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Artículo de método

Un modelo In Vitro para el estudio de transformación celular por Herpesvirus del Sarcoma de Kaposi

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DOI:

10.3791/54828

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25 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

En este artículo

Resumen

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inducido por infección con el virus oncogénico herpesvirus-8/KS el herpesvirus humano (HHV-8/KSHV). El modelo de cultura de célula endotelial descrito aquí está especialmente preparado para el estudio de los mecanismos por los cuales KSHV transforma las células del huésped.

Resumen

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor inusual compuesto por proliferación de las células del huso que se inicia por la infección de células endoteliales (CE) con KSHV y se desarrolla más a menudo en el ajuste de la immunosupresión. A pesar de décadas de investigación, un tratamiento óptimo de KS permanece pobremente definido y los resultados clínicos son especialmente desfavorables en contextos con recursos limitados. Las lesiones de KS son conducidas por angiogénesis patológica, inflamación crónica y oncogénesis, y varios en vitro modelos celulares de cultura se han desarrollado para estudiar estos procesos. KS surge de las células infectadas de KSHV de origen endotelial, por lo que las células de linaje CE proporcionan el más apropiado en vitro sustitutos del precursor de la célula del huso. Sin embargo, porque CE tienen una vida útil limitada en vitro , y los mecanismos oncogénicos de KSHV son menos eficientes que los de otros virus tumorigenic, ha sido difícil de evaluar los procesos de transformación primaria o telomerasa inmortalizó EC Por lo tanto, se desarrolló un modelo de la nueva cultura basada en la EC que soporta fácilmente la transformación después de la infección con KSHV. Expresión ectópica de los genes E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16 permite la extendida cultura de pareados por edad y paso mock y KSHV infectadas - CE y apoya el desarrollo de una verdadera transformación (es decir, tumorígeno) fenotipo en cultivos de células infectadas . Este modelo manejable y altamente reproducible de KS ha facilitado el descubrimiento de varias vías de señalización esenciales con alto potencial para la traducción en ajustes clínicos.

Introducción

Sarcoma de Kaposi (KS) es un tumor angioproliferative multi-focales que afectan sitios cutáneos, mucosos y viscerales que se desarrolla más comúnmente en el ajuste de inmunosupresión avanzado1. Se han descrito cuatro formas epidemiológicas: clásico, una forma indolente que típicamente afecta a las personas mayores del patrimonio mediterráneo y de Oriente; yatrogénica, resultantes del tratamiento con fármacos inmunosupresores después del trasplante de órganos; epidemia, un definición de SIDA cáncer; y, una forma independiente de VIH común en los niños en las regiones endémicas en África. Con el advenimiento de los regímenes de medicamentos anti-retrovirales eficaz combinación para el tratamiento del VIH, mucho menos comúnmente se diagnostica la KS epidémicas en los países en desarrollo. Sin embargo, las formas endémicas y epidémicas clínicamente agresivas permanecen entre los más comúnmente diagnosticado cáncer en muchos países africanos2,3,4. Por lo tanto, la identificación de drogas orientada a patogenesia eficaces para el tratamiento del KS es una prioridad de investigación.

Histológico, las lesiones de KS son caracterizadas por neovascularización extensa pero anormal, por el que las células del huso de origen CE forma discontinua redes vasculares5. Estos vasos anormales ("hendiduras vasculares") permiten la extravasación de los eritrocitos, que lesiones su color característico. Además, las lesiones contienen numerosos leucocitos que caracterizan a la inflamación crónica (es decir, linfocitos, macrófagos y células plasmáticas). Se ha descrito regresión de las lesiones de KS después de reconstitución inmune, sugiriendo que el KS tiene características de una lesión hiper-proliferativa y un verdadero tumor6,7,8,9.

