La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Summary

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

Abstract

Clínica vitrificación de embriones evolucionado con el desarrollo de dispositivos de vitrificación únicas en el siglo ²¹ y con la idea errónea de que el enfriamiento ultrarrápido en un sistema "abierto" (es decir, directa LN ₂ de contacto) era una necesidad para optimizar el éxito de vitrificación. El dogma que rodea a la importancia de las velocidades de enfriamiento dio lugar a prácticas inseguras están sujetos a variación técnica y para la creación de dispositivos de vitrificación que desatendieron importantes factores de control de calidad (por ejemplo, la facilidad de uso, la repetibilidad, fiabilidad, seguridad etiquetado, seguridad y almacenamiento). La comprensión de los defectos de control de calidad de otros dispositivos permitidos para el desarrollo de un método mS-VTF seguro, seguro, repetible y fiable basado en la minimización de variación intra e inter-técnico. Igualmente importante es que combina la disponibilidad de dos dispositivos compatible con la FDA existentes: 1) un ionómero de paja embrión resina de 0,3 mL con interiorizado, de dos colores, manipulaciones petiquetado azotea con potencial sello soldado repetible; y 2) acortada, comúnmente utilizado, ID 300-m flexipettes estériles para cargar directamente el embrión (s) con el fin de crear un dispositivo de vitrificación global altamente eficaz. Al igual que otros aséptica, se cerraron los sistemas de vitrificación (por ejemplo, alta seguridad de vitrificación (HSV), Rapid-i, y VitriSafe) utilizado con eficacia en medicina reproductiva, microSecure vitrificación (mS-VTF) ha demostrado que puede lograr una alta supervivencia post-calentamiento y el embarazo los resultados con su atención a la simplicidad, y la reducción de la variación técnica. Aunque la paja embrión 0,3 ml que contenía un tapón hidrófobo interno fue sustituido en el comercio con una paja semen estándar que posee pirrolidona algodón de polivinilo (PVP) tapones, mantuvo su composición de resina de ionómero de garantizar el sellado de soldadura. Sin embargo, los tapones de algodón pueden absorber el contenido de líquido embrión de la flexipettes al entrar en contacto. Un método mS-VTF modificado fue adaptado para incluir una soldadura interna adicionalsellar antes de que el enchufe en el lado de carga del dispositivo. El paso técnico incluido en el procedimiento mS-VTF no ha afectado a su aplicación con éxito, como altas tasas de supervivencia (> 95%) y las tasas de embarazo continuará hoy.

Introduction

La vitrificación es la tecnología asistida más impactante sola reproductiva en la industria de la fertilización in vitro (IVF) ya que el desarrollo de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Hoy en día, los blastocistos son criopreservados sin la pérdida de la viabilidad de los embriones previamente asociados con los métodos convencionales de congelación ^lenta-1. Con la supervivencia embrionaria post-calentamiento fiable, la industria de la infertilidad se está transformando en el uso preferente de los ciclos de transferencia de embriones criopreservados, que producen los resultados del embarazo similares o superiores tradicional de transferencia de embriones frescos. En asociación con la biopsia de blastocisto y el cribado genético preimplantacional (DGP), la vitrificación se ha convertido en una herramienta clínica fundamental para optimizar los resultados de nacidos vivos sanos a través de la transferencia de embriones euploid solo ^{2, 3.}

Vitrificación de embriones murino fue desarrollado a mediados de la década de 1980 ^{4, 5} y adaptada a la ganadería en 1990 ^6. Partiendo de la premisa de que las soluciones de vitrificación forman un estado metaestable glasseous, libre de dañar la formación de cristales de hielo, se ha demostrado para preservar de manera más eficiente la integridad celular completa de embriones. Curiosamente, la aceptación prometedora de vitrificación en embriología humana no comenzó a hacerse realidad hasta el siglo ^21. Las primeras publicaciones que promueven el uso de la vitrificación coincidieron con el desarrollo de los únicos dispositivos del sistema "abierto" ^{7, 8, 9.} Sin embargo, la adopción de vitrificación en la práctica clínica fue lenta, ya que se produjo en un momento en que las mejoras en la congelación de blastocisto lenta también se estaban produciendo. El éxito de la congelación-velocidad lenta convencional, además de la vitrificación, fueron alineadas con las mejoras en los sistemas de cultivo de embriones, así como con la Incorporation de enfoques colapso blastocele, que mejora tanto la supervivencia global de trophectoderm y, posteriormente, la implantación ^10.

En la última década, la tecnología de vitrificación ha suplantado rápidamente las prácticas convencionales de congelación. En gran medida, esto era debido al desarrollo de dispositivos de vitrificación especializados. Algunos de estos dispositivos han perjudicado la seguridad general, la eficiencia y la eficacia de la vitrificación clínica mediante la introducción de defectos inherentes de diseño para dispositivos utilizados en la industria de la fertilización in vitro ^11. De hecho, los matices de los diferentes dispositivos de introducir una variación significativa entre los programas técnicos, comúnmente conocida como "firmas técnicas" ^12. De este modo, revistas científicas, como el Diario de experimentos visualizados (JoVE), pueden servir como un recurso valioso para la demostración de los detalles técnicos, lo que ayudará a reducir la variación del resultado. Otro problema es que s en cursoome embriólogos siguen siendo mal informado, incluso hoy en día, en base a las afirmaciones de que el "enfriamiento ultrarrápido de embriones u ovocitos en un 'sistema de vitrificación abierto" (es decir, el contacto embrión directa con nitrógeno líquido (LN ₂₎₎ es un requisito previo para la optimización las tasas de éxito ". Claramente, esta creencia es errónea, basada en el éxito probado de sistemas aséptica ^{13, 14, 15} cerrados.

