Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

Resumen

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Resumen

Actualmente, es posible construir formas recombinantes de varios virus, como el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) y el virus de la hepatitis C (VHC), que llevan genes extraños como una proteína reportera o marcador en sus genomas. Estos virus recombinantes suelen imitar fielmente el ciclo de vida del virus original en las células infectadas y muestran la misma dependencia del rango de huéspedes. El desarrollo de un virus recombinante permite el cribado eficaz de inhibidores y la identificación de factores específicos del huésped. Sin embargo, hasta la fecha la construcción del virus recombinante de la hepatitis B (VHB) ha sido difícil debido a varias limitaciones experimentales. La principal limitación es el tamaño compacto del genoma del VHB, y un tamaño de genoma bastante estricto que no supera los 1,3 tamaños de genoma, que deben empaquetarse en viriones. Por lo tanto, el tamaño de un gen extraño que se va a insertar debe ser inferior a 0,4 kb si no se va a realizar una deleción del ADN del genoma. Por lo tanto, para superar esta limitación de tamaño, se requiere la deleción de parte del ADN del VHB. Aquí, reportamos la construcción de un gen reportero recombinante del VHB que codifica para monitorear la etapa temprana del ciclo de replicación del VHB mediante la sustitución de parte de la región codificante del núcleo del VHB con el gen reportero mediante la eliminación de parte de la región codificante pol del VHB. La detección de la infección recombinante por el VHB, monitorizada por la actividad del reportero, fue muy sensible y menos costosa que la detección mediante los métodos convencionales actualmente disponibles para evaluar la infección por el VHB. Este sistema será útil para una serie de aplicaciones, incluido el cribado de alto rendimiento para la identificación de inhibidores del anti-VHB, factores del huésped y células susceptibles al virus.

Introducción

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para las enfermedades hepáticas crónicas ^1. Aunque las estrategias terapéuticas actuales se basan en análogos de nucleótidos que inhiben la función HBV pol y / o la administración de interferón de tipo I que activa la respuesta inmune en individuos infectados, así como indirectamente la supresión de la proliferación de HBV a través de funciones de genes de interferón-estimulado ^2, estos tratamientos no pueden eliminar HBV ADN completo ^3. Por otra parte, la aparición de HBVs que son resistentes a los agente....

Protocolo

1. La producción de recombinante de HBV que codifica la proteína Reportero

1. Preparación de células HepG2
   1. Preparar medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 aminoácidos no esenciales U / ml).
   2. La placa 4 x 10 ⁶ células HepG2 en una placa de 10 cm revestido con colágeno en 10 ml de medio de cultivo el día antes de la transfección. Se incuban las células HepG2 a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO _2.
      NOTA: Al de aproximadamente 4 x 10 ⁶ ....

Resultados

La Figura 1 muestra un esquema del genoma HBV, los ARN transcritos, proteínas del virus y su región codificante en el genoma. El gen informador y su ubicación en el genoma también se indican. Figura 2 muestra el plásmido reportero y ayudante plásmido HBV que contiene el gen reportero. El reportero pUC1.2HBV / NL se construyó mediante la supresión de las posiciones de nucleótidos 223 a 811 desde el sitio de iniciación de la transcripción del ARNm de preCo.......

Discusión

El genoma HBV tiene cuatro marcos principales de lectura abiertos (ORFs), incluyendo el núcleo, la polimerasa, de superficie y X ORFs (Figura 1). La transcripción de estos cuatro VHB ORFs está estrechamente regulada por cuatro promotores: el promotor precore / núcleo que contiene potenciador II, promotor S1, S2 promotor y X promotor que contiene promotor de I ^18. Los ARNm de 3,5 kb y 3,4 kb se traducen en proteínas pre-core y Core, respectivamente. La proteína de la envoltura gra.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ensayo de luciferasa nano-glo Regent	Promega	N1110
Solución mixta de penicilina-estreptomicina	Nacalai tesque	09367-34
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Medio de suero reducido	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/plato recubierto de colágeno	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección	Thermo Fisher Scientific L3000001
Polietilenglicol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polietilenglicol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0,5 mol/L EDTA Solución	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, de polietétersulfona, de filtro	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Placa de 96 pocillos recubierta de colágeno	Corning	NO3585
Lisis pasiva 5x Tampón	Promega	E1941
GloMax 96 Microplaca Luminómetro	Promega	E6501
Sacarosa	Nacalai tesque	30403-55
Placa luminométrica	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Referencia 15
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-	Referencia 15
pUC1.2HBV/NL-		-	Referencia 15
tubo de 50 ml	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc anticuerpo	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japonesa de Productos	Sanguíneos-IFN
-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparina	Sigma-Aldrich	H3393

Organización