Artículo de método

Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 de noviembre de 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

En este artículo

Resumen

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codificado genéticamente-histona-miniSOG induce mutaciones hereditarias en todo el genoma de una manera dependiente de la luz azul. Este método de mutagénesis es simple, rápido, libre de productos químicos tóxicos y muy adecuado para la detección genética hacia adelante y la integración del transgén.

Resumen

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El cribado genético avanzado en organismos modelo es el caballo de batalla para descubrir genes y vías funcionalmente importantes en muchos procesos biológicos. En la mayoría de los exámenes de detección basados en mutagénesis, los investigadores se han basado en el uso de productos químicos tóxicos, carcinógenos o irradiación, lo que requiere equipo designado, configuración de seguridad y/o eliminación de materiales peligrosos. Hemos desarrollado un enfoque simple para inducir mutaciones hereditarias en C. elegans utilizando histonas miniSOG expresadas en la línea germinal, un potente generador de especies reactivas de oxígeno inducible por luz. Este método de mutagénesis está libre de productos químicos tóxicos y requiere una seguridad mínima de laboratorio y gestión de residuos. Las modificaciones inducidas en el ADN incluyen cambios de un solo nucleótido y pequeñas deleciones, y complementan las causadas por la mutagénesis química clásica. Esta metodología también se puede utilizar para inducir la integración de transgenes extracromosómicos. Aquí, proporcionamos los detalles de la configuración del LED y los protocolos para la mutagénesis estándar y la integración de transgenes.

Introducción

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Pantallas adelante genéticos han sido ampliamente utilizados para generar mutantes genéticos de alteración diversos procesos biológicos en organismos modelo tales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Los análisis de los mutantes de este tipo conducen al descubrimiento de genes funcionalmente importantes y sus vías de señalización 1,2. Tradicionalmente, la mutagénesis en C. elegans se consigue utilizando productos químicos mutagénicos, radiación o transposones 2. Los productos químicos tales como metanosulfonato de etilo (EMS) y N-etil-N -nitrosourea (ESN) son tóxicos para los seres humanos; rayos gamma o ultravioleta (UV) mutagénesis radiación requiere equipo especial; y las cepas de tipo transposón activo, tales como cepas mutantes 3, pueden causar mutaciones innecesarios durante el mantenimiento. Hemos desarrollado un método simple para inducir mutaciones hereditarias utilizando un fotosensibilizador codificado genéticamente-4.

Especies reactivas del oxígeno (ROS) pueden dañar el ADN 5.El generador de mini oxígeno singlete (miniSOG) es una proteína verde fluorescente de 106 aminoácidos que fue diseñado a partir de la lista de valores (luz, oxígeno, y voltaje) de dominio de Arabidopsis phototropin 2 6. Tras la exposición a la luz azul (~ 450 nm), miniSOG genera ROS incluyendo oxígeno singlete con fl avin mononucleótido como cofactor 6-8, que está presente en todas las células. Hemos construido una proteína de fusión His-MSOG mediante el etiquetado de miniSOG a la C-terminal de la histona-72, un C. elegans variante de la histona 3. Hemos generado un transgén de una sola copia 9 para expresar Su-MSOG en la línea germinal de C. elegans. En condiciones normales de cultivo en la oscuridad, los gusanos transgénicos Su-MSOG tiene la cría de tamaño normal y duración de la vida 4. Tras la exposición a la luz LED azul, los gusanos Su-MSOG producen mutaciones hereditarias entre su progenie 4. El espectro de mutaciones inducidas incluye cambios de nucleótidos, tales como G: C a T: A y G: C a C: G, y los pequeños chromosoMe supresiones 4. Este procedimiento de mutagénesis es fácil de realizar y requiere una configuración mínima seguridad en el laboratorio. A continuación, se describe la configuración de la iluminación LED y procedimientos para la mutagénesis optogenético.

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Protocolo

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1. Construcción de la luz de aviso

NOTA: El equipo requerido LED se resume en la Lista de Materiales. Toda la configuración del LED es pequeña y se puede colocar en cualquier lugar en el laboratorio, aunque se recomienda que se coloca en un cuarto oscuro para el control de exposición a la luz de los gusanos 4.

  1. Conectar el LED a un controlador con cables (Figura 1 A, D).
  2. Conectar el controlador a una función de generador / amplificador digital con un cable BNC (Figura 1 A, C, D).
  3. Fijar los LED de luz de 10 cm por encima del escenario utilizando un soporte personalizado (Figura 1A).
    NOTA: Se realizó el soporte con piezas metálicas.
  4. Cubrir la configuración de la iluminación LED en parte, pero evitar la acumulación de calor (Figura 1B), lo que hace que los gusanos enfermos.
    NOTA: Nosotros usamos una cubierta de plástico duro de la medida con la parte superior abierta e inferior (Figura 1A). La cubierta no se requiere para la propia mutagénesis, pero se utiliza to limitar la exposición innecesaria de la luz azul para el entorno. Aconsejamos de no cubrir totalmente la configuración de LED (Figura 1B) para evitar el sobrecalentamiento de los gusanos.
  5. Use gafas de protección láser.
    NOTA: Use gafas de protección láser, porque la luz es muy brillante. Gafas de sol pueden funcionar tan bien.
  6. Cambiar la palanca del regulador del LED para 'Int.' para la iluminación continua (Figura 1D) y programar a 65% de la potencia máxima (Figura 1C).
  7. Utilice un fotómetro para medir la intensidad de la luz azul en la etapa en la que los gusanos se colocan usando el protocolo del fabricante. La configuración da 2,0 mW / mm2 bajo iluminación continua.