Sobre la base de los principios criobiológicos de vitrificación, la eficacia de la vitrificación es más altamente dependiente de las tasas de calentamiento que en las tasas de ^{16, 17, 18} de refrigeración. En general, independiente del dispositivo de vitrificación utilizado, la tasa de calentamiento debe ser superior a la velocidad de enfriamiento para asegurar altas tasas de supervivencia. Altas tasas de calentamiento reducen al mínimo la posibilidad de cualquier crecimiento del hielo (es decir, la recrystallization de impurezas nucleadas en la crio-solutions) durante la fase de calentamiento de la desvitrificación. Por supuesto, la estabilidad de la solución de vitrificación (es decir, el tipo y la concentración de agentes crioprotectores utilizados) puede tener un efecto de confusión, pero esto se abordan en una publicación separada ^11. Teniendo en cuenta los problemas de las tasas de calentamiento experimenta enfriamiento, MicroSecure de vitrificación (mS-VTF) fue desarrollado en 2008 como un método barato, no comercial, compatible con la FDA que optimiza los aspectos de control de calidad de la vitrificación. Era único en que se ofreció a prueba de falsificaciones, interiorizado, el etiquetado de dos colores. Por otra parte, por la carga y el almacenamiento de los embriones directamente en el flexipette estéril utilizado para el pipeteado (es decir, sin la pipeta a una superficie del dispositivo secundario) y mediante el uso de pajitas de ionómero de resina que sellan completamente de soldadura utilizando un sellador automatizado, variante técnica se ha eliminado efectivamente.

Al evaluar la completeness de dispositivos de vitrificación para su posible uso, hay varios factores de control de calidad que se deben tener en cuenta, entre ellos: 1) marcar posibles etiquetas -Se puede adherir de forma segura? Están a prueba de manipulaciones? ¿Ofrecen el potencial de identificación de dos colores? ¿Es necesaria una etiqueta secundaria, y la etiqueta se puede quitar fácilmente para fines de mantenimiento de registros (es decir, la verificación del paciente) post-calentamiento? 2) facilidad técnica embriones -Se puede cargar fácilmente en / sobre el dispositivo de una manera oportuna y simplemente identificados y rastreados post-calentamiento? 3) simplicidad de procedimiento / Repetibilidad -¿La método de vitrificación oferta simplicidad y fiabilidad que permite facilidad de repetibilidad, lo que minimiza la variación entre técnicos (internos) y programas (externos)? 4) ₂ LN capacidad de almacenamiento de los dispositivos -¿Puede ser manejado e identificado fácilmente y con seguridad? Sto es surabia espacio potencial eficiente? ¿Ofrece el dispositivo de seguridad y la seguridad de cualquier daño físico o posibles contaminantes como un sistema cerrado aséptico? 5) el potencial de recuperación / Supervivencia -Es el diseño de dispositivos propensos a problemas potenciales en la recuperación garantizada de embriones, y van a vitrificar fiable y mantener la integridad celular post-calentamiento completa? La última preocupación específica a la calidad, la tasa de recuperación, ha sido realmente sorprendente minimizado en los informes publicados; esto se hace por lo general que oculta el resultado desfavorable (es decir, embrión perdido o huevo) en típicamente buenas tasas de supervivencia. Cualquier dispositivo propensos a la recuperación inconsistente (<99%) es seriamente defectuoso y constituye un pasivo de procedimiento.

Nuestra aséptica, cerrado método mS-VTF ha sido diseñada estratégicamente para dar cuenta de cada medida de control de calidad. Sin embargo, después de 5 años de éxito clínico superior y ¹⁴ de validación, el procedimiento tenía tO sea modificado. Las pajas de embrión de 0,3 mL originales (que poseen un tapón hidrófobo) se retiraron de la industria de la fertilización in vitro y se sustituye con una paja semen 0,3 ml que posee un tapón de algodón / PVP estándar (es decir, re-etiquetado como semen / paja de embriones). En este documento se describen los pasos de procedimiento y estrategias específicas que se necesitan para poner en práctica mS-VTF de forma segura, sencilla y eficaz. Por otra parte, destacamos la modificación (s) que se necesita para tener en cuenta las limitaciones de suministro fiable de, hasta el momento en un contenedor de paja ideales alternativa se vuelve a introducir de nuevo en el laboratorio clínico.

Protocol

El desarrollo del procedimiento mS-VTF se llevó a cabo como parte de un estudio aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en 2008-2009 (Aspire IRB, Santee, CA) en ovocitos humanos y la criopreservación de embriones. El procedimiento ya se ha aplicado de forma rutinaria para el tratamiento clínico de pacientes con infertilidad que han firmado formularios de consentimiento informado.

1. Consideraciones de control de calidad

1. Utiliza colores diferentes (por ejemplo, bolígrafos, etiquetas, o de identificación (ID) varillas o conectores) para distinguir a los pacientes si criopreservar más de un grupo de embriones en un día.
2. Utilizar diferentes platos y pipetas para cada paciente. Reducir al mínimo el volumen de medio transferido al mover los blastocistos a partir de una solución a otra.
3. Criopreservar un blastocisto por pajuela o dispositivo. Mantenga una técnica aséptica / estéril y cumplir con todas las precauciones de seguridad.
4. Forma de Referencia confirmar el Physicians 'y firmado el consentimiento del paciente antes de initiating los procedimientos. Compruebe la disposición del embrión (s) de los pacientes en el inventario.
5. Use un "Liberación de Responsabilidad y Consentimiento para el Transporte" si los blastocistos son para ser transferido a otro centro. Asegúrese de que todas las firmas son testigos in situ o un notario.
6. Confirmar las medidas adecuadas de control de calidad para el medio y los suplementos de proteína, según el caso, incluyendo bioensayos, determinaciones de endotoxinas y expiración de la verificación / número de lote y de seguimiento.
7. Establecimiento de límites críticos (es decir, los bajos niveles de preocupación) para la monitorización clínica resultado criopreservación y evaluación, tales como las tasas de recuperación: <95%, las tasas de supervivencia: <80%, y las tasas de embarazo clínico utilizando blastocistos de un solo euploid: <50%.

