La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

Resumen

Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.

Resumen

Los registros electrofisiológicos de células por medio de la técnica de patch clamp han permitido la identificación de los diferentes tipos neuronales basados ​​en patrones de descarga. La inclusión de biocitina / neurobiotin en el electrodo de registro permite la recuperación post-hoc de los detalles morfológicos, que son necesarios para determinar la arborización dendrítica y las regiones seleccionadas por los axones de las neuronas registradas. Sin embargo, dada la presencia de neuronas morfológicamente similares con las identidades y funciones neuroquímicas distintas, la tinción inmunohistoquímica de las proteínas de células de tipo específico es esencial para identificar definitivamente las neuronas. Para mantener la conectividad de la red, las secciones del cerebro para las grabaciones fisiológicas se preparan con un grosor de 300 micras o mayor. Sin embargo, este espesor a menudo dificulta el posprocesamiento inmunohistoquímico debido a problemas con la penetración de anticuerpos, lo que requiere la resección del tejido. Resección de las rebanadas es un arte difícil, a menudo Resulting en la pérdida de tejido y la morfología de las células de las que se obtuvo datos electrofisiológicos, haciendo que los datos inutilizable. Dado que la recuperación de la morfología limitaría la pérdida de datos y la guía en la selección de marcadores neuronales, hemos adoptado una estrategia de recuperación de la morfología celular primero, seguido de inmunotinción secundaria. Se introduce un enfoque práctico para biocitina llenando durante los registros fisiológicos y inmunotinción siguiente de serie para la recuperación de la morfología, seguido por el restaining de las secciones para determinar la identidad neuroquímico. Nos informan de que las secciones que estaban llenos de biocitina, fijadas con paraformaldehído (PFA), manchadas, y coverslipped se pueden quitar y restained con un segundo anticuerpo primario días posteriores. Este restaining consiste en la eliminación del cubreobjetos, el lavado de las secciones en una solución tampón, y la incubación de los anticuerpos primarios y secundarios para revelar la identidad neuroquímico. El método es ventajoso para la eliminación de datuna pérdida debido a la imposibilidad de recuperar la morfología y de la reducción a los marcadores neuroquímicos a ensayar sobre la base de la morfología.

Introducción

El cerebro es conocida por la diversidad en las características estructurales y funcionales de sus elementos neuronales individuales. La comprensión de las funciones de los distintos tipos neuronales en la función cerebral y la patología requiere la caracterización e identificación inequívoca de las neuronas. Estructuralmente, las características morfológicas definidas por ubicación somato-dendrítica determinan las entradas potenciales que recibe una neurona determinada, mientras que el patrón de arborización axonal identifica posibles dianas postsinápticos. La diversidad estructural de las neuronas ha sido apreciado desde los días de los estudios histológicos seminales de Ramón y Cajal ^1. El advenimiento de las técnicas de grabación de una sola célula reveló que las neuronas estructuralmente distintas también muestran diferencias en los patrones de activación y características sinápticas. La diversidad en la estructura y la fisiología es particularmente evidente en las neuronas inhibidoras GABAérgicas ^2,3. Además, se ha vuelto cada vez más evidente que structurallY neuronas similares pueden expresar diferentes marcadores neuroquímicos y muestran diferencias funcionales correspondientes ^4. Del mismo modo, las neuronas con los mismos marcadores neuroquímicos pueden tener estructuras y funciones ^5-10 distintas. Por lo tanto, en la práctica, el análisis de las características funcionales de las neuronas y su papel en la red implica definir tanto las identidades morfológicas y neuroquímicas. Incluso con el advenimiento de reportero líneas de ratón dirigidos marcadores neuroquímicos específicos, a menudo es necesario para determinar la morfología y la identidad de subtipo basada en inmunohistología ^11.

El método estándar utilizado para caracterizar las células registradas en rodajas de cerebro agudas es llenarlos con biocitina o neurobiotin durante la grabación, fijar las secciones en paraformaldehído (PFA) siguiendo las grabaciones, y el uso de técnicas de inmunohistoquímica para revelar la morfología y la neuroquímica. Dado que el espesor de las secciones para la fisiología rebanada son típicamente 300 micraso más, y porque la mayoría de los anticuerpos no pueden penetrar todo el camino a través de esa profundidad, las rodajas deben ser re-seccionada a 60 micras o menos para permitir la inmunotinción simultánea para biocitina y marcadores neuroquímicos ^12-14. Desafortunadamente, resección es laborioso; corre el riesgo de pérdida de tejido durante el corte; y puede conducir a la diferencia de la contracción del tejido, lo que complica las reconstrucciones morfológicas. Además, el conocimiento previo de la morfología podría ayudar a reducir los marcadores candidatos que pueden ser expresadas por las células. Hemos modificado los protocolos inmunohistología biocitina estándar para permitir el procesamiento en serie de secciones en primer lugar para la recuperación de la morfología y luego para la identificación de posibles marcadores neuroquímicos.