Herpesvirus de KS (KSHV), el agente causativo de KS, fue identificado en 199410. Desde entonces muchos en vitro cultura de célula han desarrollado modelos para permitir estudios de patogénesis, incluyendo las células explantados de material de biopsia de tumor y primario o CE expresan telomerasa infectados con KSHV en vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ninguno de los modelos disponibles en la actualidad totalmente recapitula el microambiente tumoral de KS, pero todos han aportado conocimientos valiosos al conocimiento de la Patobiología de la infección de KSHV. A diferencia de lo otros conocido tumorigenic herpesvirus humano virus de Epstein - Barr (EBV), KSHV no fácilmente transformar células en cultivo después de novo infección19,20,21, 22. sin embargo, esta limitación ha sido superada por transducción primaria CE humano de cualquier origen microvascular o linfática de mezclado con la E6 y E7 genes de virus del papiloma humano tipo 16 antes de la infección con KSHV23,24 . Expresión de los oncogenes exógenos aumenta dramáticamente el potencial transformador de KSHV en vitro en parte facilitando aún más la inhibición de la retinoblastoma proteína y p5323,24. Este método de transducción de la CE ha permitido múltiples laboratorios para identificar alteraciones claves en host de expresión génica de la célula que son inducidos por infección de KSHV y que parecen facilitar el KS de la célula proliferación y supervivencia25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. los protocolos descritos son simple y altamente reproducible y resultará en la generación de pareados por edad y paso CE KSHV-infectados y controles mock-infectados que pueden cultivarse para mucho más que las pilas primarias y permiten la investigación de mecanismos oncogénicos de KSHV. Aunque el protocolo incluye un método para la producción de tipo salvaje KSHV desde la línea de célula de efusión primaria en linfoma BCBL-1, CE E6/E7-inmortalizado también son altamente susceptibles a la infección con BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para preparación de BAC16 se describen en otra parte33,34.

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Protocolo

Nota: todos los procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse bajo condiciones BSL-2.

1. preparación de Stock de KSHV

  1. buffer de TNE de preparar: disolver 292,24 mg EDTA en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Disolver mg 605,7 Tris en ddH 2 O traer a 225 mL y ajustar a pH 8. Combinar soluciones de EDTA, Tris, añadir 4,38 g de NaCl, ajustar el volumen final a 500 mL, filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C .
  2. De la cultura el KSHV-positivo, EBV-negativo primario de la efusión linfoma de la célula línea BCBL-1 en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en RPMI suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y antimicrobianos para aproximadamente 1 a 1.2 x 10 6 células / mL.
  3. Para inducir la producción de KSHV, dividir culturas 1:2 con medio fresco y añadir forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a una concentración final de 20 ng/mL e incubar culturas durante 5 días. Como alternativa, tratar las células con butirato de sodio (NaB; 0,1 mM) durante 3 días inducir replicación viral lítica.
  4. Para recolectar partículas virales, primero centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para que sedimenten las células y transferir sobrenadante a tubos de nuevos cultura.
  5. Para aclarar aún más el sobrenadante con el fin de evitar la transferencia de los desechos celulares, centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: como alternativa a la centrifugación de alta velocidad para la clarificación de sobrenadantes de cultivo, filtración a través de una estéril 0.45 μm filtro puede realizarse. Hemos observado un descenso en el título mediante filtración; por lo tanto, periódicamente realizamos el segundo paso de centrifugación en su lugar.
  6. Recubierto a continuación 5 mL de solución de sacarosa de 25% en buffer TNE con aproximadamente 30 mL de la cultura clarificado sobrenadante en 6 tubos de ultracentrífuga.
  7. Centrífuga balanceado tubos a 75.000 x g durante 2 h a 4 ° C en vacío.
  8. Decantar sobrenadante de cultivo seque el borde de cada tubo para quitar tanta solución sobrenadante y sacarosa como sea posible, y resuspender el precipitado de virus, que puede no ser visible, en 150 μL de tampón TNE de.
  9. Virus de la piscina todas suspendida, mezcle bien y congelar alícuotas de μl 25 a -80 ° C .

2. Transducción de la CE con Papillomavirus Genes E7 y E6

Nota: Habitualmente utilizamos frascos de cultivo de tejido estándar para el cultivo de EC primaria Sin embargo, si el insuficiente crecimiento de la CE se obtiene entonces el uso de frascos de cultivo comercial debe considerarse.