2. Procedimiento de Criopreservación

1. Preparación
   1. Completar la documentación apropiada, incluyendo la introducción de datos en las hojas de trabajo y la base de datos de criopreservación y registro de inventario(S).
   2. Preparar soluciones de crioconservación frescas o utilizar una fuente comercial (cumpliendo con las condiciones de almacenamiento y tiempo de conservación recomendadas por el fabricante).
   3. preparación de paja.
      1. Abra el lado etiquetado de los paquetes estériles individualizados. Separar la boquilla de llenado que se encuentra en la tradicional paja embriones de 0,3 ml, sujetándola contra el envase y parcialmente levantar y tirar de la paja a cabo; esto va a exponer el extremo de la etiqueta a las condiciones ambientales, mientras que la paja se apoya de forma aséptica el interior del envase de plástico.
         1. (Modificación) para 0,3 ml de semen / embriones de pajas, empujar el tapón hacia abajo 0,5 cm. Aplicar una junta interna en frente del tapón de algodón-PVP mediante el uso de un sellador de impulso básico tablero de la mesa.
         2. Establecer la paja en la superficie de teflón del electrodo, justo en frente de la clavija. Presione la palanca para activar el calor. Suelte el mango cuando aparece la luz roja. Para asegurar un sellado de soldadura completa, calor a una temperatura que suficientemente flattens las superficies opuestas, y luego darle la vuelta 180 ° y vuelven a sellar la superficie opuesta ^19, según sea necesario.
   4. El uso de un cryomarker, etiquetar cada paja / dispositivo y cryogoblet con el nombre del paciente, un número de identificación único (por ejemplo, número de seguro social, fecha de nacimiento, o número de identificación del paciente), y la fecha de congelación. También incluya un número único en cada paja / dispositivo (por ejemplo, 1, 2, 3, etc.).
      1. Asegure la etiqueta (preferiblemente de color) en una barra de color ID ponderados para su inserción y sellado en una paja embriones de 0,3 ml. Devolver la paja para su embalaje individual estéril hasta su uso.
         Nota: Si sólo barras de ID de color ponderada 30 mm están disponibles, entonces se necesita la inserción adicional de dos rodamientos de bolas, adyacente a cada lado de la varilla de ID.
   5. Identificar cada caña con un número único de identificación inscritos. Identificar un número de tanque de almacenamiento de ₂ LN y un número recipiente donde muestra (s) de cada paciente puede ser stun OR a largo plazo.
   6. Preparar platos frescos crio (100 mm) de la superficie inferior etiquetado con el nombre del paciente, ID solución, y el embrión / celebración de Identificación de gotas (Figura 1A). En concreto, configurar 4 filas de gotas: medio tamponado con HEPES isotónicas (arriba), V1 (solución de equilibrado (ES)), V2 (solución intermedia (IS)), V3 (solución de vitrificación (VS); parte inferior). Escribe el ID de embriones en la parte superior derecha con columnas etiquetadas.
      Nota: Una serie de 25 a 50-l lavar gotitas (n = 3) se utiliza para asegurar que cada final individual de 10 a 15 l que sostiene la gotita tipo / solución (es decir, V1, V2, o V3) es puro y sin diluir. Con este enfoque, hasta cinco embriones individuales puede vitrificado por el uso de un solo plato. Mantenga cada plato cubierto cuando no esté en uso para evitar cualquier temperatura ambiente evaporación / deshidratación de las gotitas.
   7. Prepare flexipettes estériles mediante la reducción de 3 cm de su extremo de base (en adelante, "consejos VTF"). Insertarlos en personapipetas (ajustadas a 3 l) y fijar las puntas de pipeta-VTF en posición vertical en un bastidor de tubo de espuma de poliestireno (Figura 1B).
2. La selección de embriones
   1. Confirmar la identificación del paciente / muestra.
   2. El uso de un microscopio invertido (200 - 400 aumentos), grado y clasificar los blastocistos de acuerdo con el sistema de clasificación de Gardner ^20, utilizando una clasificación numérica de 1 a 6 para temprano para blastocistos eclosionados, respectivamente, y una A, B, o de grado C asignado a la masa celular interna (ICM) y trophectoderm (TE).
      Nota: En preparación para la biopsia de blastocisto y análisis euploidy, la zona pelúcida es pre-incubado por ablación con láser en el día 3 para promover la pronta herniación del TE y por lo tanto requiere una clasificación de clasificación ² modificado. En resumen, Grado 3 blastocistos completa exposición de hasta un 10% TE hernia, grado 4 se expandió blastocistos son 10 - tramado 50%, y el grado 5 blastocistos para incubar tienen> 50% TE extrusion (Figura 2A-C).
      Nota: Nuestra preferencia es para criopreservar grado 3 o superior blastocistos de calidad ≥BB en el día 5 o 6. Sin embargo, los blastocistos vitrificados de calidad inferior (C) y los embriones después de la compactación en las etapas anteriores (incluyendo fines de mórula al grado 1 o 2 blastocistos ) sin duda puede sobrevivir el calentamiento completamente intacta y producir embriones viables, capaces de conseguir nacidos vivos.
   3. Contraer el blastocele de cada blastocisto antes de la aparición del proceso de cryodilution por micropuncturing una unión trophectoderm o realizando una ablación de pulso de láser de una célula trophectodermal ²¹ si el uso de soluciones de vitrificación de baja molaridad (<6,5 M o 40% v / v).
      Nota: La necesidad de colapsar los blastocistos no es dependiente del dispositivo. En nuestro propio desarrollo temprano de mS-VTF (2008), que inicialmente se utilizó etilenglicol (EG) / soluciones de DMSO con éxito con ovocitos (1 de 1 embarazo a término), pero un sub-óptima (<80%)la supervivencia / desarrollo de blastocistos de ratón ¹⁶ fue experimentado por otras ²¹ personas. Ya que las altas soluciones molares basados ​​en glicerol (excediendo 7,9 M) se utilizan en nuestro sistema actual VTF (desde 2009), el colapso blastocele física es innecesaria. Sin embargo, la incubación selectiva de blastocistos eclosionados es aconsejable en general.
3. Cryodilution y blastocisto Cargando
