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Inducible líneas celulares estables LAP-etiquetado para la investigación de la función de proteínas, espacio-temporal y localización de las redes de interacción de proteínas

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DOI:

10.3791/54870

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24 de diciembre de 2016

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

En este artículo

Resumen

Describimos un método para generar líneas celulares estables inducibles marcadas con localización y purificación por afinidad (LAP) para investigar la función de las proteínas, la localización subcelular espacio-temporal y las redes de interacción proteína-proteína.

Resumen

Los complejos multiproteicos, en lugar de proteínas individuales que actúan de forma aislada, a menudo gobiernan las vías moleculares que regulan la homeostasis celular. Sobre la base de este principio, la purificación de las proteínas críticas necesarias para el funcionamiento de estas vías junto con sus socios nativos que interactúan no solo ha permitido el mapeo de los constituyentes proteicos de estas vías, sino que también ha proporcionado una comprensión más profunda de cómo estas proteínas se coordinan para regular estas vías. En este contexto, la comprensión de la localización espacio-temporal de una proteína y su red de interacción proteína-proteína puede ayudar a definir su papel dentro de una vía, así como la forma en que su mala regulación puede conducir a la patogénesis de la enfermedad. Para abordar esta necesidad, se han diseñado y utilizado con éxito varios enfoques para la purificación de proteínas, como la purificación de afinidad en tándem (TAP) y la localización y purificación de afinidad (LAP). Sin embargo, para aplicar estos enfoques a los análisis proteómicos a escala de vía, estas estrategias deben complementarse con los avances tecnológicos modernos en la clonación y la generación de líneas celulares estables de mamíferos. Aquí, describimos un método para generar líneas celulares estables humanas inducibles marcadas con LAP para investigar la localización subcelular de proteínas y las redes de interacción proteína-proteína. Este enfoque se ha aplicado con éxito a la disección de múltiples vías celulares, incluida la división celular, y es compatible con análisis proteómicos de alto rendimiento.

Introducción

Para investigar la función celular de una proteína no caracterizada, es importante determinar su localización subcelular espacio-temporal in vivo y sus proteínas asociadas que interactúan. Tradicionalmente, se han utilizado marcadores de epítopos simples y en tándem fusionados con el extremo N o C de una proteína de interés para facilitar la localización de proteínas y los estudios de interacción de proteínas. Por ejemplo, la tecnología de purificación por afinidad en tándem (TAP) ha permitido el aislamiento de complejos de proteínas nativas, incluso aquellos que son en baja abundancia, tanto en levaduras como en líneas celulares de mamíferos1,2. La tecnología de localización y purificación por afinidad (LAP), es un desarrollo más reciente que modifica el procedimiento TAP para incluir un componente de localización mediante la introducción de la proteína verde fluorescente (GFP) como una de las etiquetas de epítopos3. Este enfoque ha brindado a los investigadores una comprensión más profunda de la localización subcelular de una proteína en células vivas, al tiempo que conserva la capacidad de realizar purificaciones del complejo TAP para mapear las redes de interacción proteína-proteína.

Sin embargo, hay muchos problemas asociados con el uso de tecnologías TAP/LAP que han obstaculizado su uso generalizado en células de mamíferos. Por ejemplo, el período de tiempo necesario para generar una línea celular estable que exprese una proteína marcada con TAP/LAP de interés; que generalmente se basa en la clonación del gen de interés en un vector viral y la selección de integrantes estables de una sola célula con el nivel de expresión deseado. Además, muchas vías celulares son sensibles a la sobreexpresión de proteínas constitutivas (incluso a niveles bajos) y pueden detener células o desencadenar la muerte celular con el tiempo, lo que hace imposible la generación de una línea celular estable TAP/LAP. Estas y otras limitaciones han impedido que las metodologías LAP/TAP se conviertan en sistemas de alto rendimiento para la localización de proteínas y la elucidación de complejos proteicos. Por lo tanto, ha habido un interés considerable en el desarrollo de un sistema de etiquetado LAP inducible de alto rendimiento para células de mamíferos que aproveche las innovaciones actuales en clonación y tecnologías de líneas celulares.

Aquí presentamos un protocolo de interés para generar líneas celulares estables con proteínas marcadas con LAP inducibles con Doxiciclina/Tetraciclina (Dox/Tet) que aplica avances tanto en clonación como en tecnologías de líneas celulares de mamíferos. Este enfoque agiliza la adquisición de datos con respecto a la localización subcelular de proteínas marcadas con LAP, la purificación de complejos proteicos y la identificación de proteínas que interactúan4. Aunque la proteómica de afinidad utiliza una amplia gama de técnicas para la elucidación de complejos de proteínas5, nuestro enfoque es beneficioso para acelerar la identificación de estos complejos y sus redes de interacción nativas y es susceptible de un marcado de proteínas de alto rendimiento que es necesario para investigar vías biológicas complejas que contienen una multitud de constituyentes proteicos. La clave de este enfoque son los avances en las estrategias de clonación que permiten la clonación rápida y de alta fidelidad de genes objetivo en una variedad de vectores para la expresión génica in vitro, en varios organismos como bacterias y baculovirus, y en células de mamíferos6,7. Además, la colaboración ORFeome ha clonado miles de marcos de lectura abiertos validados por secuencias en vectores que incorporan estos avances en clonación, que están disponibles para la comunidad científica8-11. En nuestro sistema, el vector de etiquetado LAP pGLAP1 permite la clonación simultánea de un gran número de clones, lo que facilita el etiquetado LAP de alto rendimiento. Este procedimiento de clonación acelerada se combina con un enfoque simplificado para generar líneas celulares con genes de interés marcados con LAP insertados en un único locus genómico predeterminado. Esto hace uso de líneas celulares que contienen un solo sitio objetivo de reconocimiento de flippasa (FRT) dentro de su genoma, que es el sitio de integración para los genes marcados con LAP. Estas líneas celulares también expresan el represor de tetraciclina (TetR) que se une a los operadores de Tet (TetO2) aguas arriba de los genes marcados con LAP y silencia su expresión en ausencia de Dox/Tet. Esto permite la expresión inducible por Dox/Tet de la proteína marcada con LAP en cualquier momento. Tener la capacidad de expresión de proteínas marcadas con LAP inducibles es fundamental, ya que muchas vías celulares son sensibles a los niveles de proteínas críticas que gobiernan la vía y pueden detener el crecimiento celular o desencadenar la muerte celular cuando estas proteínas se sobreexpresan constitutivamente, incluso a niveles bajos, lo que hace imposible la generación de líneas celulares estables marcadas con LAP no inducibles12.

