Un modelo de remodelamiento cardiaco A través de la constricción de la aorta abdominal en ratas

Resumen

Se describe un modelo de rata de constricción aórtica abdominal que induce hipertrofia y remodelación cardíaca. Se utiliza un método eficiente, altamente reproducible y mínimamente invasivo para proporcionar una plataforma simple pero útil para la investigación de la hipertrofia y disfunción miocárdica.

Resumen

La insuficiencia cardíaca es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Es un síndrome clínico complejo que incluye fatiga, disnea, intolerancia al ejercicio y retención de líquidos. Con la insuficiencia cardíaca se desarrollan cambios en la estructura miocárdica, la conducción eléctrica y el metabolismo energético, lo que conduce a disfunción contráctil, mayor riesgo de arritmias y muerte súbita. La enfermedad cardíaca hipertensiva es uno de los factores clave que contribuyen a la remodelación cardíaca asociada con la insuficiencia cardíaca. El modelo animal más utilizado que imita la cardiopatía hipertensiva se crea a través de intervenciones quirúrgicas, como el estrechamiento de la aorta. La constricción de la aorta abdominal es una técnica experimental útil para inducir una sobrecarga de presión, que conduce a la insuficiencia cardíaca. La cirugía se puede realizar fácilmente, sin necesidad de apertura torácica ni ventilación mecánica. La patología cardíaca inducida por la constricción de la aorta abdominal progresa gradualmente, lo que hace que este modelo sea relevante para la insuficiencia cardíaca hipertensiva clínica. La lesión cardíaca y la remodelación se pueden observar 10 semanas después de la cirugía. El método descrito aquí proporciona un enfoque simple y efectivo para producir un modelo animal de enfermedad cardíaca hipertensiva que es adecuado para estudiar los mecanismos de la enfermedad y para probar nuevas terapias.

Introducción

La insuficiencia cardiaca es un síndrome complejo clínica, los síntomas de los cuales incluyen fatiga, disnea, intolerancia al ejercicio, y la retención de líquidos en los tejidos periféricos. Es la causa principal de muerte en los países desarrollados ^1. Aparte de la miocardiopatía hereditaria causada por mutaciones en las proteínas del sarcómero o canales de iones ^2, disfunción miocárdica puede ser causado por una variedad de condiciones médicas, incluyendo la hipertensión, las enfermedades cardíacas valvulares, la obesidad y la diabetes ^3. Los cambios en la estructura del miocardio, la conducción eléctrica, y el plomo metabolismo energético a insuficiente capacidad de bombeo cardiaco para satisfacer la demanda circulatoria, que en última instancia se traduce en insuficiencia cardíaca ^3,4. La investigación de los mecanismos que subyacen a la insuficiencia cardíaca, por lo tanto, es fundamental en el campo de la investigación cardiovascular. La identificación de los mecanismos moleculares que conducen a la progresión de la insuficiencia cardíaca con el tiempo puede ayudar en el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas o biomarcadores útiles 1. Por tanto, es importante desarrollar modelos animales insuficiencia cardíaca que comparten características clínicas clave con insuficiencia cardíaca en seres humanos ^5.

La hipertrofia cardiaca y remodelación juega un papel crítico en el desarrollo de la insuficiencia cardíaca. La cardiopatía hipertensiva es el factor clave que contribuye de la hipertrofia cardíaca y la remodelación de mala adaptación observada en pacientes humanos ^1. Para imitar estas condiciones humanas, los modelos animales a menudo se establecen a través de procedimientos quirúrgicos. En particular, la aorta abdominal transversal o puede ser constreñido para aumentar la resistencia contra el ventrículo izquierdo, que en última instancia conduce a una sobrecarga de presión en el corazón. Este fenómeno da lugar generalmente a la hipertrofia cardíaca, una compensación fisiológica de los cardiomiocitos para satisfacer la demanda funcional del sistema cardiovascular. Sin embargo, la demanda funcional anula los mecanismos compensatorios fisiológicos normales, lo que conduce a la fibrosis cardiaca y Contracdeterioro del azulejo. cirugía transversal constricción de la aorta (TAC) a menudo implica procedimientos complicados, incluyendo toracotomía, la ventilación mecánica y la separación del timo y el tejido graso del arco aórtico. Por el contrario, constricción de la aorta abdominal requiere técnicas experimentales simples ^6-8. La aorta abdominal, entre la izquierda y la arteria renal derecha, se constriñe durante la cirugía. La hipertrofia cardiaca y la remodelación se pueden observar varias semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal ^6-8; que producen la enfermedad cardíaca hipertensiva robusta similar a la generada por la cirugía constricción de la aorta transversal ^9,10. A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo la constricción de la aorta abdominal en ratas utilizando un método eficiente y altamente reproducible y mínimamente invasiva. La aorta abdominal adyacente a las arterias renales se estrecha por un bucle de 0,72 mm formada por un hilo de seda 4-0. Diez semanas después de la cirugía, la hipertrofia cardíaca y Remodelinse puede observar g. El modelo de rata de la hipertrofia cardíaca constricción inducida por la aorta abdominal proporciona una plataforma para el estudio de mecanismos de la enfermedad y la fisiopatología, así como el desarrollo de terapias potenciales.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH publicación no. 85-23, revisada en 1996). Este protocolo fue aprobado por y de acuerdo con las directrices establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en la Universidad Nacional de Taiwán.