   1. Retire la placa de cultivo de paciente de la incubadora y confirmar la identificación del paciente / muestra con otra persona (es decir, en presencia de una fuente secundaria) antes de extraer el embrión (s) a ser vitrificados.
   2. Confirmar el desarrollo de blastocistos por paso 2.2.2, actualización de la ficha de datos de la crio, y, bajo la microscopía estereoscópica, blastocisto (s) de la pipeta de la placa de cultivo en una gotita de retención isotónica del plato crio.
   3. Mover cada blastocisto en gotitas de sujeción individuales utilizando el flexipette vitrificación (es decir, la punta VTF).
   4. mover cadablastocisto en solución V1 (ES).
      1. Rellenar previamente el flexipette con solución V1 (3 l) y coloque la mitad del contenido en el embrión.
      2. Aspirar el embrión y pasar a la primera de las tres gotas de lavado (V1 se hace referencia en el paso 2.1.6), el embrión pipeta 2 - 3 veces alrededor del perímetro, y borrar el contenido de la pipeta en la gota (evitando la formación de burbujas) o en la superficie del plato.
   5. Llenar la punta VTF con la próxima caída de lavado V1 y repita la aspiración del embrión (s). Repetir una tercera vez y mover el blastocisto (s) a una gota de retención V1 individual. Los pasos de dilución / lavado deben tomar de 30 a 45 s. Precarga cada punta VTF con la siguiente solución (por ejemplo, V2), insertar la pipeta en un bastidor, y el uso de la siguiente pipeta (según la configuración del paso 2.1.7) (Figura 1B).
      Nota: Puesto que el tiempo total de exposición en sulfóxido no de dimetilo (DMSO) que contiene soluciones de V1 y V2 es 5 min cada uno, el pipeteado de indiviblastocistos duales deben ser escalonados de manera uniforme dentro de ese intervalo, teniendo en cuenta que la etapa V3 final requerirá al menos 1 min por blastocisto de realizar. Por ejemplo, si hay 4 blastocistos en un grupo de vitrificación, los blastocistos de pipeta # 1-2-3-4 a intervalos de 75 s.
      Nota: El protocolo de dilución innovador Cryo Enterprises (ICE) ha descrito anteriormente es claramente diferente de la mayoría de los otros procedimientos de vitrificación comercial, que generalmente implican soluciones que contienen DMSO. Esos protocolos de lograr las mismas diluciones paso a paso a través de un proceso gradual, pero menos controlados, la fusión de la solución de lavado (es decir, medio isotónico), ES, y VS.
   6. Repita los pasos 2.3.4 y 2.3.5 usando soluciones V2 (IS).
   7. Repita los pasos 2.3.4 y 2.3.5 usando soluciones V3 (VS).
   8. Al colocar cada blastocisto en el V3 que sostiene la gotita, desactive la solución residual y las burbujas de la punta VTF (fuera de la gota) y, a continuación, llenar por completo la punta con V3 limpia alrededor del embrión. ExpEL aproximadamente un tercio del volumen (1 l) y la pipeta del blastocisto (s) y restante V3 completamente en la punta VTF.
   9. Retire la punta de la pipeta VTF, limpie la punta seca de V3 residual sobre la superficie exterior mediante el uso de una almohadilla de gasa estéril e introduzca la punta de final por primera vez en el extremo abierto de la paja de pre-marcado. Un "punta seca" es fundamental para prevenir la adherencia posible paja interior.
   10. Invertir la paja (etiqueta hacia abajo), observe la punta en el tapón interno o sello, y sellar de forma segura el extremo abierto con 1 cm de espacio aéreo. Preferiblemente, utilice un dispositivo de cierre automático (por ejemplo, Syms I) para eliminar la variación técnica.
       Nota: La ventaja de utilizar pajitas que se componen de un plástico de resina de ionómero (por ejemplo, HSV o mS-VTF) es que el uso de cualquier cantidad de calor operado correctamente el dispositivo de sellado crea un sellado fiable "soldadura", como se indicó en el paso 2.1.3.1.
   11. Una vez sellados, hundir la paja cerrada directamente en LN ₂ en un stainlacero ess Dewar matraz y colocar la paja (s) en la copa abierta unida a la caña del paciente para su almacenamiento.
       Nota: Debido a que la paja mS-VTF utilizan 40 mm barras de identificación ponderados para compensar la flotabilidad de la paja lleno de aire, el uso de copas invertidas o crioviales vacíos para cubrir el espécimen (s) no se requiere a menos que el transporte está involucrado.
4. El calentamiento y la solución de Cryo-elución / dilución
   1. Forma confirmar el Physicians 'de Referencia sobre la fecha de la transferencia de embriones vitrificados, hora programada, y los detalles de embriones (número de descongelar / transferencia, el número de embriones a prueba específica si PGS, etc.).
   2. Preparar soluciones al calentamiento frescas (1,0 M de sacarosa solución madre) y / o el uso de una fuente comercial (se recomienda 1 semana-de 1 mes de vida útil una vez en uso, el almacenamiento de 4 ° C).
      1. Alícuota de 17,1 g de sacarosa en 50 mL frascos estériles la apertura inicial (por ejemplo, fuente de suministro semanal) debido a los riesgos de acumulación de endotoxina en gra sacarosanules tras la exposición repetida ambiente.
      2. Mezclar sacarosa granular previamente pesado en la solución (1,0 M de stock = 3,42 g / 10 ml de HEPES tamponada con fluido tubal humano [H-HTF]) y calentar la solución hasta 37 ° C para aumentar la solubilidad de los gránulos. Repetidamente invertir el recipiente para ayudar a acelerar y completar la mezcla final.
         Nota: Filtración (filtro de 0,22 micras-) realiza utilizando unidades de filtración con presión positiva se recomienda para soluciones viscosas (> 0,5 M sacarosa) o volúmenes altos. bombas de presión de la mano son suficientes y de bajo costo, mientras que una bomba eléctrica es ruidoso, provoca vibraciones, y simplemente no es necesario.
   3. Warm tubo (37 ° C) uno de 10 ml cada una de solución de sacarosa 1,0 M y H-medio HTF por paciente para mS-VTF uso baño de calentamiento.
   4. Preparar platos frescos descongelación (placa de 6 pocillos) mediante el etiquetado de la superficie cubierta con el nombre del paciente y los ID de solución.