Protocolo

NOTA: Una visión general de la generación de líneas celulares estables LAP-inducible etiquetados para cualquier proteína de interés se ilustra en la Figura 1 y la visión general de expresión de la proteína LAP-etiquetados, purificación y preparación para la proteómica masiva análisis se ilustra en la Figura 3.

1. Clonación del marco de lectura abierto (ORF) del gen de interés en el vector LAP-tag

  1. La clonación de la ORF del gen de interés en el vector lanzadera.
    1. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ORF de interés con los sitios att B1 y attB2 apropiadas dentro de los cebadores para cualquiera de fusión N-terminal o C-terminal de la fusión. Ver Tabla 1 para las secuencias del cebador y la Tabla 2 para las condiciones de PCR.
    2. Gel purificar los productos de PCR mediante la resolución de ellos en un gel de agarosa al 1%. Escindir la banda amplificada que es el tamaño correcto del gel y extraerlo de la porción de gel utilizando un ADN gkit de extracción en el que las instrucciones del fabricante.
    3. Incubar la attB purificado que contiene productos de PCR con un attP que contiene el vector lanzadera y la recombinasa que permite a los productos de PCR a recombinan en el vector según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla M ateriales).
      NOTA: vectores lanzadera vacíos y LAP-etiquetado vectores contienen el gen CCD B y tienen que ser propagado en células bacterianas resistentes CCD B (véase la Tabla de Materiales). Sin embargo, el gen ccdB se recombina a cabo cuando un ORF está insertado en estos vectores, por lo tanto, utilizar células de E. coli DH5a de E. estándar cuando la propagación de vectores con ORFs clonados.
    4. Transformar células DH5a de E. coli con 1 l de producto de reacción y la placa de las células transformadas en un caldo de Luria (LB) placa de agar con 50 mg / ml de kanamicina 13.
    5. Seleccionar las colonias resistentes a la kanamicina.
    6. Crecer las colonias seleccionadas en LB mídia con 50 mg / ml de kanamicina, hacer un ADN mini-prep y confirmar la integración de genes mediante secuenciación de ADN usando los cebadores de secuenciación listados en la Tabla 3.
  2. Transferir el gen de interés desde el traslado del vector en el vector de LAP-tag.
    1. Incubar el vector lanzadera que contiene la secuencia verificada gen de ORF de interés con el vector de LAP-tag (pGLAP1 para la fusión N-terminal) y la recombinasa que media la transferencia del gen de interés a partir del vector lanzadera en el vector de LAP-tag según instrucciones del fabricante (ver Materiales).
      NOTA: Una serie de vectores LAP / TAP que se pueden utilizar en base a la promotora deseada, epítopo-tag, y N o C-terminal de marcado se pueden encontrar en la Tabla 4.
    2. Transformar células DH5a de E. coli con 1 l de producto de reacción y la placa de las células transformadas en una placa de agar LB con 100 mg / ml de ampicilina 13.
    3. Seleccione el colo resistentes a la ampicilinaEIN.
    4. Cultivar las colonias seleccionadas en medio LB con 100 mg / ml de ampicilina, hacer un ADN mini-prep, y confirmar la integración de genes mediante secuenciación de ADN usando los cebadores de secuenciación listados en la Tabla 5.

