codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.
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Artículo de método
Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en
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Resumen
Resumen
El cribado genético avanzado en organismos modelo es el caballo de batalla para descubrir genes y vías funcionalmente importantes en muchos procesos biológicos. En la mayoría de los exámenes de detección basados en mutagénesis, los investigadores se han basado en el uso de productos químicos tóxicos, carcinógenos o irradiación, lo que requiere equipo designado, configuración de seguridad y/o eliminación de materiales peligrosos. Hemos desarrollado un enfoque simple para inducir mutaciones hereditarias en C. elegans utilizando histonas miniSOG expresadas en la línea germinal, un potente generador de especies reactivas de oxígeno inducible por luz. Este método de mutagénesis está libre de productos químicos tóxicos y requiere una seguridad mínima de laboratorio y gestión de residuos. Las modificaciones inducidas en el ADN incluyen cambios de un solo nucleótido y pequeñas deleciones, y complementan las causadas por la mutagénesis química clásica. Esta metodología también se puede utilizar para inducir la integración de transgenes extracromosómicos. Aquí, proporcionamos los detalles de la configuración del LED y los protocolos para la mutagénesis estándar y la integración de transgenes.
Introducción
Pantallas adelante genéticos han sido ampliamente utilizados para generar mutantes genéticos de alteración diversos procesos biológicos en organismos modelo tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Los análisis de los mutantes de este tipo conducen al descubrimiento de genes funcionalmente importantes y sus vías de señalización 1,2. Tradicionalmente, la mutagénesis en C. elegans se consigue utilizando productos químicos mutagénicos, radiación o transposones 2. Los productos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) y N-etil-N -nitrosourea (ESN) son tóxicos para los seres humanos; r....
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Protocolo
1. Construcción de la luz de aviso
NOTA: El equipo requerido LED se resume en la Lista de Materiales. Toda la configuración del LED es pequeña y se puede colocar en cualquier lugar en el laboratorio, aunque se recomienda que se coloca en un cuarto oscuro para el control de exposición a la luz de los gusanos 4.
- Conectar el LED a un controlador con cables (Figura 1 A, D).
- Conectar el controlador a una función de generador / amplificador digital con un cable BNC (Figura 1 A, C, D).
- Fijar los LED de luz de 10 cm por encima del escenario utilizando un soporte personalizado (Figura ....
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Resultados
Se realizó un rastreo genético adelante con CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) mediante exposición a la luz 30 min siguiendo el protocolo estándar descrito en las secciones 2 y 3. Entre 60 placas F 1 que corresponden a 120 genomas haploides mutagenizados, encontramos 8 F 1 con placas F 2 gusanos que exhiben fenotipos visibles como defecto el tamaño del cuerpo (Figura 3B), el movimiento no coordinado (Figura 3C), y la .......
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Discusión
A continuación, describimos un procedimiento detallado de mutagénesis usando optogenético Su-MSOG expresa en la línea germinal y proporcionar un ejemplo de una pantalla genética hacia delante pequeña escala. En comparación con mutagénesis química estándar, este método de mutagénesis optogenético tiene varias ventajas. En primer lugar, es no tóxico, manteniendo de esta manera el personal de laboratorio fuera de mutágenos químicos tóxicos como el EMS, ENU y trimetilpsoraleno con luz ultravioleta (TMP / UV). En segundo lug.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo está respaldado por HHMI. Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio por su ayuda para probar el protocolo y revisar el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fuente de luz LED de ultra alta potencia | Prizmatix | UHP-mic-LED-460 | 460 ± 5 nm |
| Controlador LED | Prizmatix | UHPLCC-01 | |
| Generador/amplificador de función digital | PASCO | PI-9587C | PI-9587C ya no está disponible. El reemplazo es PI-8127. |
| Cable BNC macho/macho | THORLABS | CA3136 | |
| Interfaz USB-TTL | Fotómetro Prizmatix | Opcional | |
| THORLABS | PM50 y Modelo D10MM | ||
| Papel de filtro | Whatman | 1001-110 | |
| Microscopio estereoscópico | Leica | MZ95 | |
| Placa | NGMDisolver 5 g de NaCl, 2,5 g de Peptona, 20 g de Agar, 10 µ g/mL de colesterol en 1 L H2O. Después del esterilizado en autoclave, agregue 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mM 2PO4 (pH 6.0). | ||
| Solución | 10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 & g/mL de proteinasa K |
Referencias
- Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
- Collins, J., Saari, B., Anderson, P.
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Reimpresiones y permisos