      Nota: En este caso, hemos utilizado: (1) lavado de T1 (200 μ; L sin capa de aceite, (2) T1 (100 l) con 1 ml de aceite, (3) T2 (100 l) con aceite, (4) T3 (100 l) con aceite, (5) T4 (100 l) con aceite, y (6) medio tamponado con HEPES T5 / 200 l isotónicas con albúmina de 10% de suero humano (HSA) o 20% suero sustituto sin una capa de aceite. Aplicar una, T2 sacarosa universal de solución de bajada protocolo-T1 = 1.0 M = 0,5 M, T3 = 0,25 M, y T4 = 0,125 M-Si el hielo u otra fuente comercial no está disponible, tal como se propone para los embriones lento congeladas ²² . Además, tenga en cuenta que el lavado inicial T1 y T5 los equilibraciones finales se pueden realizar en 30 mm placas de Petri y el plato 4 pocillos usados ​​para los pasos 2-5 de arriba, que implica una capa de aceite.
   5. Descongelar embrión (s) único del paciente a la vez.
      1. Compruebe Formulario de recomendación de los médicos y confirmar el ciclo antes de calentar el número indicado (es decir, 1 o 2 blastocistos); evaluar la supervivencia / viabilidad probable mediante la observación de los cambios osmóticos (es decir, SHRinkage y rehidratación) y membranas intactas, y, si es cuestionable, póngase en contacto con el médico y / o paciente antes de calentar otra blastocisto.
   6. Confirmar la identificación del paciente / muestra con un compañero de trabajo (es decir, en presencia de una fuente secundaria).
   7. Coloque la caña de paciente en un matraz Dewar lleno de LN ₂ y aislar identificar la paja para ser calentado.
   8. Llevar el plato de dilución de 6 pocillos para el centro de la etapa de microscopio estereoscópico. La colocación de una placa de 60-mm Petri a un lado (es decir, en función de la izquierda o la preferencia de la derecha del técnico), añadir la sacarosa calentado (1,0 M) y soluciones de H-HTF para crear un calentamiento 0,5 M de sacarosa baño (descubierto).
      Nota: Los consejos de VTF se calientan sólo en 0,5 M soluciones de sacarosa como una garantía del control de calidad, para asegurar la retención de la viabilidad de los embriones en el raro caso de que un embrión es expulsado al rápido calentamiento ^22.
   9. Mantenga el sello de paja superior por encima del nivel de líquidopara confirmar la identidad, y luego agarrar y asegurar la paja debajo del tapón interno utilizando tijeras de Mayo (la punta VTF todavía debe ser sumergido en LN _2).
      1. Dé un toque firme las tijeras en el frasco de Dewar (un par de veces) para eliminar la punta VTF de la pared lateral interior de la paja como medida de precaución control de calidad; si la punta VTF es adherente, el golpeteo asegura que la base de la punta cae hasta el extremo sellado frente al extremo marcado, proporcionando de este modo un espacio de aire cerca del extremo del enchufe.
   10. Levante la paja con las tijeras en el aire ambiente en una posición horizontal (al lado o debajo de la superficie estereoscopio) y sujete el extremo no marcado (etiqueta en el lado derecho). Cortar la paja en el tapón interno o el sello y la levante por encima del plato baño de calentamiento. Verter la punta VTF en el baño de sacarosa tibia en un ángulo de 60 ° hasta que esté completamente extruido y ha sido calentado rápidamente (> 6.000 ° C / min); la base de la flexipette descansará por encima de la pared lateral plato.
       1. Permitir la TI VTFp para la caída libre en el baño. Golpear suavemente la superficie superior de la paja si la punta no emerge inmediatamente. Si sólo aparece forma parte, ayudar en la extrusión agarrando el eje de la flexipette con las tijeras o pinzas finas.
   11. Después de 5 - 10 s, sujete la base de la pipeta y se insertan en un dispositivo de pipeta desechable; un agujero en el bulbo actúa para liberar la presión en la inserción. Cubra el orificio de la bombilla con el dedo índice y apretar suavemente el bulbo para liberar el blastocisto vitrificado en el lavado T1 (# 1) mientras se visualiza mediante microscopía estereoscópica. Una vez confirmado, desactive la solución y las burbujas residuales V3 (VS) por presión positiva, evacuando el contenido en el centro, descarte pozo abandonado. Iniciar un temporizador de 5 minutos.
       Nota: Todas las etapas de dilución de sacarosa se llevan a cabo a temperatura ambiente (21 ± 2 ºC).
   12. Retire la punta de VTF y colocarlo en una pipeta. Continúe moviendo el embrión en T1 # 2 bajo aceite para el tiempo restante (aproximadamente 3 - 4 min).
       1. Si se requiere una segunda para la transferencia de blastocistos, calentar inmediatamente una segunda punta de paja y VTF (repitiendo los pasos 2.4.9 - 2.4.11) de un paciente antes de iniciar el paso 2.4.12. Mueva las dos blastocistos juntos por una elución mínimo en T1 (1,0 M sacarosa) de al menos 3 min.
   13. Pre-llenar el flexipette con la siguiente solución, y luego mover y diluir el blastocisto (s) en T2, T3 y T4 a intervalos de 3 min. Si la zona pelúcida no ha sido previamente sometida a ablación por láser (es decir, rayada), lo hacen en la T4. Coloque el plato en el escenario de un microscopio invertido y la imagen del embrión en un monitor de ordenador. Alinear la zona dentro de un círculo rojo designado y activar 2 o 3 impulsos de un láser de diodo (que comienza en el borde del espacio perivitelino y moviéndose hacia fuera) para crear una abertura ^{2, 19.}
   14. Equilibrar los blastocistos en T5 (es decir, medio isotónico) durante 5 min sobre una superficie caliente (37 ° C).
   15. Evaluar la supervivencia de los embriones inicial basada en la presencia predominante de las membranas celulares intactas con citoplasmas incluso, translúcido desprovistos de oscurecimiento pyknotic. Coloque el embrión (s) en cultivo durante 2 - 6 h antes de la transferencia de embriones, momento en el cual, el desarrollo del embrión / supervivencia debe ser re-evaluada y documentada.
       Nota: Si existe más de 1 blastocisto viable en el momento de la transferencia y el paciente opta por proceder con solamente 1 blastocisto, el blastocisto suplementario puede entonces ser con éxito re-vitrificados (rVTF) repitiendo los pasos 2.3.3 - 2.3.11. Tenemos varias nacidos vivos confirmados siguientes eventos rVTF individuales.
       Nota: rVTF se ha realizado experimentalmente hasta 5 veces sin un efecto significativo sobre la supervivencia / viabilidad de los blastocistos vitrificados humanos aneuploidía en una solución metaestable basado en glicerol.