2. Generación de una línea celular estable inducible que expresa el gen de LAP-etiquetado de interés

  1. Seleccione la línea celular más adecuado para el proyecto de interés. Alternativamente, crear una línea de células huésped de cualquier línea celular existente que expresa constitutivamente el TetR y contiene un sitio de FRT que permite que el gen de la LAP-etiquetado de interés que se integra de forma estable en el genoma (ver Materiales).
    NOTA: Este protocolo utiliza una línea celular HEK293 que contiene el TetR y un sitio FRT, que se cultiva en DMEM -Tet media / F12 [hecha con 10% de suero bovino fetal (FBS) que está desprovisto de tetraciclina (-Tet)] 4 .
  2. Determinar la concentración mínima de higromicina necesaria para matar la línea de célula huésped dentro de 1 a 2 weeks después de la adición del fármaco. La concentración puede variar entre líneas de células huésped, con la mayoría oscila entre 100 mg / ml y 800 mg / ml.
    NOTA: Las células HEK293 cultivadas en DMEM -Tet / F12 con 100 g / ml de higromicina a 37 ° C y 5% de CO 2 morirá dentro de 1-2 semanas.
  3. Co-transfectar el vector que expresa la recombinasa flipasa (media la integración del gen LAP-etiquetada de interés en el sitio de FRT en el genoma de la célula) con el vector de LAP-etiquetado en células HEK293 usando un reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante . Utilice una relación de 4: 1 de vector recombinasa a vector LAP 14.
    NOTA: La relación óptima depende de la línea de células huésped y el método de transfección, y puede requerir una titulación. Una proporción de 4: 1 funciona bien para la mayoría de las líneas celulares. Incluir una placa transfectadas de manera simulada como control negativo.
  4. Un día después de la transfección, vuelva a colocar los medios de comunicación / F12 -Tet DMEM con medio fresco.
  5. Dos días después de la transfectien celdas divididas, a 25% de confluencia. Permiten que las células ~ 5 horas para fijar, a continuación, añadir que contiene higromicina / F12 -Tet DMEM a la concentración predeterminada en el paso 2.2. Para HEK293 células usan 100 mg / ml de higromicina.
    NOTA: El FRT que contiene la línea celular HEK293 también contiene el TetR que se asocia con la resistencia a Blasticidin, por lo tanto, 5 mg / ml Blasticidin se utiliza durante el proceso de selección de línea celular estable para seleccionar para el TetR y para reducir al mínimo la expresión permeable.
  6. Reemplazar higromicina que contiene -Tet medio DMEM / F12 como sea necesario hasta focos distintos de células que se asemejan aparecen manchas opacas contra la placa transparente.
  7. Añadir 20 l de tripsina en la parte superior de cada focos de células y pipetear hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una punta de pipeta de 200 l. las células de lugar en una placa de 24 pocillos y ampliar las células de crecimiento continuo en higromicina que contiene -Tet medio DMEM / F12.
  8. las células de malla para la expresión de proteínas etiquetadas LAP-inducible por células fijas o en vivo de células microscopía de fluorescencia y / oWestern blot para la etiqueta GFP dentro de la etiqueta de LAP-15.

3. Purificación de complejos de proteínas LAP-etiquetado

NOTA: Los siguientes LAP-etiquetados de purificación de proteínas detalles del protocolo recomendaciones sobre las condiciones y volúmenes utilizados para construir una típica purificación de proteínas LAP-etiquetados con base en la experiencia previa. Sin embargo, se debe tener precaución para asegurar que la optimización empírica se lleva a cabo por cualquier complejo de proteínas y proteínas nivel de expresión de interés para proporcionar los mejores resultados.