  1. Cultura primaria humana dérmica microvascular o linfático CE en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en un medio de EC (EGM; contiene medio basal de CE [EBM] complementado con EGM-2 BulletKit [que contiene FBS, hidrocortisona, factor de crecimiento de fibroblasto humano-B, factor de crecimiento vascular CE, factor de crecimiento insulínico-1, ácido ascórbico, factor de crecimiento epitelial humano, antibióticos y heparina]) en un matraz de cultivo celular T75 a aproximadamente 50% de confluencia.
  2. Para la transducción, cultura PA317 LXSN 16E6E7 células 24 , 35 en un incubador humedecido a 37 ° C y 5% CO 2 en DMEM suplementado con 10% FBS y antimicrobianos en un Frasco de cultura de T150 celular hasta aproximadamente 90% confluente. Luego incubar durante una noche en 16 mL de medio.
  3. Aclarar el medio PA317 por centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Retire el EGM las células CE cultura y sobreimpresión con 12 mL de medio PA317 clarificado e incubar durante 4 h.
    Nota: Centrifugación 16 mL de medio condicionado a 300 x g para obtener resultados de 5 min en un pellet compacto que no es perturbada por el retiro subsecuente cuidado de 12 mL de sobrenadante clarificado. Sin embargo, si la transferencia de PA317 LXSN 16E6E7 células en cultivos primarios de CE es una preocupación (la línea de envasado de la célula rápidamente superan CE), entonces filtración del sobrenadante condicionada a través de un filtro de 0.45 μm antes de la transferencia puede realizarse.
  5. 6 mL del medio PA317 EGM fresco e incubar durante una noche.
  6. CE de realimentación con 12 mL EGM fresco e incubar una mayor 48 h.
  7. Para la CE, el de la cultura quiten medio y con 12 mL de PBS sin cationes y añadir 3 mL de solución comercial de disociación enzimática (p. ej., TrypLE) por e incubar a 37 ° C durante 3 min.
  8. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado de células resultante en EGM fresco y dividir en 3 frascos de x T75 con un volumen final de EGM de 12 mL por frasco.
  9. Para seleccionar para CE transduced con E6 y E7, añadir G418 a una concentración final de 200 μg/mL para los dos pasos, después de que la CE transduced puede ser plateada para infección o congelada en nitrógeno líquido.

3. Infección de CE-Transduced KSHV

  1. en el día antes de la infección cosecha CE por digestión enzimática, mediante la solución comercial disociación enzimática como se describió anteriormente. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de EGM. Utilice 5 μl de las células para preparar una dilución 1/10 en tripán azul. Contar células vivas usando un hemocitómetro y semilla de 2.5 x 10 5 células vivas en 2 mL de EGM por pozo en 6 placas bien.
  2. En el día de la infección, quiten EGM y células con 3 mL de PBS con calcio y magnesio por pozo, y luego agregar 2 mL EBM.
    Nota: Es esencial utilizar la EBM en lugar de EGM durante la infección, como la heparina en EGM inhibirá de partículas virales a y posterior infección de blanco EC
  3. Para infectar las células con KSHV, añadir caldo de virus de 5 a 20 μl en cada pocillo y agitar la placa para mezclar. Para las células infectadas de mock agregue un volumen igual de buffer TNE a cada pocillo.
  4. Centrifugue las placas a 400 x g durante 30 min a temperatura ambiente y luego incubar las placas a 37 ° C durante 90 min.
  5. Si el objetivo del estudio es investigar los acontecimientos tempranos que requieren una sincrónica infección viral, por ejemplo, los acontecimientos tempranos de la infección de novo, eliminar el inóculo viral en este punto. Enjuague y realimentación de las células con 2 mL fresco EGM. De lo contrario, añadir 2 mL EGM e incubar los cultivos durante la noche.
  6. Realimentación a las células con 2 mL EGM el día después de la infección y luego cada dos días.
  7. Cuando las células son aproximadamente 90% confluente, cosecha por digestión enzimática con solución comercial disociación enzimática como se describe anteriormente, a continuación, las células de los tres pozos en un T75, señalando el número de paso total y paso de la piscina infección post.
  8. Ampliar mock y KSHV infectadas - CE con divisiones de 1:3 para por lo menos dos pasajes más, momento en el que las células pueden utilizarse en experimentos o congeladas en nitrógeno líquido.
    Nota: Como con la división de la CE transduced con E6 y E7, culturas de mantenimiento de las células infectadas de mock y KSHV deben dividirse antes de llegar a confluencia (~ 85 a 90%).