Results

1.341 blastocistos vitrificados se calentaron entre 2012 y junio de 2014, y 1.341 embriones recuperados (100%), mientras que sobrevivieron 1.316 (98,1%). blastocistos biopsiados experimentaron sobre la supervivencia del 99,5%. Al transferir predominantemente individual, probado genéticamente, euploid, los embriones vitrificados, hemos sido capaces de alcanzar algunas de las tasas de implantación más altos y las tasas de nacimientos vivos en los EE.UU., independientemente de la edad (Figura 3) ^20, de acuerdo con recientes estadísticas nacionales notificadas por el Centro para el control de Enfermedades y la Sociedad de Reproducción Asistida (Tablas 1 y 2). La evaluación de una población de pacientes de buen pronóstico (menos de 35 años de edad) para los ciclos criopreservados por sí solos (Tabla 1), nuestro laboratorio ha superado la media nacional, tanto para las tasas de implantación (es decir, la eficiencia de un embrión para establecer un embarazo) y en última instancia en vivo las tasas de natalidad en más del 30%. Además, la validación / verificación inicial de nuestra paja de almacenamiento modificados a mediados de 2014 el uso de 70 con autorización de investigación, los blastocistos aneuploides re-vitrificados resultado una recuperación del 100% y el 100% de supervivencia.