La inmunohistoquímica es el estudio de la distribución de antígenos en tejidos o células y se puede visualizar usando una enzima, marcadores fluorescentes, elementos radiactivos, o partículas coloidales de oro ^15. El procedimiento involves usando anticuerpos primarios para etiquetar específicamente y amplificar uno o más antígenos específicos, seguido por el uso de anticuerpos secundarios fluorescentes dirigidos al anticuerpo primario para la visualización. Debido a la necesidad de distinguir los espectros de fluorescencia de cada anticuerpo secundario sin solapamiento, sólo un número limitado de antígenos puede ser examinado de forma simultánea. Por lo tanto, el conocimiento previo de la morfología puede ser útil en la selección de los marcadores neuroquímicos candidatos para la clasificación de células. Conceptualmente, la razón de ser de procesamiento en serie de secciones teñidas ya-se basa en la premisa de que immunolabeling para una proteína o péptido no debe interferir con la antigenicidad y la posterior inmunomarcación para un péptido estructuralmente independientes ^16. Esta falta de interferencia se debe a la unión de los anticuerpos a un epítopo de proteína específica en un antígeno y por lo tanto permite la tinción simultánea de múltiples antígenos en el mismo tejido. El número de antígenos revealed por inmunotinción está limitada por la necesidad de que los espectros de no acumulación de los anticuerpos secundarios fluorescentes y por la necesidad de dirigirse a antígenos individuales con anticuerpos en diferentes especies a fin de eliminar la reactividad cruzada ^17,18. Si bien este es el razonamiento detrás de etiquetado en serie en lugar de simultánea con dos anticuerpos distintos que pueden interactuar, a nuestro conocimiento, la inmunotinción para un segundo antígeno no ha sido reportado después de la finalización de inmunomarcaje para uno o más antígenos en secciones montadas. A continuación, se describe un método para la inmunotinción de serie de secciones previamente teñidos y montados. A pesar de que el detalle de este proceso para un procedimiento immunolabeling serie para la recuperación de la morfología seguido de tinción para los marcadores de proteína / péptido en secciones gruesas, los mismos procedimientos se pueden utilizar en la norma, las secciones histológicas delgadas también. Además, se describe un enfoque práctico para llenar neuronas registradas con biocitina y el proceso para desalojar elelectrodo de la célula tras la finalización de grabaciones para optimizar el llenado de la axonal y cenadores dendríticas de neuronas, tal como se presenta en nuestra reciente ^6,8 trabajo.

La ventaja más importante del procedimiento descrito aquí es que la morfología de la célula registrada puede ser totalmente recuperado y fotografiado antes de intentar la resección o immunostain las rebanadas. A pesar de los problemas con la penetración de ciertos anticuerpos pueden hacer necesario rebanadas de resección para inmunotinción secundaria, los procedimientos que se detallan aquí eliminarían la necesidad de reconstruir las neuronas complejas de múltiples secciones y evitarían problemas debido a la pérdida de tejido y contracción diferencial, lo que puede comprometer la reconstrucción tras resecciones. Una ventaja añadida es que el proceso va a reducir costes, tiempo, esfuerzo y anticuerpos costosos mediante la limitación de la inmunotinción y volver a seccionar a rodajas en el que se recuperan las neuronas biocitina llenas. El aspecto más práctico es el anuncioinmunotinción condicional que puede ser realizado en las secciones teñidas meses antes de usar la técnica antes mencionada. En particular, la recuperación de la morfología reduciría considerablemente el potencial de que los datos fisiológicos de las células se descarta debido a la incapacidad para obtener una caracterización morfológica básica del tipo de célula.

Protocolo

1. Provisión Biocitina durante Electrofisiología

NOTA: Los lectores pueden hacer referencia a fuentes alternativas para las técnicas básicas de patch-clamp de grabación y de instrumentación ^{19 a 22,} que no se elaboran a aquí. Los pasos que se detallan aquí suponen que el equipo y los procedimientos de patch-clamp grabaciones ya están establecidas, y la descripción se limitará a los detalles relacionados con biocitina-llenado y la inmunotinción post-hoc. Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron en ratas.