4. confirmación de la infección con KSHV por inmunofluorescencia

Nota: detección de KSHV asociado a latencia nuclear antígeno (LANA-1/ORF73) proporciona una medida cuantitativa fiable de infección. Anticuerpos anti-LANA están disponibles en el mercado.

  1. El día antes de la tinción, placa dos pozos cada uno con mofa o KSHV infectadas - CE en una placa de 24 pocillos a 1 x 10 5 células por bien en 1 mL EGM e incubar durante una noche.
  2. Células de lavado dos veces con 500 μl de PBS plus calcio y magniseum. Lavar durante 30 s en una plataforma oscilante.
  3. En una capilla del humo ventillated externamente, fijar las células con 500 μl de paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
  4. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado (0,1% Tritón X-100 y 0,02% de suero de cabra en PBS más cationes).
  5. Bloque de células con 500 μl de suero de cabra 2% en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente.
  6. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  7. Etiqueta bien de mofa o KSHV infectadas - CE con 200 μL de anticuerpo primario diluido 1:100 en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente en un eje de balancín. Incubar los dos pozos restantes en 200 μL de tampón de lavado solo.
  8. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  9. Etiqueta todos los cuatro pozos con 200 μL del anticuerpo secundario diluido 1: 100 en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente en un eje de balancín de.
  10. Lavar las células 3 veces con 500 μl de tampón de lavado.
  11. a cada pocillo aplicar 20 μl de DAPI que contiene medio y un cubreobjetos de montaje y evaluar coloración usando un microscopio fluorescente invertido.
  12. Determinar la infección por ciento de las células infectadas de KSHV contando el número de núcleos de LANA-positivo en por lo menos 200 células. Infección con recombinante KSHV-Bac16 también puede ser monitoreados a través de la observación de las culturas de expresión de GFP.

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Resultados

La morfología de la primaria CE se describe clásicamente como "piedra del adoquín", y esta morfología no se altera con expresión de los papillomavirus E6 y E7 genes (figura 1A). Expresión de los genes E6 y E7 solo no induce un fenotipo transformado; así, las células son susceptibles a la inhibición de contacto y dejan de dividir al llegar a la confluencia en la cultura. Las células sin embargo proliferar y crecer hasta confluencia tripsinización y replating en una densida...

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Discusión

Oncogénesis es un proceso multietapa que eluda la seguridad dentro de un organismo36. Como lesiones KS existen a lo largo de un espectro de inflamación crónica a los verdaderos sarcomas, la aclaración de ciertos procesos fisiopatológicos mediados por KSHV requiere algunos estudios en modelos de cultivo celular que apoyan transformación9. Cabe señalar que no fácilmente se desarrollan pérdida de la inhibición de contacto y crecimiento dependiente de anclaje, fenotipos indicat...

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Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el HD068322 K12 (SCM); CA179921 r01 y P51 OD011092 (AVM); y 14PRE20320014 de la Asociación America del corazón (SB).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Células BCBL-1Programa de reactivos para el SIDA de los NIH3233
Células PA317ATCCCRL-2203
Células endoteliales microvasculares dérmicas neonatalesLonzaCC-2505
EBM-2 Medio basalLonzaCC-3156
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73Avanzado Biotechnologies13-210-100
TrypLETMExpress, rojo sin fenolThermoFisher12604013
RPMI
DMEM
PBS con calcio y magnesio

Referencias

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