  1. El crecimiento celular y la recolección de células.
    1. Expandir la línea celular LAP-etiquetados validado para el aislamiento de complejos de proteínas TAP, haciendo pasar continuamente todas las células HEK293 en placas de mayor tamaño y / o botellas de rodillos en -Tet medio DMEM / F12 a 37 ° C y 5% de CO2.
    2. Para las líneas de células inducible Tet / Dox, inducir durante 10-15 horas a una concentración de 0,2 mg / ml Tet / Dox cuando las células alcanzan ~ 70% de confluencia, antes de harvestincélulas g.
      NOTA: La concentración y el tiempo de inducción debe determinarse para cada proteína, se recomienda una titulación de 0,1-1 g / ml Tet / Dox durante 10-15 horas.
    3. Las células de la cosecha por agitación o células tripsinización y pellet en 875 g durante 5-10 minutos.
  2. Acoplamiento de anticuerpos anti-GFP de cuentas de Proteína A
    1. Utilizar 40 g de anticuerpo para la inmunoprecipitación de un lisado preparado a partir de un pellet de 0,5 ml de células, el volumen de células empaquetadas (PCV).
      NOTA: La cantidad de anticuerpo necesaria dependerá de la abundancia de la proteína LAP-etiquetado, entre otros factores, y requerirá la optimización. Se recomienda un ajuste de 10-40 mg.
    2. Equilibrar 160 l de volumen lleno (PV) cuentas de Proteína A en PBST (PBS + 0,1% Tween-20) en un tubo de 1,5 ml. Lavar 3 veces con 1 ml de PBST.
      NOTA: Todos los lavados en este documento se llevan a cabo mediante la centrifugación de las perlas a 5.000 xg durante 10 seg.
    3. Volver a suspender las perlas en 500 l de PBST y añadir 80 g de afinidadconejo -purified anticuerpo anti-GFP a cada tubo de 160 perlas mu l. Mezclar durante 1 hr a temperatura ambiente (RT).
    4. Lavar los granos 2 veces con 1 ml de PBST. A continuación, lavar los granos 2 veces con 1 ml de borato de sodio 0,2 M, pH 9 (ácido bórico 20 ml 0,2 M de borato de sodio + 15 ml 0,2 M). Después del lavado final, añadir 900 l de borato de sodio 0,2 M, pH 9 para llevar el volumen final a 1 ml.
    5. Añadir 100 l de dimethylpimelimidate 220 mM (DMP) a una concentración final de 20 mM. Girar los tubos suavemente a TA durante 30 min. Para DMP 220 mM, resuspender contenido de un frasco de 50 mg en 877 l de borato de sodio 0,2 M, pH 9 y añadir de inmediato a la suspensión de perlas.
    6. Después de la incubación con DMP, lavar perlas de 1 hora con 1 ml de 0,2 M etanolamina, 0,2 M NaCl pH 8,5 para inactivar el agente de reticulación residual. perlas de resuspender en 1 ml del mismo tampón y giran durante 1 hora a RT. perlas de pellets y perlas de volver a suspender en 500 l de etanolamina 0,2 M, NaCl 0,2 M pH 8,5. Perlas son estables durante Several meses a 4 ° C.
  3. Preparación de tampones para lisis celular y purificación Complex
    1. Preparar buffers Lapx (donde x es la concentración de sal deseada [KCl mM] de la memoria intermedia de LAP; 300 mM para la lisis celular, 200 mm para la mayoría de los lavados de talón, y 100 mM para el lavado de los granos antes de eluir las proteínas) haciendo una solución de pH 7,4 que contiene mM 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico 50 (HEPES), KCl X mM, 1 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 1 mM MgCl 2, y 10% de glicerol.
      NOTA: Los componentes de este tampón se utiliza para aproximar el medio ambiente en las células vivas. HEPES se utiliza como una memoria intermedia en la rabia pH de 7.2 a 8.2. KCl es una sal que se usa para mantener la fuerza iónica del tampón. EGTA es un agente quelante que se une iones de calcio para reducir los niveles de calcio en comparación con magnesio. El glicerol y MgCl 2 se utilizan para mejorar la estabilidad de las proteínas.
    2. Preparar tampón LAPX N mediante la adición de 0,05% phenoxypol nonilyethoxylethanol a la memoria intermedia LAPX.
      NOTA: nonil phenoxypolyethoxylethanol es un detergente suave que solubiliza las proteínas, pero conserva las interacciones proteína-proteína, por lo tanto se utiliza una concentración más alta durante el proceso de extracción y luego se baja durante las etapas de unión y de lavado.
  4. Preparación de lisados ​​de células
    1. Resuspender 500 l de PCV en 2,5 ml de LAP300 con ditiotreitol 0,5 mM (DTT) y los inhibidores de la proteasa. Añadir 90 l de 10% phenoxypolyethoxylethanol nonil (0,3% final) y mezclar por inversión.
    2. Colocar en hielo durante 10 min. Centrifugar a 21.000 xg durante 10 min. Recoger este sobrenadante de baja velocidad (LSS). Tomar una muestra de 10 l de la LSS para el análisis en gel.
    3. LSS transferir a un tubo TLA100.3 y centrifugado a 100.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Recoger este sobrenadante de alta velocidad (HSS), en un tubo y colocar en hielo. Tomar una muestra de 10 l de la HSS para el análisis en gel.
      NOTA: Evitar tomar la capa más superior de lípidosd de la capa inferior más restos celulares. La capa de lípidos debe ser removido por aspiración al vacío antes de recoger el HSS.
  5. Primera captura por afinidad: La unión a los granos anti-GFP
    1. Perlas de anticuerpo acoplado Pre-eluir (utilizan 160 l de perlas por 0,5 ml sedimento celular (PCV)) lavándolos 3 veces con 1 ml de tampón de elución [3,5 M MgCl 2 con Tris 20 mM, pH 7,4] para deshacerse de desacoplado anticuerpos y reducir el fondo. Hacerlo rápidamente. No deje perlas en alta sal durante mucho tiempo.
    2. Lávese las perlas 3 veces con 1 ml de N LAP200. Mezclar HSS extracto con perlas de anticuerpo durante 1 hora a 4 ° C. Centrifugar a 21.000 xg durante 10 min. Tomar una muestra de 10 l del sobrenadante (es decir, el flujo a través (FT)) para el análisis de gel.
    3. Lavar perlas 3 veces con 1 ml de N LAP200 con inhibidores de 0,5 mM de DTT y de la proteasa. Lavar los talones 2 veces (5 minutos cada uno) con 1 ml de N LAP200 con inhibidores de 0.5 mM de DTT y la proteasa. Lavar rápidamente 2 tIME con 1 ml de N LAP200 con DTT 0,5 mM y no hay inhibidores de la proteasa antes de la adición de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV).
  6. La escisión VET
    1. Diluir 10 g de la proteasa TEV en 1 ml de N LAP200 y girar los tubos a 4 ° C durante la noche.
      NOTA: Este paso puede ser optimizado para cualquier proteína LAP-etiquetado para ser completado en unas pocas horas mediante el ajuste de la concentración de la proteasa TEV, que puede ayudar a la conservación de los complejos de proteínas de LAP-tagged.
    2. perlas de pellets y la transferencia de sobrenadante a un tubo nuevo. Enjuague perlas dos veces con 160 l LAP200 N con DTT 0,5 mM e inhibidores de proteasa (triple de concentración) para eliminar cualquier proteína residual. Tomar una muestra de 10 l del sobrenadante para el análisis de gel.
  7. En segundo lugar de captura por afinidad: La unión a la proteína S de agarosa
    1. Lavar 1 tubo de 80 l de suspensión de agarosa proteína S (40 l de resina compacta) 3 veces con 1 ml de N LAP200.
      NOTA: S protein unión a la etiqueta S reconstituirá una RNasa activa y una segunda etiqueta epítopo alternativa debe ser considerado para ARN que contiene complejos de proteínas.
    2. Añadir TEV eluyó sobrenadante a S perlas de agarosa de proteína y rock durante 3 horas a 4 ° C. Perlas de pellets y lavar 3 veces con 1 ml de N LAP200 con inhibidores de 0,5 mM de DTT y de la proteasa. Lavar los granos 2 veces con 1 ml de LAP100.
  8. La elución de proteínas
    1. Eluir proteínas de la proteína S de agarosa mediante la adición de 50 l de tampón de muestra 4x Laemmli y se calienta a 97 ° C durante 10 min.
      NOTA: Las proteínas también se pueden eluir de las perlas con tampón de elución (3,5 M MgCl 2 con Tris 20 mM, pH 7,4).

