Las biopelículas en las superficies se pueden eliminar de manera efectiva y rápida mediante el uso de un chorro periódico de aerosoles de dióxido de carbono sin una purga de nitrógeno.
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Artículo de método
La eliminación del biofilm El uso de aerosoles de dióxido de carbono sin purga de nitrógeno
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Resumen
Resumen
Las biopelículas pueden causar serios problemas en muchas aplicaciones. No solo pueden causar pérdidas económicas, sino que también pueden presentar un peligro para la salud pública. Por lo tanto, es muy deseable eliminar las biopelículas de las superficies. Muchos estudios sobre la limpieza con aerosoles de CO2 han empleado purgas de nitrógeno para aumentar la eficiencia de eliminación de biopelículas al reducir la condensación de humedad generada durante la limpieza. Sin embargo, en este estudio, se utilizaron chorros periódicos de aerosoles de CO2 sin purgas de nitrógeno para eliminar las biopelículas de Pseudomonas putida de las superficies de acero inoxidable pulidas. Los aerosoles de CO2 son mezclas de CO2 sólido y gaseoso y se generan cuando el gas CO2 a alta presión se expande adiabáticamente a través de una boquilla. Estos aerosoles de alta velocidad se aplicaron a una biopelícula que se había cultivado durante 24 horas. La eficiencia de remoción osciló entre 90,36% y 98,29% y se evaluó midiendo la intensidad de fluorescencia del biofilm, ya que el tiempo de tratamiento varió de 16 a 88 seg. También realizamos experimentos para comparar las eficiencias de remoción con y sin purgas de nitrógeno; Las eficiencias de remoción de biofilm medidas no fueron significativamente diferentes entre sí (prueba T, p > 0,55). Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para limpiar varias superficies biocontaminadas en un minuto.
Introducción
Las biopelículas son estructuras complejas de comunidades bacterianas en las que las células bacterianas están incrustadas dentro de matrices autoproducidas de sustancias poliméricas extracelulares, unidas y protegidas del entorno externo. Las biopelículas pueden presentar un riesgo para la salud pública y causar pérdidas económicas porque pueden formarse en diversas superficies, incluidos materiales y dispositivos de implantes médicos, equipos de procesamiento de alimentos e intercambiadores de calor. De hecho, se ha descubierto que las biopelículas están asociadas con el 65% de todas las enfermedades infecciosas bacterianas en humanos, según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.
Los autoclaves y desinfectantes como el cloro se han utilizado generalmente para la inactivación de biopelículas. Sin embargo, el uso de un autoclave está limitado para superficies que no pueden soportar el vapor a alta temperatura ni colocarse en el autoclave. Los desinfectantes no son adecuados para superficies sensibles al tratamiento químico o propensas a acumular productos tóxicos de oxidación2. Además, el biofilm no solo debe inactivarse, sino también eliminarse para evitar la adhesión de nuevas células a la superficie, formando así un nuevo biofilm3. Sin embargo, es difícil eliminar las biopelículas utilizando métodos basados en el cizallamiento de fluidos viscosos porque la velocidad del flujo cerca de la superficie es casi nula y la fuerza de cizallamiento generalmente no puede superar las fuerzas adhesivas de sustancias de tamaño micrométrico y submicrométrico. Además, se sabe que la matriz de la biopelícula actúa como una barrera física y química1.
Se han desarrollado muchas técnicas físicas y mecánicas para eliminar las biopelículas de las superficies, incluida la vibración ultrasónica1, las corrientes eléctricas4, la irradiación láser5 y los rociadores de agua a alta presión6. Cada técnica tiene sus pros y sus contras. La vibración ultrasónica y la corriente eléctrica se pueden utilizar para controlar la formación de biopelículas; sin embargo, requieren una configuración particular y superficies conductoras, respectivamente, que requieren un esfuerzo cortante adicional1, 4. La irradiación láser se puede aplicar a un área limitada y a superficies duras; sin embargo, algunas células vivas y muertas permanecen en la superficie5. Los rociadores de agua a alta presión eliminan eficazmente las biopelículas; Sin embargo, su alto impulso puede causar daños a los sustratos blandos6.
