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Artículo de método

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

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DOI:

10.3791/54849

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1 de febrero de 2017

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1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Resumen

Actualmente, es posible construir formas recombinantes de varios virus, como el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) y el virus de la hepatitis C (VHC), que llevan genes extraños como una proteína reportera o marcador en sus genomas. Estos virus recombinantes suelen imitar fielmente el ciclo de vida del virus original en las células infectadas y muestran la misma dependencia del rango de huéspedes. El desarrollo de un virus recombinante permite el cribado eficaz de inhibidores y la identificación de factores específicos del huésped. Sin embargo, hasta la fecha la construcción del virus recombinante de la hepatitis B (VHB) ha sido difícil debido a varias limitaciones experimentales. La principal limitación es el tamaño compacto del genoma del VHB, y un tamaño de genoma bastante estricto que no supera los 1,3 tamaños de genoma, que deben empaquetarse en viriones. Por lo tanto, el tamaño de un gen extraño que se va a insertar debe ser inferior a 0,4 kb si no se va a realizar una deleción del ADN del genoma. Por lo tanto, para superar esta limitación de tamaño, se requiere la deleción de parte del ADN del VHB. Aquí, reportamos la construcción de un gen reportero recombinante del VHB que codifica para monitorear la etapa temprana del ciclo de replicación del VHB mediante la sustitución de parte de la región codificante del núcleo del VHB con el gen reportero mediante la eliminación de parte de la región codificante pol del VHB. La detección de la infección recombinante por el VHB, monitorizada por la actividad del reportero, fue muy sensible y menos costosa que la detección mediante los métodos convencionales actualmente disponibles para evaluar la infección por el VHB. Este sistema será útil para una serie de aplicaciones, incluido el cribado de alto rendimiento para la identificación de inhibidores del anti-VHB, factores del huésped y células susceptibles al virus.

Introducción

La infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB) es un factor de riesgo importante para las enfermedades hepáticas crónicas 1. Aunque las estrategias terapéuticas actuales se basan en análogos de nucleótidos que inhiben la función HBV pol y / o la administración de interferón de tipo I que activa la respuesta inmune en individuos infectados, así como indirectamente la supresión de la proliferación de HBV a través de funciones de genes de interferón-estimulado 2, estos tratamientos no pueden eliminar HBV ADN completo 3. Por otra parte, la aparición de HBVs que son resistentes a los agentes anti-pol es motivo de preocupación 4. La administración de agentes anti-virales combinados dirigidos directamente los diferentes pasos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el ciclo de vida del virus de la hepatitis C (HCV) se demostró con éxito para suprimir o erradicar el virus (es). Similar a esta idea, el desarrollo de anti-HBV agente (s) que actúan directamente sobre las diferentes etapas de la HBV ciclo de vida es importante para el establecimiento de futuras terapias VHB.

En general, el establecimiento de una sencilla en el sistema de cultivo in vitro del virus objetivo facilita el desarrollo de agentes anti-virus. Sin embargo, hay al menos dos barreras para el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro para detectar agentes anti-HBV. El primero es la falta de un sistema conveniente in vitro de células de cultivo para el VHB infección / proliferación. A diferencia de otros virus, como el VIH y el VHC, que se propagan en líneas celulares establecidas, es difícil de cultivar HBV in vitro debido a las limitaciones experimentales incluyendo un estrecho rango de huéspedes. El uso de sistemas de cultivo de células específicas, tales como la línea celular de hepatoma humano HepaRG, que es susceptible a la infección por HBV, 5, 6, 7 se han desarrollado para superar estos problemas. Por otra parte, las células PXB, aisladas de uroquinasa-type activador del plasminógeno transgénico / ratones SCID inoculados con hepatocitos humanos primarios (PHH), se demuestra que es susceptible a la infección por HBV y la replicación 8. Sin embargo, los niveles de replicación del VHB en HepaRG dependen del estado de diferenciación celular después del cultivo, lo que puede causar que los resultados inconsistentes e irreproducibles de los niveles de infección / replicación del VHB. PXB se utiliza comúnmente para experimentos de infección de HBV, pero está limitada por su disponibilidad. Una línea celular de expresión VHB inducible de tetraciclina, HepAD38, también ha sido ampliamente utilizado para estudiar la replicación del VHB, pero este sistema sólo permite la evaluación después de la transcripción y no en la etapa de entrada de la infección por HBV 9. Recientemente, la identificación de polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio (PNCT) como un receptor funcional para HBV ha permitido el desarrollo de un sistema de cultivo de HBV variable de 10. De hecho, la expresión en células de hepatocarcinoma PNCT no susceptibles tales como Huh7 yHepG2 permite la infección por VHB 10 y por lo tanto, la elección de líneas de células susceptibles de HBV se ha ampliado, la resolución de muchas de las limitaciones experimentales. El segundo problema es la falta de un sistema de ensayo sencillo para evaluar la infección por VHB y la replicación. Evaluación de la infección por VHB se realiza normalmente mediante el análisis VHB ADN, ARN y proteínas. Sin embargo, la cuantificación de estos marcadores de virus es mucho tiempo, a menudo costoso y no siempre es sencillo. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de ensayo simple, como el uso de un gen indicador, podría superar los problemas asociados con sistemas de ensayo de HBV.