4. Identificar las proteínas que interactúan mediante análisis de Espectrometría de Masas

  1. Prueba de la calidad de la purificación mediante el análisis de las muestras recogidas por electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE), tinción con plata del gel (véase Tabla de Materiales) y por inmunotransferencia de los eluatos y sondeo con anticuerpos anti-GFP para asegurarse de que la purificación LAP-etiquetados trabajó 16, véase la Figura 4.
  2. Para identificar las especies co-purificación de estequiométricos y substoichiometric, tomar la muestra de elución final y separarlo por SDS-PAGE. Tinción del gel con una espectrometría de masas de tinción de proteínas compatible. Escindir las bandas más prominentes y el espacio entre ellas a partir del gel y procesarlos para su análisis por espectrometría de masas por separado 16.
    NOTA: Existen numerosos métodos para separar los eluidos finales de purificación y prepararlos para la espectrometría de masas 5. Por ejemplo, los complejos de LAP-purificado se pueden eluir de las perlas S-proteína mediante el uso de alta concentración de sal (3,5 M MgCl 2) y toda la población de proteínas en masa se puede analizar por espectrometría de masas 17. Alternativamente, eluidos finales se pueden separar para 1 mm por SDS-PAGE y una sola banda de 1 mm puede ser excised y analizado. Esto borra la compleja mezcla de los granos o partículas que puedan interferir con el análisis.

Resultados

Para poner de relieve la utilidad de este sistema, el marco de lectura abierto (ORF) de la proteína de unión Tau microtúbulos se clonó en el vector lanzadera mediante la amplificación de la Tau ORF con cebadores que contienen sitios att B1 y attB2 (Tabla 1) y la incubación de los productos de PCR con el vector lanzadera y una recombinasa que media la inserción de los productos de PCR en el vector lanzadera. Los productos de reacción se utilizaron para transformar bacterias DH5a 13 y ADN de plásmido a partir de colonias resistentes a la kanamicina fue secuenciado para garantizar que la inserción Tau. Después se usó una secuencia validado vector lanzadera-Tau para transferir el Tau ORF en el vector de pGLAP1, que fusiona Tau en marco con la LAP (EGFP-TEV-S-proteína) tag, incubando el vector lanzadera-Tau con el vector pGLAP1 y la recombinasa que media la transferencia de la ORF a partir del vector lanzadera a pGLAP1. Los productos de reacción se utilizaron para transformar bacterias DH5a13 y el ADN plasmídico a partir de colonias resistentes a la ampicilina se secuenció para asegurarse de que la fusión LAP-Tau estaba en marco. Secuencia validado pGLAP1-LAP-Tau fue entonces co-transfectadas con un vector que expresa la enzima flipasa recombinación en células HEK293 que contenía una diana de reconocimiento única flipasa sitio (FRT) dentro de su genoma, que es el sitio de integración para genes LAP-etiquetados 14. Esta línea celular también expresó el TetR que se une a operadores Tet aguas arriba de los genes LAP-etiquetados y silencia su expresión en ausencia de Tet / Dox. integrantes estables se seleccionaron con DMEM -Tet media / F12 con 100 mg / ml de higromicina durante 5 días. Higromicina focos de células resistentes individuales se recogieron mediante la adición de 20 l de tripsina en la parte superior y pipeteando arriba y abajo 2 veces. Las células se colocaron en una placa de 24 pocillos y expandido en crecimiento continuo en -Tet DMEM media / F12.

Para verificar que la célula resistentes a higromicinas eran capaces de expresar LAP-Tau, se indujeron las células HEK293 LAP-Tau con 0,1 mg / ml de Dox durante 15 hr extractos de proteínas y se prepararon a partir de células no inducidas e inducidas-Dox. Estos extractos se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, y a inmunotransferencia para GFP y tubulina como control de carga. Como se ve en la figura 4A, LAP-Tau (visualizado con anticuerpos anti-GFP) solamente se expresó en presencia de Dox. Para validar que LAP-Tau fue localizado adecuadamente al husillo microtúbulos mitótico durante la mitosis, como se había demostrado previamente para Tau endógena 18, se indujeron las células HEK293 LAP-Tau con 0,1 mg / ml de Dox durante 15 horas y las células se fijaron con 4% paraformaldehído y co-manchado para el ADN (Hoechst 33342) y los microtúbulos (anticuerpos anti-tubulina). Consistentemente, LAP-Tau se localizó en el huso mitótico durante la metafase de la mitosis (Figura 4B). Para verificar que LAP-Tau y sus proteínas de interacción podría ser purificado con este sysTEM, células HEK293 LAP-Tau se cultivaron en frascos rotativos a ~ 70% de confluencia, se indujeron con 0,1 g / ml Dox durante 15 horas, se recogieron por agitación, se lisaron con tampón de LAP300, y LAP-Tau se purificó utilizando el protocolo anterior. Los eluidos de la purificación LAP-Tau se resolvieron mediante SDS-PAGE y el gel se tiñó de plata. La figura 4C muestra la purificación de LAP-Tau, marcados con un asterisco es LAP-Tau y varias otras bandas indicativas de las proteínas que interactúan Tau se pueden ver.