Figura 1. Configuración MicroSecure VTF. El plato VTF (A) está montado con 3 filas distintas de soluciones de vitrificación, que utilizan 3 gotas de lavado antes de la colocación en distintas, las gotitas de retención numerados. Además, pipetas individuales con puntas VTF acortados (es decir, flexipettes ID 300-M) se fijan y se organizan en una gradilla de tubos de espuma de poliestireno (B), que se puede girar para uso ordenada. Tenga en cuenta que un conjunto de pipeteado bombilla micropipeta desechable representante está descansando en el bastidor de espuma de poliestireno. arget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Modificado de blastocistos Sistema de Calificaciones. Nuestro sistema de clasificación de blastocisto Gardner modificado da cuenta de la hernia inducida de células TE para facilitar biopsia de blastocisto. La modificación considera la eclosión prematura de blastocistos completos (A: Grado 3 = menos de 10% herniación) y blastocistos expandidos (B: Grado 4 = hasta 50% hernia), mientras que un blastocisto de eclosión (C) tiene más de 50% hernia ^16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Resultados del Embarazo comparativos. Durante un intervalo acumulado 1,5 años, los datos de embarazo fueron comparados para evaluar los efectos de la transferencia de blastocistos euploid calentado vitrificados-(n = 172 ciclos / 144 transferencias) en comparación con los ciclos no-PGS (n = 160 ciclos / 153 transferencias) que implican predominantemente fresco transfiere ^18. Para nuestros propósitos experimentales, estos datos revelan claramente que los blastocistos vitrificados biopsiados por el procedimiento mS-VTF mantienen su viabilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fuente de datos	# Ciclos	La media de embriones transferidos #	Implantación Precios (%)	Índices de nacimientos vivos (%)
Lab NB *	144	1.2	74.00%	74.50%
Promedio nacional	20423	1.7	39.60%	44.10%
* Los datos fueron promediados sobre la base del desempeño de 2014 del Condado de Orange Fertilidad, Sur Centro de Fertilidad de California y el Centro del Sur de California para las clínicas de Medicina Reproductiva utilizando el laboratorio de fertilidad Ovation actual (NB Lab), que fundó el procedimiento de vitrificación microSecure en 2008.

Tabla 1. Estadísticas 2014 CDC Assisted Reproductive. los datos de embarazo transferencia de embriones congelados de las mujeres menores de 35 años a partir de la presentación de informes de tres clínicas médicas utilizando nuestro laboratorio de NB en comparación con el promedio nacional de Estados Unidos 2013 de más de 450 clínicas de presentación de informes.

Promedios SART Nacionales
Clinic - Estado	Mujer	Mujer	Mujer	Mujer
	<35 años	35-37 años	38-40 años	41-42 años
SCCRM-CA *	63,1%	58,3%	40,6%	32,3%
CCRM-CO *	64,7%	61,5%	40,4%	32,2%
RMA-NJ *	63,2%	59,7%	34,6%	18,7%
Promedio nacional	48,6%	38,3%	24,3%	12,3%
Centro de California SCCRM-Sur para la medicina reproductiva; Centro de CCRM-Colorado por for Reproductive Medicine; y RMA-Reproductive Medicine Associates
* Estas clínicas líderes han implementado todas predominantemente ciclos de transferencia de embriones vitrificados, en asociación con el examen genético previo a la implantación, en su práctica estándar de la atención al paciente para optimizar el éxito de nacidos vivos por embrión trasplantado.

Tabla 2. 2014 las tasas acumuladas de nacidos vivos, según lo informado por la Sociedad de Reproducción Asistida (SART), de la Clínica de Fertilidad SCCRM utilizando nuestro laboratorio Ovación en Newport Beach, CA, en contraste con otros programas respetados, así como con el SART promedios nacionales.

Discussion

Hoy en día, existe una gran expectativa de lograr la supervivencia de blastocisto completa (> 95%) y alcanzar el éxito de la implantación similar a la de embriones frescos. Algunos grupos han sugerido que las tasas de nacidos vivos de los ciclos de transferencia de embriones vitrificados son quizás incluso más alto que los blastocistos frescos cuando el embrión intacto criopreservados se trasplanta en un útero sano, estimulado no hormonalmente. Nuestros datos indican claramente que la vitrificación mantiene de manera eficaz y fiable la viabilidad del embrión fresco. Además, hemos demostrado que nuestro aséptica, método cerrado, llamado MicroSecure vitrificación (mS-VTF), puede lograr un resultado óptimo comparable o superior a los estándares comerciales (es decir, sistemas de dispositivos abiertos) utilizados en la industria de la fertilización in vitro.

La variación se asocia con la repetibilidad técnica y fiabilidad entre las personas que utilizan una multitud de dispositivos / vitrificación métodos. A su vez, esto ha dado lugar a inconsistencies entre los programas de la aplicación de la vitrificación. Por lo tanto, no es sorprendente que la familiaridad dispositivo es un factor importante en cuanto a la aptitud del laboratorio y los resultados exitosos. Es este concepto de "firma técnica" ¹¹ que explica por qué la repetibilidad entre programas puede ser problemático. No sólo el desarrollo de más de una docena de dispositivos comerciales complican este fenómeno, se ha creado problemas de control de calidad. Afortunadamente, los sistemas cerrados de vitrificación, como mS-VTF, Rapid-I, y VitriSafe, ahora están demostrando ser igualmente eficaz para abrir los sistemas de dispositivos ^{12, 13, 14.}

MicroSecure VTF es una novela, técnica de vitrificación aséptica desarrollado con facilidad técnica, la fiabilidad y la crio-seguridad en mente. Mediante la combinación de la utilización de dos dispositivos aprobados previamente, compatible con la FDA, es un sistema de vitrificación no comercial wITH la ventaja de tener un bajo costo establecido, en contraste con los dispositivos especializados. Además, su único y prueba de manipulaciones sistema de etiquetado de dos colores interiorizado, así como numerosas otras ventajas de control de calidad, han hecho mS-VTF una atractiva opción global ^11. Como dispositivo de VTF no comercial, sin embargo, su aplicación generalizada de la industria está evolucionando lentamente. Sólo a través de la publicación continua de su seguridad, la seguridad y la eficacia clínica ganará mS-VTF utilización cada vez mayor.