Sin embargo, debido a que el tamaño del genoma que puede ser empaquetado en una cápside de HBV se limita - menos de 3,7 kb 11 - el tamaño de un gen indicador debe ser tan corto como sea posible. Por otra parte, la presencia de múltiples elementos cis dispersos por todo el genoma, que son esenciales para la replicación viral, limita las posiciones disponibles en el la inserción del gen informador en el genoma. Varios informes han tratado de insertar genes extraños, incluyendo el VIH-1 Tat, proteína fluorescente verde, y DsRed, en el genoma de HBV 11, 12, 13. Sin embargo, estos HBVs recombinantes no son útiles para la detección de HBV infección / replicación, o para el cribado de alto rendimiento de los factores que afectan a la infección por VHB / replicación. Esto es principalmente debido a la baja productividad de virus recombinantes y la reducción de la intensidad de expresión del gen indicador causada por la producción de virus ineficiente.

Para superar estos problemas, se construyó un reportero de VHB con un alto rendimiento de la producción de virus. Este virus es altamente sensible para el seguimiento de las primeras etapas del ciclo de replicación de HBV, desde la entrada a la transcripción. Para lograr esto, NanoLuc (NL) fue elegido como un gen marcador, ya que es un pequeño (171 aminoácidos) diseñados reportero luminiscenteclass = "xref"> 14. Además, NL es aproximadamente 150 veces más brillante que la luciérnaga o luciferasa de Renilla, y la reacción luminiscente es independiente de ATP, lo que sugiere que la tasa de éxito falsa será baja para cribado de alto rendimiento. La eficiencia de la producción de la HBV recombinante es de aproximadamente 1/5 de los padres HBV, y similar a los niveles reportados para los virus recombinantes de HBV anteriores; sin embargo, el brillo de NL supera problemas de productividad virus para que pueda ser utilizado para el cribado en masa de agentes anti-HBV.

Cribado de agentes anti-HBV utilizando hepatocitos primarios, HepaRG, HepAD38 y hepatocitos PNCT-transducidas podría ser útil para el cribado de agentes anti-VHB por método (s) convencional. Sin embargo, el sistema descrito aquí tiene varias ventajas, tales como el manejo sencillo, alta sensibilidad y bajo costo para el cribado. Estas ventajas son adecuados para ensayos de alto rendimiento para desarrollar e identificar nuevos agentes de HBV con fines terapéuticos.

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Protocolo

1. La producción de recombinante de HBV que codifica la proteína Reportero

  1. Preparación de células HepG2
    1. Preparar medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 100 aminoácidos no esenciales U / ml).
    2. La placa 4 x 10 6 células HepG2 en una placa de 10 cm revestido con colágeno en 10 ml de medio de cultivo el día antes de la transfección. Se incuban las células HepG2 a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2.
      NOTA: Al de aproximadamente 4 x 10 6 células HepG2 se sembraron en una placa de colágeno recubiertas de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo, que será 70 a 90% de confluencia el día siguiente.
  2. La transfección
    1. Células HepG2 transfectar con 5 g de epsilon pUC1.2HBV delta 15 y 5 g de pUC1.2HBV / NL 15 utilizando una transfecciónreactivo según las instrucciones del fabricante.
    2. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y añadir 10 ml de medio de cultivo fresco.
    3. Una semana después de la transfección, transferir el medio de cultivo que contiene el VHB recombinante a un tubo de 50 ml, y continúe con el paso 1.3.1. Añadir 10 ml de medio de cultivo fresco a la placa que contiene las células transfectadas.
      NOTA: La producción del VHB recombinante se mantuvo durante 4 semanas. El medio de cultivo que contiene HBV recombinante se puede almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
  3. Purificación de VHB recombinante
    1. Eliminar los restos celulares del medio de cultivo que contiene HBV recombinante por centrifugación (2.300 xg durante 5 min).
    2. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 micras membrana.
    3. Añadir un volumen igual de 26% de PEG / 1,5 M NaCl (polietilenglicol 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0 y 5 ml de 1 M HEPES pH 7,6 en 500 ml) al medio de cultivo que contiene recombinanteVHB y mezclar suavemente. Incubar toda la noche a 4 ° C.
    4. Centrifugar a 2300 xg durante 20 min a 4 ° C.
    5. Descartar el sobrenadante y disolver el precipitado en 0,5 ml de TNE (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM).
    6. Eliminar los restos por centrifugación a 2.300 xg durante 5 min.
    7. Cargar 0,5 ml de TNE que contiene HBV recombinante en 0,8 ml de 20% de sacarosa en TNE.
    8. Se centrifuga a 100.000 xg durante 3 horas a 15 ° C.
    9. Descartar tanto del sobrenadante como sea posible, y guardar el precipitado. Volver a suspender en 1 ml de DMEM libre de suero por 40 ml de medio de cultivo de partida.
    10. Incubar toda la noche a 4 ° C.
    11. Filtrar a través de un filtro de 0,45 micras. Preparar alícuotas de 0,5 ml y se almacena a -80 ° C.
      NOTA: Si se observa contaminación proteína indicadora de la muestra del virus original, purificar el virus mediante gradiente de densidad ultra centrifugación de 5-30% de sacarosa en TNE a 100.000 xg durante 2 horas, o CsCl de densidad equilibrada centrifugación lado a otrom 1,1-1,6 g / ml a 150.000 xg durante 50 h.