2. El tratamiento de luz azul

NOTA: Utilice la cepa CZ20310 juSi164 [pMex-5-SU-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III 4 La cepa está disponible. en el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Mantener la cepa Su-MSOG en la oscuridad en medio de crecimiento de nematodos estándar (NGM) placas con E. OP50 coli siguiendo un protocolo estándar de 10,11.
    NOTA: Bajo la luz ambiente, juSi164 cepas -Con no muestran una tasa de mutación espontánea por encima de una tasa de 4. paso cepa de rutina usando un microscopio de disección con una lámpara halógena generalmente no causa mutaciones también. No obstante, se debe tener cuidado para evitar la exposición innecesaria a la luz, por ejemplo, manteniendo las cepas en una incubadora oscura en el interior estándar, o cubriendo las cepas con papel de aluminio. Se aconseja congelar alícuotas de la cepa después de recibirlo en caso de que las mutaciones se acumulan con el tiempo innecesarias.
  2. Escoja grávidas adultos jóvenes (12 h post-L4) a unos animales con un gusano recogen 11.
    NOTA: Los animales más jóvenes muestran un menor efecto mutagénico 4, mientras que los animales más viejos pueden tener menor tamaño de la camada.
  3. Corte un filtro de paper para adaptarse a una placa de 60 mm con un 25 mm x 25 mm agujero cuadrado y colocarlo sobre una placa de cabeza de serie (Figura 1E).
    NOTA: Un punzón cuadrado puede ser utilizado, pero el tamaño del punzón no tiene que ser preciso.
  4. Caída de 100 l de 100 mM CuCl 2 en el papel de filtro de manera uniforme para restringir gusanos dentro del orificio cuadrado en el plato.
  5. Anotar número deseado de grávidas hermafroditas adultos jóvenes (ver paso 3 para un ejemplo) y traslado al centro de la placa CuCl2.
  6. Utilice gafas de protección láser.
  7. Interruptor en el LED y el generador de funciones.
  8. Cambiar la palanca del regulador del LED para Ext. ' para controlar por el generador de funciones (Figura 1D).
  9. Ajuste el controlador en el 65% de la potencia máxima y el generador de funciones como onda sinusoidal, 4 Hz (Figura 1C).
  10. Coloque la placa de CuCl 2 de la Etapa 2.5 sin tapa en el escenario bajo el LED (Figura 1A </ Strong>).
  11. Iluminar los animales con la luz azul durante 30 minutos.
  12. Transferir los gusanos de aspecto saludable a una placa sembrada como P 0.
    NOTA: El número deseado de P 0 depende del tipo de pantalla. Consulte el paso 3 para un ejemplo. Los P 0 gusanos pueden parecer no coordinado inmediatamente después del tratamiento y la luz se recuperarán con el tiempo.
  13. Mantenga gusanos cubiertos usar papel aluminio en una incubadora o en la oscuridad; y seguir el procedimiento estándar para el tamizaje de fenotipos deseados entre su progenie 2,10.

3. Ejemplo de una pantalla adelante genéticos

NOTA:. Este es un ejemplo de la pantalla clonal con 120 genomas haploides para comprobar si el LED y la tensión están trabajando Figura 2 muestra un esquema del procedimiento.

  1. [Día 1] Después de tratamiento con luz azul, recoger cinco gusanos de aspecto saludable en una placa de NGM con OP50 como P 0, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante 1d (placa 'día 1').
  2. [Día 2] Transferencia de P0 a una nueva placa de cabeza de serie (placa 'Día 2').
  3. [Día 3] Escoja y matar P 0 en la placa del 'Día 2' quemándolas.
  4. [Día 4] Recoger 30 grávido adulto joven F 1 de la placa del 'día 1' y transferirlos en placas individuales (30 F 1 Placas para 'Día 1').
  5. [Día 5] Repita el paso 3.4 para la placa de 'Día 2' (30 F 1 Placas para 'Día 2').
  6. [Day7-9] Comprobar las morfologías y / o el comportamiento de F 2 gusanos en comparación con la cepa WT (Figura 3A) anormales bajo un microscopio estereoscópico estándar cuando se convierten en adultos.
    NOTA: una mutación hereditaria muestras sobre una cuarta parte de los gusanos con el mismo fenotipo entre F2 cuando es recesiva con alta penetrancia. Sin embargo, algunos mutantes pueden crecer lentamente y / o mostrar penetrancia parcial. Por lo tanto, es posible que menos de un cuarto de los mutantes se puede encontrar en unaplato.
  7. Recoger los gusanos con fenotipos visibles individualmente y comprobar la heredabilidad del fenotipo en la generación siguiente.

