asegurar que la zona correcta del cerebro quede sobre el portaobjetos y para prevenir daños que puedan ocurrir durante el corte. Para comenzar, primero use pinzas para insertar las moscas sujetas por el cuello dentro de los collares.Coloque todas las cabezas en la misma orientación y asegúrese de que no se produzcan daños en la cabeza ni en los ojos. Incluya aleatoriamente moscas sin ojos (Eyeless Senoculus Flies) en posiciones conocidas para que el orden de las moscas

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Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria...

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

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A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA)...

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Aquí, proporcionamos protocolos para realizar tres ensayos simples de degeneración de axón inducida por lesiones (muerte por axón) en Drosophila melanogaster para evaluar la preservación morfológica y funcional de los axones cortados y sus sinapsis.

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

El objetivo de este procedimiento es diseccionar el tejido del músculo longitudinal dorsal (DLM) para evaluar la integridad estructural de las uniones neuromusculares DLM (NMJ) en modelos de enfermedad neurodegenerativa utilizando Drosophila melanogaster.

Visualización de la degeneración sináptica en Drosophila adulta en asociación con neurodegeneración

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Aprende a cuantificar la neurodegeneración en cerebros de Drosophila mediante histología de masas sin tinción específica. Este método minimiza errores sistemáticos al procesar moscas control y experimentales como una sola muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en

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