Se ha propuesto previamente la eliminación de biofilm utilizando aerosoles de CO2. Ha mostrado resultados prometedores, con altas eficiencias de remoción en poco tiempo7-11. Los aerosoles de CO2 se generan por la expansión adiabática de un gas CO2 a alta presión a través de una boquilla y se aplican a las superficies contaminadas con una biopelícula. Esta técnica de limpieza utiliza la transferencia de impulso de las partículas sólidas de CO2 y la acción del solvente de los líquidos de CO2 fundidos, seguida de la fuerza de cizallamiento aerodinámica del gas CO2 12. En comparación con los chorros de gas N2 a alta presión, los chorros de aerosol de CO2 a la misma presión de estancamiento son mucho más efectivos para eliminar las biopelículas de E. coli 7. Además, aunque el momento del CO2 sólido que se entrega a las bacterias es considerablemente alto, el momento del chorro total de aerosol aplicado a la superficie sólida es sustancialmente menor que el de los chorros de agua. Por lo tanto, es posible una limpieza sin daños con esta técnica de aerosol deCO2.
En este protocolo, se utilizaron chorros periódicos de aerosoles deCO2 sin purgas de nitrógeno para eliminar las biopelículas de Pseudomonas putida de una superficie de acero inoxidable pulido. De hecho, las purgas de nitrógeno han sido utilizadas en muchos estudios de aerosoles de CO2 para aumentar la eficiencia de remoción al reducir la condensación de humedad generada durante la limpieza, aunque también se ha adoptado el calentamiento con placa calefactora o lámparas infrarrojas y el empleo de cajas secas12. A continuación se describen la formación de biofilm superficial y los procedimientos de limpieza optimizados. La eficiencia de remoción se evaluó midiendo la intensidad de fluorescencia de la biopelícula en la superficie.
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Protocolo
1. Preparación de superficies para la formación de biofilm
- Cortar 1 mm de grosor, 304 placas de acero inoxidable en chips (10 × 10 mm 2) con un cortador mecánico.
- Realizar la limpieza por ultrasonidos de los chips en acetona, metanol, y desionizada (DI) secuencialmente agua durante 10 min cada uno. Use un recipiente resistente a los disolventes, hecho de sustancias tales como vidrio, para eliminar la contaminación orgánica.
- Enjuague los chips con un chorro de agua DI durante 3-5 seg.
- Se secan las fichas utilizando el flujo de gas N2 durante 3-5 seg.
2. Preparación del cultivo bacteriano
- Tome una P. putida KT2440 (proporcionado amablemente por el Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Corea del Sur) stock almacenado en un -80 ° C congelador.
- Descongele a temperatura ambiente después de 1 min, y la capa superior de la solución madre congelada se convierte en aguanieve. Sumergir un bucle en la capa derretida de la solución madre.
- Utilice este bucle a la raya a las bacterias en un medio Luria-Bertani placa (LB) que contiene 1,5% de agar.
- Incubar la placa durante la noche a 30 ° C para crecer las colonias bacterianas.
- Elija una única colonia de la placa usando un bucle fresco.
- Inocular 10 ml de caldo LB en un tubo cónico de 50 ml con el bucle que contiene la colonia bacteriana única.
- Incubar el caldo en una incubadora de agitación durante 16 horas a 30 ° C y 160 rpm.
3. La formación de biopelículas en la Superficie
- Recoger cada una de las fichas preparadas con unas pinzas y sumergirlos en un 70% de etanol 5 veces durante 1-2 segundos cada uno, para esterilizar la superficie de cada chip. Asegúrese de que las virutas se llevan a cabo con pinzas durante la inmersión.
- Sumergir cada chip en agua DI autoclave y en LB caldo de forma secuencial, 5 veces durante 1-2 segundos cada uno, para eliminar el etanol restante.
- Colocar estos chips en placas de cultivo de 6 pocillos con 2 chips y 5 ml de caldo LB por pocillo.
- Diluir el cultivo bacteriano hasta que la concentración en los tramos caldo LB8 × 10 8 células / ml (densidad óptica a la longitud de onda 600 nm: ~ 0,8).
- Inocular cada pocillo con 50 l de cultivo bacteriano diluido.
- Incubar las placas a 30 ° C sin agitación durante 24 horas para la formación de biopelículas.
4. Limpieza de CO 2 en aerosol
- Dip los chips de la biopelícula formada en tampón acetato de amonio 10 mM (volátiles) 5 veces para eliminar débilmente unidos y bacterias planctónicas.
- Seque estos chips en una cabina de seguridad biológica, donde el aire fluye suavemente.
- Inmediatamente después del secado, colocar un chip en el lugar de carga, que es de 20 mm de la boquilla de CO2 a lo largo del eje del chorro. Incline el eje del chorro a un ángulo de 40 °.