1. Cirugía Animal

1. Preparar una aguja G 22 jeringa embotando la punta de la aguja en una piedra de afilado. Con unas pinzas, plicar la aguja a un ángulo recto.
2. Antes de la cirugía, la preparación de los instrumentos necesarios quirúrgicos y materiales, así como una jaula de recuperación. Autoclave todos los instrumentos y suministros quirúrgicos antes de su uso.
3. Mantener las ratas alrededor de 200 g, y mantenerlos bajo 12 horas de luz / oscuridad ciclos a una temperatura controlada (21 ± 2 ° C) con acceso libre a comida y agua. Incluye por lo menos 6 ratas de cada grupo. Anestesiar las ratas con pentobarbital(75 mg / kg en 0,5 ml, ip) u otro agente anestésico adecuado. Confirmar la profundidad de la anestesia probando el reflejo de la cola.
   NOTA: La ausencia de reflejo de la cola es un indicador de la anestesia adecuada.
4. Colocar una rata en posición supina sobre una plataforma de la cirugía con una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo. Afeitarse la región abdominal de la rata con una cortadora de cabello animal y loción removedor del pelo para evitar contaminaciones quirúrgicos. Frote el abdomen limpiamente afeitada con betadine u otro reactivo de limpieza antes de la cirugía.
   NOTA: Es importante mantener un campo estéril durante todo el procedimiento.
5. Se practica una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del abdomen con un bisturí. El uso de solución salina normal, mantenga el órgano abdominal húmeda durante la cirugía. Plegar los órganos digestivos con cuidado a un lado el uso de bolas de algodón para exponer la vena cava inferior que se encuentra en la región peritoneal posterior. Identificar la aorta abdominal, que se encuentra yuxtapuesta a y por lo general en elizquierdo de la vena cava inferior.
   NOTA: La aorta abdominal es el recipiente que late al ritmo de la frecuencia cardiaca.
6. Perforar el peritoneo con un par de pinzas para descubrir los vasos debajo. aislar suavemente la aorta abdominal adyacente a las arterias renales y aprobar un 8 cm de longitud sutura de seda 4-0 por debajo de la aorta abdominal entre los orígenes de la derecha y la izquierda arterias renales.
7. Hacer un doble nudo flojo con la sutura; dejar un bucle de 3 mm de diámetro, y colocar la aguja 22 G romo y se inclinó dentro del bucle. Apretar el nudo alrededor de la aorta y la aguja y retire la aguja de inmediato para lograr una constricción de 0,7 mm de diámetro.
8. Cierre de la cavidad abdominal con 6-0 material de sutura absorbible. Suturar las incisiones del músculo o la piel con suturas interrumpidas simples. Para prevenir la infección, frote la zona quirúrgica con una tintura de yodo.
9. Observar el animal con cuidado hasta que recupere la conciencia suficiente, como se indica por la libre circulacióny la ingesta de alimentos. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Para prevenir el dolor después de la cirugía, el tratamiento de la rata con paracetamol (300 mg / kg en 0,5 ml, ip).
   NOTA: Los usuarios deben administrar analgésicos según lo aprobado por las políticas institucionales.

2. Tejido y Recogida de muestras de sangre

1. A las 10 semanas posteriores a la cirugía, pese la rata y anestesiar con pentobarbital (75 mg / kg en 0,5 ml, ip). Antes de la cirugía, confirmar la profundidad de la anestesia mediante pruebas de su reflejo de la cola. Coloque la rata en una bandeja de metal.
2. Se practica una incisión de 2 cm a lo largo de la línea media del cuello utilizando un bisturí. Plegar los músculos cuidadosamente con unas pinzas para exponer la tráquea. Observe cuidadosamente para identificar las arterias carótidas, que son paralelas a la tráquea y pulsan en el tiempo con la frecuencia cardíaca.
3. Recoger la sangre de la arteria carótida en un tubo de recogida de sangre revestido con EDTA. inmediatamente centrífugala sangre durante 15 minutos a 2000 xg y recoger el plasma. Almacenar el plasma sanguíneo a -80 ° C hasta que se necesite.
4. Hacer una incisión de 5 cm en la región torácica, alrededor de la línea media del proceso xifoides. Perforar el diafragma con pinzas cortantes. Con un par de tijeras, cortar y quitar la caja torácica a lo largo de las líneas de media clavicular en ambos lados para exponer el corazón. Escindir el corazón cuidadosamente a lo largo de las fronteras cardíacas y vasculares. Retire el corazón suavemente sin agarrar el tejido.
5. Montar el corazón en un aparato de perfusión Langendorff modificado por atar el tronco aórtico a la aguja de perfusión. Perfundir el corazón con tampón de Krebs (NaCl 110 mM que contiene, KCl 2,6 mM, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1.2 mM de _{MgSO4, NaHCO3} 25 mM y glucosa 11 mM [pH 7,4]) para lavar la sangre. Se pesa el corazón y calcular el índice corazón de peso a peso corporal. Fijar el corazón con 4% de paraformaldehído en el hielo. Recuerde usar una máscara, ya que el vapor es paraformaldehído toxic.