En agosto de 2014, ante la imposibilidad de adquirir el original paja embriones de 0,3 ml fabricado con un tapón hidrófobo interno, no absorbe, hemos sido capaces de modificar de forma fiable el método mS-VTF. En resumen, las nuevas semen de 0,3 ml / pajuelas de embriones con sus tapones de algodón-PVP fueron adaptados de manera efectiva. Esto se consigue simplemente mediante la creación de un sello interno antes de que el tapón de algodón, evitando así el contacto y el líquido que absorbe laVTF punta de composición abierta (es decir, la flexipette que contiene el embrión o los huevos). Además, si las barras de identificación 40 mm no son accesibles, la cuestión de flotación asociado con las barras más ligeras 30 mm se puede contrapesos mediante dos rodamientos de bolas.

Estos pasos adicionales han hecho de la técnica ligeramente menos simple, pero todavía muy eficaz. Hoy en día, la economía y la eficacia son cada vez más importantes preocupaciones, como blastocistos biopsiados son típicamente vitrificados individualmente hasta su estado euploidy se confirma en un informe de la genética. Los blastocistos con una aneuploidía no viable confirmado normalmente se descartan, con el consentimiento del paciente, en cuestión de semanas. Por lo tanto, una mayoría (> 50%) de los dispositivos de VTF se descartan después de almacenamiento a corto plazo, provocando un costo anual escalada cuando se utilizan dispositivos comerciales. En general, mS-VTF es un procedimiento altamente eficaz, fiable y repetible para la criopreservación de blastocistos humanos. El superior de control de calidad de diseño securelY etiquetas y segura almacena los ovocitos / embriones al tiempo que elimina la falta de recuperación y optimizar la supervivencia post-calentamiento y la viabilidad, lo que justifica el uso del sistema como un enfoque universal a la vitrificación de embriones.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Caña de aluminio	IVM	XC055
Rodamientos de bolas, 3/32"	VXB.com	KIT15977	acero inoxidable
Pajita de semen/embriones CBS, 0,3 mL	CryoBioSystems	25292	color estéril individual
, varillas de identificación, 30 mm	ponderados	CryoBioSystems	019021-26
15 mL	Falcon	352099	cónicos
Tubos de cultivo, 10 mL	Falcon	352057
Cryosleeves	Napgene	5016-001
Filtro, 250 mL	Fisher Sci.	09-740-2A	0.22 y mu; m
Matraces de Cultivo de Tejidos 50 mL	Falcon	353014
Flexipettes, 300 μ m ID	Cocinero Med.	K-FPIP-1300-10BS-5	Estéril, 20/paquete
Pinza, grande	Miltex	6-30TC
Pinza, Astilla - fina	Miltex	17-305
Cáliz	IVM	PA003
Termosellador, SYMS 1	CryoBioSystems	16399	110 V o 220 V con adaptador
Medios tamponados Hepes	Life Global o	LGGH-100; 100  mL, o	almacenado a 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	H-HTF; 90126; 100 mL	con etiquetas AA no esenciales
, Cryo	GA International	CL-23T1	Varios colores
Tanque de nitrógeno líquido, 40  L	MVE o Taylor Warton	varios	almacenamiento de líquidos
LN2; Matraz Dewar, 0.5  L	Hampton Research	HR4-695	Acero inoxidable
6 pocillos Custer Platos	Biogenics	015/020	Plasticware por caja
Pipeta Bombilla, Micro Cap	Drummond	Fisher#13681451	Orificio en el ápice de la bombilla
Placas de Petri, 35 mm	Falcon	351006
Placas de Petri, 58 mm	Nunc
Placas de Petri, 100 mm	Puntas	de
Falcon, ART long	Fisher Sci.	02-707-80	10 - 100 μ L
Pipet Aid	Drummond o Falcon	varios	pipeteo recargables
, Stripper	Cooper Surgical	MXL3-STR
Pipetas, serológico 1  mL	Falcon	357521
Pipetas, Serológicas 2  mL	Falcon	357507
Pipetas, Serológicas 5  mL	Falcon	357543
Pipetas, Serológicas 10  mL	Falcon	357551
Tijeras, Quirúrgico Mayo	Miltex	5-SC-16
Microscopio estereoscópico	Nikon, Olympus, Leica	varias
almohadillas de gasa estériles, 4" x 4"	Kendall Healthcare	6939
Suero sintético	Life Global, o	LGPS-20; 20 mL, o	almacenado a 2 - 8 º C
	Irvine Scientific	SS-99193; 12 x 10 mL	compra lote de baja endotoxina
Sacarosa	Sigma Chemical Co.	#S9378	alícuota en 50  matraces mL, 1 año; 17,1 g/matraz + Medio a 50 mL; hace una solución de 1 M; Filtro con 0.22 y micro; m unidad
Temporizador	Nalgene	5016-001
Solución de descongelación	Innovative Cryo Enterprises	BL-TS (≤ 1.0 m sacarosa)	T1, T2, T3, T4; torado a 2 - 8 º C para ≤ 1 mes después de la apertura
de Vitrification Solution*,**	Innovative Cryo Enterprises	BL-VS (≥ 7.9 M [glicerol/EG])	V1, V2, V3; almacenado a 2 - 8 º C para ≤ 1 mes después de la apertura
* Los aditivos crioprotectores no permeables pueden incluir: sacarosa, ficoll e hialuronato de sodio
** Otras preparaciones comerciales suelen ser etilenglicol (EG)/dimetilsulfóxido (DMSO; 30% v/v; 4,8 M), pero podrían ser EG/propilenglicol (32% v/v; 5,2 M). Las soluciones mixtas se utilizan normalmente para reducir los problemas de criotoxicidad de una solución de molares altos. Las soluciones comerciales suelen incluir una solución ES y VS. La formulación de la preparación comercial suele ser propiedad de los propietarios.