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Figura 1: Visión general de la Generación de líneas celulares estables inducibles LAP-etiquetado para cualquier proteína de interés. El marco de lectura abierto (ORF) de genes de interés se amplifican con att B1 y attB2 sitios flanqueantes 5 'y 3' secuencias finales, respectivamente (secuencias de los cebadores se dan en la Tabla 1) y se clonó en el vector lanzadera. vectores lanzadera se verificó la secuencia con el gen de interés se utilizan entonces para transferir el gen de interés en el vector pGLAP1. La secuencia verificada pGLAP1 vector con el gen de interés es entonces co-transfectadas con el vector que contiene la recombinasa flipasa en la línea celular deseada que contiene una diana de reconocimiento única flipasa sitio (FRT) dentro de su genoma, que es el sitio de integración para LAP genes-etiquetados. Estas líneas celulares también expresan el represor Tet (TetR) que se une a operadores tet (TetO 2) aguas arriba de los genes LAP-etiquetados y silencios su expresión en ausencia de Tet / Dox. El gen LAP-etiquetado de interés se recombinan luego en el sitio FRT y integrantes estables se seleccionan con higromicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Visión general de las solicitudes de líneas celulares estables LAP-etiquetado. líneas celulares estables inducibles LAP-etiquetados son inducidas a expresar la proteína LAP-etiquetada de interés mediante la adición Dox y se pueden sincronizar en las diversas etapas del ciclo celular o se pueden estimular con productos químicos o ligandos para activar cualquier ruta de señalización deseada. La localización subcelular de la proteína LAP-etiquetados de interés puede ser analizada por células vivas imágenes de células o fijo. proteínas LAP-etiquetados también pueden ser afinidad tándem purificado y sus proteínas de interacción pueden ser identificados por cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS / MS). Finalmente, Cytoscape se puede usar para generar una red de interacción proteína-proteína de la proteína de cebo. Dox indica doxiciclina, IP indica inmunoprecipitado, EGFP indica un mejoramiento de la proteína fluorescente verde, Tev indica sitio de escisión de la proteasa TEV, y S indica S-tag.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Visión general de LAP-etiquetados proteína Expresión, purificación y preparación para la espectrometría de masas. El protocolo tiene 9 pasos: 1) el crecimiento y la inducción de la expresión de la proteína LAP-tagged, 2) la recolección de células y lisis, 3) la preparación de los lisados, 4) la unión de los lisados ​​a perlas anti-GFP, 5) de escisión de la proteasa TEV de la etiqueta GFP, 6) la unión de los lisados ​​a perlas de S-proteína, 7) la elución de la proteína cebo y las proteínas que interactúan, y 8-9) la preparación de muestras para análisis proteómicos basada en espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Verificación de la expresión de LAP-Tau. (A) de transferencia de Western (WB) el análisis de muestras de proteína a partir de células no inducidas y dox inducida LAP-Tau HEK293 sondadas con anti-GFP y anticuerpos anti-tubulina para detectar la proteína Tau LAP-etiquetado y el control de tubulina de carga, respectivamente. Tenga en cuenta que LAP-Tau se expresa solamente cuando se inducen las células con Dox. Las células (B) mitóticas que expresan LAP-Tau se fijaron y se co-manchado para el ADN (Hoechst 33342) y tubulina (Tub) con anticuerpos anti-tubulina y la localización subcelular de LAP-tau se analizó mediante microscopía de fluorescencia. Tenga en cuenta que LAP-Tau se localiza en el husillo y del huso mitótico durante la mitosis polos. (C) se tiñeron con plata del gel de la purificación de LAP-Tau. MW indica el peso molecular, CL indica despejado lisados, y E indicates eluatos finales. Las muestras se analizaron en un SDS-PAGE al 4-20% y el gel se reveló con plata para visualizar las proteínas purificadas. Tenga en cuenta que una banda correspondiente a LAP-Tau está marcado con un asterisco y varias otras bandas correspondientes a las proteínas co-purificación se puede ver. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Fusión N-terminal
Adelante 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
Marcha atrás 5'-T GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TTATCA - (> 18gsn) -3 '
Fusión C-terminal
Adelante 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
Marcha atrás 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (> 18gsn) -3 '

Tabla 1: cebadores directo e inverso para amplificar los ORF o interés para la inserción en el vector lanzadera. Los sitios attB se resaltan en negrita, GSN indica que más de 18 genes nucleótidos específicos se añaden a la imprimación.

Paso Temperatura Hora
La desnaturalización inicial 94 ° C 2 minutos
Los ciclos de amplificación por PCR (35) Desnaturalizar 94 ° C 30 segundos
Recocer 55 ° C (dependiendo de la imprimación Tm) 30 segundos
Ampliar 72 ° C 1 min / kb
Sostener 4 ° C indefinidamente

Tabla 2: Condiciones de PCR para la amplificación de los ORFs de interés.

Vector Primer avance de Secuenciación La secuenciación inversa cartilla
Vector de traslado 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5 'CAGGAAACAGCTATGAC-3'

Tabla 3: directo e inverso de secuenciación Los cebadores para el traslado del vector.

CARNÉ DE IDENTIDAD Estructura De los padres Promotor Bac Res Mam Res Reg Tet?
pGLAP1 péptido EGFP-TEV-S N plazo pcDNA5 / FRT / A CMV Amperio Hyg Sí
pGLAP2 péptido Flag-TEV-S N plazo pcDNA5 / FRT / A CMV Amperio Hyg Sí
pGLAP3 N-terminal EGFP-TEV-S péptido; C plazo V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a Amperio Hyg No
pGLAP4 N plazo Bandera-TEV-S péptido; ; C plazo V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a Hyg No
pGLAP5 S C-término péptido-PreProt x2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a Amperio Hyg No

Tabla 4: Lista de vectores LAP / TAP disponibles con los promotores de carácter variable, epítopo de etiquetas, y las capacidades de expresión inducibles para Dox N o marcado de la proteína C-terminal. Los vectores están disponibles comercialmente. Bac Res indica marcador de resistencia bacteriana, Mam Res indica marcador de resistencia de células de mamíferos, Tet reg? indica si la expresión es Tet / Dox regulable.

Vector Primer avance de Secuenciación La secuenciación inversa cartilla
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 '

Tabla 5: directo e inverso de secuenciación Los cebadores para pGLAP vectores.