- Establecer las presiones de estancamiento de CO2 y N2 gaseoso a 5,3 MPa y 0,7 MPa, respectivamente, utilizando los reguladores de presión de gas.
- Aplicar el chorro de aerosol en la parte central del chip. Aerosoles blancos incluyendo el CO2 sólido debese visible. "Encender" la válvula de solenoide para el CO 2 durante 5 segundos, y luego convertirlo en "off" durante 3 segundos (ciclo: 8 seg) periódicamente con un interruptor controlado manualmente. Si una purga de nitrógeno tiene que ser utilizado, a su vez en la válvula de solenoide para un suministro continuo de N 2.
- Tratar los chips con CO 2 aerosoles para 16, 40, y 88 seg con y sin purgas de nitrógeno. Conservar los chips sin tratamiento como controles negativos.
5. Análisis de eficacia de la eliminación
- Preparar 1 M mancha de ácido nucleico de fluorescencia verde (longitud de onda de excitación / emisión: 480/500 nm) en agua DI para teñir las células bacterianas en el control y patatas fritas tratadas con aerosol.
- Coloque las fichas en la solución de tinción.
- Se incuban las fichas en una incubadora sin luz a 37 ° C durante 30 minutos.
- Después de la incubación, lavar suavemente las virutas con un chorro de agua DI para eliminar el exceso de colorante fluorescente.
- Se seca el wi fichasTH flujo de gas N 2.
- Tome fluorescencia imágenes microscópicas de 5 campos aleatorios de vista (321 × 240 m 2) para cada chip utilizando un microscopio de epifluorescencia, una lente objetivo de 40X, y una cámara CCD.
- Obtener la intensidad de fluorescencia para cada imagen utilizando un software de procesamiento de imágenes tales como ImageJ. En ImageJ, utilizar la función de "Antecedentes Reste" en el menú "Acción", y seleccione "densidad integrado" en la ventana "Establecer medidas" en el menú "Analizar". Hacer el "medición" en el menú "Analizar" para obtener la intensidad de fluorescencia.
- Calcular la eficiencia de eliminación de biofilm de acuerdo con la fórmula siguiente: 100% x (I de chips de control - I de virutas tratadas) / (I de chips de control), donde I es la intensidad de la fluorescencia calculada.
- Obtener el promedio de las eficiencias de eliminación y las desviaciones estándar. Use por lomenos 4 chips para cada caso.
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Resultados
CO 2 aerosoles se utilizan para eliminar el P. putida biofilms de SUS304 superficies (Figura 1). La mayor parte de las superficies estaban cubiertas por el biofilm después de 24 horas de crecimiento. La mayor parte de la biopelícula se retiró usando el CO 2 aerosoles (Figura 2). Como era de esperar, la Figura 3 muestra un aumento de la eficiencia de eliminación de biofilm como el tiempo de tratamiento aerosol CO 2 aumentado. Par...
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Discusión
Anteriormente, realizamos estudios de optimización sobre la presión del gas CO2 , el ángulo del chorro y la distancia a la superficie sólida en la limpieza con aerosoles de CO2 7. A diferencia de nuestros estudios anteriores, en el presente estudio, no se incluyó una purga de nitrógeno en el aerosol (Figura 1). Además, en este protocolo se utilizó acero inoxidable 304, ya que es uno de los aceros inoxidables más comunes y muy utilizado en la industria alimentaria. La supe...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (# 2015R1A2A2A01006446).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Acero inoxidable 304 | Steelni (Corea del Sur) | Pulidos y cortados en cubitos | |
| Limpiador ultrasónico | Branson (USA) | 5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) | 244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) | 214010 | 500 g |
| 6 pocillos placa de cultivo | SPL Life Sciences (Corea del Sur) | 32006 | |
| Tampón de acetato de amonio | Sigma-Aldrich (EE. UU.) | 667404 | 10 mM |
| Unidad de gas dual | Applied Surface Technologies (USA) | K6-10DG | Una boquilla para CO2 gas y 8 boquillas para gas N2 |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (EE. UU.) | Invitrogen | : 480 nm Emisión: 500 nm |
| Microscopio de epifluorescencia | Nikon (Japón) | Lente de objetivo Eclipse 80i | |
| 40X | Nikon (Japón) | Plan Fluor | NA: cámara CCD 0.75 |
| Fotometría (USA) | Cool SNAP HQ2 | Monocromo |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