4. Ejemplo de integración del transgén Extracromosómica

  1. Inyectar el ADN de interés en CZ20310 juSi164 [pMex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-UNC-119 (+)] unc-119 (ed3) y preparar los gusanos transgénicos con una baja tasa de transmisión (10-30%) después de un 12,13 protocolo de inyección estándar.
    NOTA: Como alternativa, extracromosómicos arrays establecidos pueden ser cruzadas en las cepas juSi164. Para evitar el genotipado para juSi164, heterocigotos juSi164 se pueden usar como el P 0 aunque la eficiencia puede ser disminuida. El método de genotipificación para juSi164 se describe en la Sección 5.
  2. [Día 1] Tratar ~ 20 animales transgénicos como P 0 con luz azul, como se describe en el paso 2.
    NOTA: Más P 0 gusanos son necesarias en función de la tr tasa ansmission. Los transgenes pueden ser identificados por fenotipos o 12,13 marcador coinyección.
  3. Recoger 10 P aspecto saludable 0 en placas individuales, mantenerlos en un 20 ° C incubadora, y dejar que ellos ponen sus huevos durante unos días (P) 0 placas
  4. [Día 4] singularizar 20 transgénico F1 gusanos de cada placa P 0 en placas individuales y dejar que ellos ponen huevos. (20 F 1 x 10 P = 0 placas 200 F 1 placas en total).
  5. [Día 7] Encuentra F1 placas con> 75% de F 2 que tienen transgenes.
  6. Escoja cinco animales transgénicos de la velocidad de transmisión de> 75% de F 1 F 2 placas (placas).
  7. [Día 10] Mantener F 2 placas con velocidad de transmisión de 100% como líneas integradas potenciales.
  8. Outcross las posibles líneas integradas, utilizando un procedimiento estándar 10 para comprobar la segregación mendeliana y para eliminar posibles mutaciones de fondo.
Le "> 5. Genotipado

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 gusanos en tampón de lisis utilizando un protocolo estándar 14.
  2. Realizar PCR usando los cebadores para la inserción MosSCI 9, juSi164, (Tabla 1) con una temperatura de hibridación de 58 ° C siguiendo un protocolo estándar 14.
    NOTA: No es necesario determinar el genotipo de UNC-119 (ed3) debido a UNC-119 (ed3) puede ser detectado por conducta no coordinada después de retirar el transgén rescate (juSi164) en los siguientes pasos 5.4 y 5.5.
  3. Ejecutar electroforesis en gel de agarosa 15 y examinar los tamaños de las bandas (Tabla 1) para encontrar el tiempo de acceso a juSi164.
  4. Examinar si la progenie F 2 ha paralizado gusanos debido a la existencia de UNC-119 (ed3).
  5. Si se encuentran los gusanos no coordinados en el paso 5.4, solo varios gusanos nonuncoordinated para obtener todos los gusanos nonuncoordinated en la próxima generación.

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Resultados

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Se realizó un rastreo genético adelante con CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) mediante exposición a la luz 30 min siguiendo el protocolo estándar descrito en las secciones 2 y 3. Entre 60 placas F 1 que corresponden a 120 genomas haploides mutagenizados, encontramos 8 F 1 con placas F 2 gusanos que exhiben fenotipos visibles como defecto el tamaño del cuerpo (Figura 3B), el movimiento no coordinado (Figura 3C), y la ...

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Discusión

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A continuación, describimos un procedimiento detallado de mutagénesis usando optogenético Su-MSOG expresa en la línea germinal y proporcionar un ejemplo de una pantalla genética hacia delante pequeña escala. En comparación con mutagénesis química estándar, este método de mutagénesis optogenético tiene varias ventajas. En primer lugar, es no tóxico, manteniendo de esta manera el personal de laboratorio fuera de mutágenos químicos tóxicos como el EMS, ENU y trimetilpsoraleno con luz ultravioleta (TMP / UV). En segundo lug...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El trabajo está respaldado por HHMI. Agradecemos a nuestros miembros del laboratorio por su ayuda para probar el protocolo y revisar el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fuente de luz LED de ultra alta potenciaPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
Controlador LEDPrizmatixUHPLCC-01
Generador/amplificador de función digitalPASCOPI-9587CPI-9587C ya no está disponible. El reemplazo es PI-8127.
Cable BNC macho/machoTHORLABSCA3136
Interfaz USB-TTLFotómetro PrizmatixOpcional
THORLABSPM50 y Modelo D10MM
Papel de filtroWhatman1001-110
Microscopio estereoscópicoLeicaMZ95
PlacaNGMDisolver 5 g de NaCl, 2,5 g de Peptona, 20 g de Agar, 10 µ g/mL de colesterol en 1 L H2O. Después del esterilizado en autoclave, agregue 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 25 mM 2PO4 (pH 6.0). 
Solución10 mM Tris (pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 & g/mL de proteinasa K
de lisis

Referencias

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