Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

Resumen

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

Resumen

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inusual compuesto por proliferación de las células del huso que se inicia por la infección de células endoteliales (CE) con KSHV y se desarrolla más a menudo en el ajuste de la immunosupresión. A pesar de décadas de investigación, un tratamiento óptimo de KS permanece pobremente definido y los resultados clínicos son especialmente desfavorables en contextos con recursos limitados. Las lesiones de KS son conducidas por angiogénesis patológica, inflamación crónica y oncogénesis, y varios en vitro modelos celulares de cultura se han desarrollado para estudiar estos procesos. KS surge de las células infectadas de KSHV de origen endotelial, por lo que las células de linaje CE proporcionan el más apropiado en vitro sustitutos del precursor de la célula del huso. Sin embargo, porque CE tienen una vida útil limitada en vitro , y los mecanismos oncogénicos de KSHV son menos eficientes que los de otros virus tumorigenic, ha sido difícil de evaluar los procesos de transformación primaria o telomerasa inmortalizó EC Por lo tanto, se desarrolló un modelo de la nueva cultura basada en la EC que soporta fácilmente la transformación después de la infección con KSHV. Expresión ectópica de los genes E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16 permite la extendida cultura de pareados por edad y paso mock y KSHV infectadas - CE y apoya el desarrollo de una verdadera transformación (es decir, tumorígeno) fenotipo en cultivos de células infectadas . Este modelo manejable y altamente reproducible de KS ha facilitado el descubrimiento de varias vías de señalización esenciales con alto potencial para la traducción en ajustes clínicos.

Introducción

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor angioproliferative multi-focales que afectan sitios cutáneos, mucosos y viscerales que se desarrolla más comúnmente en el ajuste de inmunosupresión avanzado¹. Se han descrito cuatro formas epidemiológicas: clásico, una forma indolente que típicamente afecta a las personas mayores del patrimonio mediterráneo y de Oriente; yatrogénica, resultantes del tratamiento con fármacos inmunosupresores después del trasplante de órganos; epidemia, un definición de SIDA cáncer; y, una forma independiente de VIH común en los niños en las regiones endémicas en África. Con el advenimiento de los regímenes de medicamentos anti-....

Protocolo

Nota: todos los procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse bajo condiciones BSL-2.

1. preparación de Stock de KSHV

1. buffer de TNE de preparar: disolver 292,24 mg EDTA en ddH ₂ O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Disolver mg 605,7 Tris en ddH ₂ O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Combinar soluciones de EDTA, Tris, añadir 4,38 g de NaCl, ajustar el volumen final a 500 mL, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C ^.
2. De la cultura el KSHV-positivo, EBV-negativo primario de la efusión linfoma de la célula línea BCBL-1 en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO ₂ en ....

Resultados

La morfología de la primaria CE se describe clásicamente como "piedra del adoquín", y esta morfología no se altera con expresión de los papillomavirus E6 y E7 genes (figura 1A). Expresión de los genes E6 y E7 solo no induce un fenotipo transformado; así, las células son susceptibles a la inhibición de contacto y dejan de dividir al llegar a la confluencia en la cultura. Las células sin embargo proliferar y crecer hasta confluencia tripsinización y replating en una densida.......

Discusión

Oncogénesis es un proceso multietapa que eluda la seguridad dentro de un organismo³⁶. Como lesiones KS existen a lo largo de un espectro de inflamación crónica a los verdaderos sarcomas, la aclaración de ciertos procesos fisiopatológicos mediados por KSHV requiere algunos estudios en modelos de cultivo celular que apoyan transformación⁹. Cabe señalar que no fácilmente se desarrollan pérdida de la inhibición de contacto y crecimiento dependiente de anclaje, fenotipos indicat.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células BCBL-1	Programa de reactivos para el SIDA de los NIH	3233
Células PA317	ATCC	CRL-2203
Células endoteliales microvasculares dérmicas neonatales	Lonza	CC-2505
EBM-2 Medio basal	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73	Avanzado Biotechnologies	13-210-100
TrypLETMExpress, rojo sin fenol	ThermoFisher	12604013
RPMI
DMEM
PBS con calcio y magnesio