Discusión

El protocolo descrito se describe la clonación de genes de interés en el vector de LAP-etiquetado, la generación de líneas celulares estables LAP-etiquetados inducibles, y la purificación de complejos de proteínas LAP-etiquetado para análisis proteómicos. Con respecto a otros enfoques LAP / TAP-etiquetado, este protocolo se ha simplificado para que sea compatible con enfoques de alto rendimiento para trazar un mapa de localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína dentro de cualquier vía celular. Este enfoque ha sido ampliamente aplicado a la caracterización funcional de proteínas críticas para la progresión del ciclo celular, el montaje de huso mitótico, homeostasis polo del huso, y ciliogenesis para nombrar unos pocos, y ha ayudado a la comprensión de cómo misregulation de estas proteínas puede conducir a enfermedades humanas 15, 16,19,20. Por ejemplo, nuestro grupo recientemente utilizado este sistema para definir la función y regulación de la quinesina mitótica STARD9 (un blanco cáncer candidato) en el conjunto del husillo 15,21, para definir unanuevo enlace molecular entre la cadena ligera de dineína Tctex1d2 y cortas síndromes costilla polidactilia (SRPS) 19, y para definir un nuevo vínculo molecular para entender cómo la mutación de la ubiquitina ligasa Mid2 puede llevar a la discapacidad intelectual ligados al cromosoma X 16. Otros laboratorios también han aplicado con éxito este método, incluyendo uno que determina que Tctn1, un regulador de la señalización de Hedgehog ratón, era una parte de un complejo de proteínas ciliopathy asociada a que la composición de membrana ciliar regulado y ciliogenesis de una manera dependiente de tejido 22,23. Por lo tanto, este protocolo se puede aplicar ampliamente a la disección de cualquier vía celular.

Un paso crítico en este protocolo es la selección de líneas celulares estables LAP-etiquetado que son resistentes a higromicina. Se debe tener especial cuidado para asegurar que todas las células de la placa de control están muertos antes de seleccionar focos en la placa experimental para la amplificación. Higromicina también se puede Added durante el cultivo celular rutinario de líneas celulares estables LAP-etiquetado para garantizar además que todas las células mantienen el gen LAP-etiquetado de interés en el sitio de FRT. Advertimos que no todas las proteínas LAP-etiquetados serán funcionales y que es importante disponer de ensayos en el lugar que se pueden utilizar para probar la función de la proteína. Los ejemplos de ensayos usados para poner a prueba la función de proteínas incluyen el rescate de fenotipos siRNA inducida y en ensayos de actividad in vitro. Para hacer frente a cualquier problema potencial con la adición de una gran LAP-tag, hemos generado anteriormente vectores TAP-tag compatibles con este sistema que contiene las etiquetas más pequeñas, como FLAG, que son menos propensos a inhibir la función y localización de la proteína de interés 4. Además, existen vectores de LAP-etiquetado para generar proteínas LAP-etiquetados C-terminal o proteínas TAP-etiquetados C-terminales que son compatibles con este sistema, que puede ser utilizado en los casos en que una etiqueta LAP / TAP no se tolera en el extremo N -terminal de una proteína. Además, THe sal y detergentes concentraciones de los tampones de purificación (LAPX N) se pueden modificar para aumentar o disminuir el rigor de purificación si se observa ninguno o demasiado muchas interacciones. Del mismo modo, el tándem procedimiento de purificación por afinidad es más estricto que los procedimientos de purificación y interactores débiles solo se pueden perder, por tanto, un esquema de purificación solo se puede utilizar cuando se identifican pocos o ningún interactores.