2. La infección del VHB recombinante

  1. Células HepG2 Cultura de forma estable que expresan PNCT (HepG2 / PNCT) 15 que son susceptibles a la infección por VHB en DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 250 g / ml de G-418 y 100 U / ml aminoácidos no esenciales a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2.
  2. Un día antes de la infección, la placa aproximadamente 5 x 10 4 HepG2 / células Ntcp 14 en una placa recubierta de colágeno de 96 pocillos en 0,1 ml de medio de cultivo.
  3. VHB recombinante deshielo en un baño de agua a 37 ° hasta que haya un poco de hielo que queda en el vial.
  4. Preparar el medio para la infección mediante la combinación de los siguientes: 10 l de 40% PEG8000 en fosfato 1x solución salina tamponada (PBS), 2 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO), 10 l de VHB recombinante y 78 l de medio de cultivo frescopor pocillo de una placa de 96 pocillos.
  5. Añadir 100 l de solución de VHB recombinante a un pocillo de la placa de 96 pocillos.
  6. Un día después de la infección, se lavan las células infectadas 3 veces con 300 l de PBS por pocillo para retirar la proteína indicadora contaminante de la fracción de virus.
  7. Se incuban las células infectadas en 200 l de medio de cultivo que contiene 2% de DMSO durante una semana o menos.

3. Análisis

  1. Una semana después de la infección, se lavan las células infectadas 3 veces con PBS.
  2. Añadir 50 l de tampón de lisis a las células infectadas.
  3. Roca la placa de cultivo durante 5 minutos, y luego centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
  4. Añadir 50 l de sustrato reportero en la placa de luminómetro.
  5. Añadir 20 l de lisado celular a una placa de luminómetro que contiene el sustrato indicador. Mezclar mediante agitación brevemente.
  6. Colocar la placa en el luminómetro e iniciar la lectura de 15.

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Resultados

La Figura 1 muestra un esquema del genoma HBV, los ARN transcritos, proteínas del virus y su región codificante en el genoma. El gen informador y su ubicación en el genoma también se indican. Figura 2 muestra el plásmido reportero y ayudante plásmido HBV que contiene el gen reportero. El reportero pUC1.2HBV / NL se construyó mediante la supresión de las posiciones de nucleótidos 223 a 811 desde el sitio de iniciación de la transcripción del ARNm de preCo...

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Discusión

El genoma HBV tiene cuatro marcos principales de lectura abiertos (ORFs), incluyendo el núcleo, la polimerasa, de superficie y X ORFs (Figura 1). La transcripción de estos cuatro VHB ORFs está estrechamente regulada por cuatro promotores: el promotor precore / núcleo que contiene potenciador II, promotor S1, S2 promotor y X promotor que contiene promotor de I 18. Los ARNm de 3,5 kb y 3,4 kb se traducen en proteínas pre-core y Core, respectivamente. La proteína de la envoltura gra...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por el Programa de Investigación sobre Hepatitis de la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico (AMED) y por las Subvenciones para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ensayo de luciferasa nano-glo RegentPromegaN1110
Solución mixta de penicilina-estreptomicinaNacalai tesque09367-34 
MEM Solución de Aminoácidos No EsencialesThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Medio de suero reducidoThermo Fisher Scientific31985070
100 mm/plato recubierto de colágenoIwaki4020-010
Lipofectamine 3000 Reactivo de transfecciónThermo Fisher Scientific L3000001 
Polietilenglicol (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Polietilenglicol (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0,5 mol/L EDTA SoluciónNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, de polietétersulfona, de filtroMerck MilliporeSLHP033RS
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Placa de 96 pocillos recubierta de colágenoCorningNO3585
Lisis pasiva 5x TampónPromegaE1941
GloMax 96 Microplaca LuminómetroPromegaE6501
SacarosaNacalai tesque30403-55
Placa luminométricaGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Referencia 15
pUC1.2HBV delta epsilon--Referencia 15
pUC1.2HBV/NL--Referencia 15
tubo de 50 mlViolamo1-3500-02
Anti-Myc anticuerpoSigma-AldrichC3956
HBIGJaponesa de ProductosSanguíneos-IFN
-βMochida Pharmaceutical14987224005413
HeparinaSigma-AldrichH3393
Organización

Referencias

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