3. Cuantificación del tejido de la fibrosis

1. Coloque el tejido del corazón paraformaldehído-fijo en un dispositivo de seccionamiento de tejido y corte de 2 mm de grosor. Colocar las secciones de tejido en un casete de la incrustación. Deshidratar el tejido a través de una serie de baños de alcohol graduadas (50%, 75%, 95%, y 100% durante 1 hora cada uno).
2. Infiltrarse en el tejido con xileno durante 1 hora y finalmente en la cera durante 1 hora. Coloque el tejido infiltrado en un casete de inclusión y empotrar con cera de parafina. Almacenar los tejidos embebidos en bloques de parafina a temperatura ambiente hasta que microtomo.
3. Cortar el tejido embebido en 4 micras de grosor. Coloque las secciones en un baño de agua de 45 ºC. Sumergir un portaobjetos de vidrio en el baño de agua a un ángulo y acercarse poco a poco los bordes de sección de parafina para permitir la unión parcial a la diapositiva.
4. Mueva el deslizarse dentro y fuera del baño para eliminar las posibles burbujas de aire debajo de la sección de tejido y para facilitar una mejor unión. t secase desliza a 37 ºC durante 1 hora y almacenar a temperatura ambiente durante la tinción histológica.
5. Ponga la diapositiva en un tanque. Desparafinar el portaobjetos con xileno durante 30 min y rehidratar en alcohol diluido secuencialmente (95%, 75%, y 50% para 3 min cada uno) y finalmente en agua destilada. Utilice solución de color rojo picrosirius adecuada para cubrir completamente las secciones de tejido durante 1 hora. Enjuague los portaobjetos en una solución de ácido acético al 0,5% para los dos cambios, y luego realizar dos lavados en alcohol absoluto.
6. El aire seco de la corredera y el soporte de diapositivas en resina sintética con un cubreobjetos. Fotografiar la diapositiva en un campo de luz visible.
   NOTA: El área roja en la fotografía muestra una zona positiva rojo picrosirio bajo un microscopio a 200X aumentos. Calcular el porcentaje de la zona positiva rojo picrosirius sobre el área total, que indica la extensión de la fibrosis ^11.

4. La troponina Cuantificación de sangre

1. Cuantificar los niveles de troponina en plasmausando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Ensayo de cada muestra por duplicado. Carga de 50 l de plasma de la sangre y 50 l de un cóctel de anticuerpos en los pocillos apropiados. Sellar la placa e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas a 400 rpm.
   NOTA: la troponina cardiaca en el plasma es un marcador de lesión cardiaca.
2. Aspirar el líquido y lavar cada pocillo con 250 l de tampón de lavado tres veces. Después del último lavado, invierta la placa y secar contra toallas de papel limpias para eliminar el exceso de líquido.
3. Añadir 100 l de sustrato de tetrametilbencidina a cada pocillo y se incuba durante 10 min en la oscuridad en un agitador de placas a 400 rpm. Añadir 100 l de solución de parada a cada pocillo. Agitar la placa en un agitador de placas durante 1 min para mezclar. Registrar la densidad óptica (DO) a 450 nm.
   NOTA: La concentración de troponina es proporcional al valor de la DO.

Resultados

10 semanas después de la cirugía constricción de la aorta abdominal, se analizó la patología cardíaca resultante. La histología cardiaca se mide calculando la proporción del peso del corazón con el peso corporal y mediante la detección de la cantidad de colágeno en el corazón. lesión cardíaca se confirmó mediante la medición de la concentración de troponina cardíaca plasma.

Como se muestra en la Figura 1A, el ...

Discusión

La cardiopatía hipertensiva, un problema de salud importante que contribuye en gran medida a la morbilidad y mortalidad, puede conducir a hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca⁵. La patogénesis y progresión de la cardiopatía hipertensiva en humanos es compleja, por lo que un modelo animal apropiado es fundamental para investigar los mecanismos subyacentes y probar nuevas terapias que tengan como objetivo mejorar la estructura y función cardíaca⁵. El modelo de constricción aórtica abdominal, q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja de jeringa de 22 G	BD Biociencias
Tubos de extracción de sangre 309572 EDTA	BD Biociencias
4-0 sutura de seda	Sharpoint&comercio; Productos	DC-2515N
6-0 sutura de seda	Sharpoint&comercio; Productos	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich
Paraformaldehído	Sigma Aldrich
Acetaminofén	Sigma Aldrich	A7085
Solución roja de Picrosirius	Abcam	ab150681
Kit de troponina cardíaca	Abcam	ab200016
Imagequant	Dinámica Molecular Langendorff
	ADInstrumentos