Es importante tener en cuenta que existen otros enfoques GFP epítopo de marcado que permiten la proteína GFP gran escala de marcado para localización y purificación de proteínas estudios 24,25. Estos incluyen el enfoque BAC Transgenomics que utiliza cromosomas artificiales bacterianos para expresar genes GFP-etiquetados de interés de su entorno nativo que contiene todos los elementos reguladores, que imita la expresión de genes endógenos 24. Más recientemente, CAS9 / RNA-guiado individual (sgRNA) complejos de ribonucleoproteína (RNPs) se han utilizado para terminarexógenamente etiquetar los genes de interés con un sistema split-GFP que permite la expresión de los genes GFP-etiquetados de sus loci genómica endógena 25. Aunque ambos enfoques permiten la expresión de proteínas etiquetadas en condiciones endógenas, en comparación con el protocolo LAP-etiquetado descrito aquí, que no permiten la expresión inducible y sintonizable de los genes en la categoría de interés. Además, todavía tienen que aplicarse a epítopo etiquetado tándem de TAP. También es importante tener en cuenta que otros sistemas de marcado también se pueden modificar para ser compatible con el sistema descrito aquí para la generación de líneas celulares estables epítopo de etiquetado inducibles. Por ejemplo, la identificación de proximidad biotina-dependiente (BioID) ha ganado considerable atención debido a su capacidad para definir las relaciones espaciales y temporales entre las proteínas que interaccionan 26. Esta técnica explota fusiones de proteínas a una cepa promiscua de la Escherichia coli biotina ligasa BirA, que biotinilars cualquier proteína dentro de un radio de ~ 10 nm de la enzima. Las proteínas con biotina son luego purificado por afinidad usando captura de biotina-afinidad y se analizó la composición por espectrometría de masas. BirA se biotinilar cualquier proteína en estrecha proximidad, incluso de forma transitoria, que hace que sea especialmente adecuado para la detección de débiles socios que interactúan dentro de un complejo 27. Además, el esquema de purificación no requiere que las interacciones proteína-proteína endógenos permanecen intactos y pueden llevarse a cabo bajo condiciones de desnaturalización, reduciendo así la tasa de falsos positivos. Dentro de nuestro protocolo actual, la sustitución del vector pGLAP1 por un vector BirA-etiquetado podría transformar este sistema desde la identificación de las interacciones proteína-proteína en base a la afinidad a la detección de ellos basado en la proximidad. un sistema de este tipo sería muy ventajoso para la detección de interacciones proteína transitorios como es el caso entre muchas interacciones enzima-sustrato y para mapear el inte proteína-proteína espacio-temporalracciones dentro de las estructuras definidas como se ha llevado a cabo para el centrosoma y los cilios 26,28.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias NSF-MCB1243645 (JZT), cualquier opinión, hallazgo y conclusión o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la Fundación Nacional de Ciencias. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Flp-In T-REx Core KitInvitrogenK6500-01Kit para generar líneas celulares que contienen un sitio FRT y expresión de TrtR
PETG, 5xNunc, Inc. 73520-734Frasco con rodillo para células
de cultivo PETG, 2.5xNunc, Inc. 73520-420Frasco de rodillo para células en crecimiento
Apiladores de célulasCorning CellSTACK3271Apilador de células para células en crecimiento
Tubos de centrífuga cónicos de 500 mlCorning 431123Tubos para la recolección de células
Anticuerpo anti-GFPInvitrogenA11122Anticuerpo anti GFP
de conejo Affiprep Proteínas A perlasBiorad156-0006Utilizado como matriz para conjugar anticuerpos anti-GFP
Dimetilpimelomidato (DMP)ThermoFisher Scientific21667Se utiliza para conjugar anticuerpos anti-GFP con perlas de proteína A
Tubos TLA100.3Beckman349622Tubos para centrifugar lisados de proteínas durante la etapa de limpieza
TEV proteasaInvitrogen12575-015Se utiliza para escindir la etiqueta GFP de proteínas marcadas con LAP N-terminales
Proteasa de precesiónGE Healthcare27-0843-01Se utiliza para escindir la etiqueta GFP de proteínas marcadas con LAP C-terminal
Proteína S agarosaNovagen69704Se utiliza como segunda matriz de afinidad durante la purificación de complejos proteicos marcados con LAP Kit de
extracción de gel de ADN QIAquick Qiagen28704/28706Para su uso en la purificación de productos de PCR a partir de un gel de agarosa
BP clonasa IIInvitrogen11789020 Se utiliza para clonar productos de PCR ORF en el vector de lanzadera pDONR221
LR clonasa IIInvitrogen11791020Se utiliza para clonar el ORF del gen de interés en el vector de marcado LAP1 pGLAP1
ccdB Survival 2 T1R E. coliInvitrogenA10460Se utiliza para propular vectores lanzadera y vectores vacíos pGLAP
Fugene 6PromegaE2691Reactivo de transfección para la transfección de vectores en células humanas
TetraciclinaInvitrogenQ100-19Fármaco para inducir la expresión de proteínas inducibles por Dox/Tet 
DoxiciclinaClontech631311fármaco para inducir la expresión de proteínas inducibles por Dox/Tet 
Higromicina BInvitrogen10687010Fármaco para la selección de integrantes estables marcados con LAP
KanamicinaCorning61-176-RGFármaco para la selección de colonias bacterianas resistentes a Kanamicina
AmpicilinaFisherBP1760-5Fármaco para la selección de colonias bacterianas resistentes a la ampicilina
4-20% Tris Glycine SDS-PAGE gelesBiorad4561094Se utiliza para separar muestras de proteínas y purificar los eluidos finales de
la etiqueta LAP, Silver Stain Plus KitBiorad1610449Se utiliza para teñir con plata los eluidos de las puficaciones marcadas con LAP y las muestras recogidas a lo largo del proceso de purificación 
Tinción azul CoomassieInvitrogenLC6060Se utiliza para teñir geles SDS-PAGE para visulizar purificaciones marcadas con LAP y cortar bandas de proteínas, compatible con espectrometría de masas
Vector de lanzadera pDONR221Invitrogen12536017Vector de lanzadera para clonar los ORF de genes de interés Vector expresador de
flippasa pOG44InvitrogenV600520Vector que expresa la recombinasa Flippasa para integrar genes marcados con LAP en el genoma de líneas celulares que contienen un sitio FRT
ADN polimerasa Platinum TaqThermoFisher Scientific10966018Se utiliza para la amplificación por PCR de los ORF de genes de interés
4x Tampón de muestra LaemmliBiorad1610747Tampón de muestra para eluir complejos de proteínas purificados marcados con LAP a partir de medios de
caldo Luria (LB) de matriz de perlasFisherBP9723-2Se utiliza para el cultivo de DH5 y alfa; kit
minipreparación de ADNPromegaA1222Se utiliza para hacer miniprepaciones de plásmidos de ADN
DMEM/F12medios HycloneSH30023.01Para el cultivo de células humanas Hek293
FBS sin TetAltanta BiologicalsS10350Se utiliza para fabricar medios -Tet DMEM/F12 para generar y cultivar líneas celulares estables inducibles marcadas con LAP
TripsinaHycloneSH30042.01Para levantar los focos celulares Hek293 de las placas Tabletas inhibidoras de
la proteasaRoche11836170001Se utiliza para fabricar tampones de protocolo,
fenoxipolietoxietanol nonil al 10% libre de EDTA Roche11332473001Se utiliza para hacer tampones de protocolo
PBSCorning21-040-CMSe utiliza para hacer tampones de protocolo
Tween-20FisherBP337-500Se utiliza para hacer tampones de protocolo
Borato de sodioFisher S249-500Se utiliza para hacer tampones de protocolo
Ácido bóricoFisherA78-500Se utiliza para hacer tampones de protocolo
EtanolaminaCalbiochem34115Se utiliza para hacer tampones de protocolo
NaClFisherP217-3Se utiliza para hacer tampones de protocolo
KClFisherBP358-10Se utiliza para hacer tampones de protocolo
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172-25Se utiliza para hacer tampones de protocolo
MgCl2FisherM33-500Se utiliza para hacer búferes de protocolo
Tris baseFisherBP152-5Se utiliza para hacer búferes de protocolo
de

Referencias

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