La visualización del Tejido Interrenal androgénica, y su microambiente vascular en el pez cebra

Summary

La glándula interrenal en el pez cebra es la contraparte teleósteos de la glándula adrenal de los mamíferos. Este protocolo presenta cómo realizar la deshidrogenasa 3-β-hidroxiesteroide (Δ ^5-4 isomerasa; 3β-HSD) ensayo de actividad enzimática, que detecta las células esteroidogénicas diferenciadas en el pez cebra en desarrollo.

Abstract

Este protocolo presenta cómo detectar células esteroidogénicas interrenales diferenciadas a través de un ensayo simple de actividad enzimática de montaje completo. La identificación de tejidos esteroidogénicos diferenciados mediante tinción histoquímica cromogénica de células con actividad positiva para la 3-β-hidroxiesteroide deshidrogenasa /Δ^5-4 isomerasa (3β-Hsd) es fundamental para controlar la morfología y la diferenciación de los tejidos adrenocorticales e interrenales en mamíferos y teleósteos, respectivamente. En el modelo de pez cebra, la transparencia óptica y la permeabilidad de los tejidos de los embriones y larvas en desarrollo permiten la tinción de la actividad 3β-Hsd en todo el montaje. Este protocolo de tinción, que se realiza en líneas reporteras fluorescentes transgénicas que marcan las células pronefricas y endoteliales en desarrollo, permite la detección del tejido interrenal esteroidogénico además del riñón y la vasculatura vecina. En combinación con el corte de vibratome, la inmunohistoquímica y la microscopía confocal, podemos visualizar y analizar el microambiente vascular de los tejidos esteroidogénicos interrenales. El ensayo de actividad 3β-Hsd es esencial para estudiar la biología celular de la glándula interrrenal del pez cebra porque, hasta la fecha, no se dispone de un anticuerpo adecuado para marcar las células esteroidogénicas del pez cebra. Además, este ensayo es rápido y sencillo, lo que proporciona una poderosa herramienta para los cribados de mutantes dirigidos a trastornos genéticos suprarrenales (internos), así como para determinar los efectos de alteración de los productos químicos en la esteroidogénesis en estudios farmacéuticos o toxicológicos.

Introduction

La glándula suprarrenal, un componente crucial del eje hipotálamo-pituitario-adrenal, segrega esteroides y coordina la homeostasis de esteroides y la respuesta del cuerpo al estrés. La glándula suprarrenal comprende la corteza exterior, que segrega los esteroides de manera-zona específica, y médula interna, que sintetiza las catecolaminas. La glándula interrenal en teleósteos es la contraparte de la glándula suprarrenal en los mamíferos y se compone de células cromafines interrenal y androgénica, que son equivalentes funcionales de la corteza suprarrenal y la médula, respectivamente ^1-3. Estudios llevados a cabo utilizando el modelo de pez cebra han inform....

Protocol

Ética Declaración: Todos los procedimientos experimentales en el pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tunghai (Aprobación del IRB NO 101-12.) Y llevada a cabo de conformidad con las directrices aprobadas.

1. Soluciones de archivo para 3β-HSD actividad enzimática de tinción

1. Preparar trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (DMSO)].
2. Preparar β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (1,2 mg / ml en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,2).
3. Preparar nicotinamida (vitamina B3, 50 mg / ml en H ₂ O).
4. Preparar azul....

Results

Para determinar cómo las codevelops tejido interrenal androgénica, con el glomérulo renal pronephric y su naciente sistema vascular, el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD se llevó a cabo en el doble transgénico Tg (wt1b: GFP) ^LI1; Tg (kdrl: mCherry) ^CI5 embrión en 34 HPF (Figura 1). En esta etapa, el tejido steroidogenic actividad positiva 3β-HSD está situado justo a la línea media y caudal inmediatamente al glomérulo renal pronephric, m.......

Discussion

La intensidad de la señal de la actividad 3β-HSD aumentó durante el curso de la reacción. se detectaron señales claras de la actividad 3β-HSD después de 4 horas de reacción para las etapas de 28 hpf en adelante. Sin embargo, la duración de la reacción requiere la determinación empírica, dependiendo de la finalidad del ensayo. En los casos en que la tinción requiere procesamiento durante la noche, un fondo ligeramente azulado tiende a desarrollarse en las muestras. Este problema se puede superar mediante el aumento de la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio confocal	Carl Zeiss	LSM510
DMSO	Sigma	D8418
Glicerol	USB	US16374
Hyclone Suero de pantorrilla fetal	GE Healthcare Ciencias de la Vida	SH30073
Nicotinamida	Sigma	N0636
β-Nicotinamida adenina dinucleótido hidrato	Sigma	N1636
4-Nitro azul tetrazolio	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehído	Sigma	P6148
Feniltiourea	Sigma	P7629
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Placa puntual	Corning	7220-85
Sal de arrecife	AZOO	AZ28001
trans-Dehidroandrosterona	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M