1. El uso de un vibratome, preparar secciones de cerebro en vivo de la región deseada en un espesor de 300 a 350 micras ^23.
2. Preparar una solución interna que contiene 0,2% biocitina mediante la adición de 2 mg de biocitina a 1 ml de solución interna ^6. Para obtener los mejores resultados, sonicar la solución interna durante 10 - 15 min hasta que el biocitina se disuelve por completo. A continuación, cargar la solución interna en una jeringa de 1 ml equipado con un 0,2 y# 160; micras de poro punta de filtro de tamaño de polipropileno unido a un microloader. Mantener esta jeringa de carga en una bolsa de hielo para mantener la estabilidad de la Mg-ATP y GTP-Na en la solución interna.
   NOTA: Un gluconato de potasio solución interna que contiene (126 mM K-gluconato, KCl 4 mM, HEPES 10 mM, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, y fosfocreatina 10 mM) es óptimo para la recuperación de ciertos marcadores neuroquímicos, incluyendo parvalbumin, durante inmunomarcaje. En nuestra experiencia, el uso de cesio y soluciones internas a base de cloruro reduce la capacidad de recuperar la inmunotinción para ciertos marcadores neuroquímicos. Neurobiotin o una, fijable, trazador polar de células impermeant la combinación de un fluoróforo Alexa con biocitina se pueden utilizar como una alternativa a la biocitina.
3. Bajo infrarrojos contraste de interferencia diferencial, visualizar la celda apropiada para la grabación. Para minimizar cualquier interrupción del axón, acercarse al cuerpo de la célula mediante la reducción de la pipeta a lo largo de su eje utilizando el "enfoque" función disponible en la mayoría de micromanipulador. Establecer registros de célula entera bajo diferencial de contraste de interferencia infrarroja usando protocolos fisiología patch-clamp ^19-22.
   NOTA: Evitar acercarse a la célula a partir de la dirección de la axón putativo, ya que cortar el axón, visualizada como una ampolla en el extremo cortado (flecha verde en la Figura 1). También, evitar la aplicación de alta presión positiva a la pipeta de grabación mientras se aproximaba a la célula para minimizar el derrame de biocitina, lo que resultará en alta tinción de fondo.

Figura 1. Plano sugeridos para acercarse a las células para Biocitina rellenos. La imagen ilustra una de células granulares (GC) llenar con biocitina durante la grabación que ha sido procesado para revelar biocitina (en rojo usando estreptavidina conjugada 594). La GC tiene sus dendritas orientadas en el plano XY. Observe el de células granulares rotoaxón (flecha verde) debido al movimiento de la pipeta a lo largo del plano XY. Tenga en cuenta que es ideal para acercarse a esta neurona a lo largo del plano XZ. Barra de escala: 50 micras.

4. En la configuración de fijación de voltaje, determinar la capacitancia de célula entera y la resistencia en serie en respuesta a pequeñas (5 mV), breves (30 ms) Tensión pasos usando el uso de la función de prueba de la membrana en el modo de baño en una adquisición de datos y software de análisis de electrofisiología. Esto asegurará que el establecimiento de condiciones de grabación de célula entera para permitir biocitina-llenado.
5. Llevar a cabo las grabaciones fisiológicas o bien al modo current- o de fijación de voltaje, según sea necesario. Un tiempo mínimo de grabación de> 10 min a 34 ° C es ideal.
   Se pueden necesitar más tiempo para los tiempos de grabación estudios llevados a cabo a temperatura ambiente: NOTA.
6. Al término de las grabaciones fisiológicas, re-establecer la configuración de patch-clamp moviendo lentamente la pipeta de grabación en pequeños pasos, alternando hacia arriba (a lo largo del eje Z) yhacia fuera (a lo largo del eje X) en el modo de fijación de voltaje.
7. Al mismo tiempo controlar la capacitancia y la resistencia de entrada utilizando la función "Prueba de membrana" para visualizar la pérdida de los transitorios capacitivos y el colapso de las respuestas actuales a una línea recta, lo que indica la re-sellado de la celda y el establecimiento de un fuera-fuera parche a la punta de la pipeta. La celebración de la célula a un potencial despolarizada (-40 mV) facilitará el proceso de re-sellado.
   NOTA: Este procedimiento para la eliminación de una célula normalmente asegura la recuperación completa del soma y dendritas. No aplique presión positiva a la pipeta de grabación durante este procedimiento o mientras se separa la célula de la pipeta. La visualización de la soma de la célula registrada en el corte indica la desconexión éxito. La presencia de restos celulares o un parche de membrana en el extremo de la punta individual normalmente indica la dislocación de la soma y no producir la morfología celular completa.
8. En popaer separar la pipeta de la célula, retener la rebanada en la cámara de grabación durante 3 - 5 min para asegurar el transporte del tinte a dendríticas distal y procesos axonales.
9. La transferencia de las rebanadas a una placa de 24 pocillos que contenía 4% PFA para la fijación.
   PRECAUCIÓN: PFA es cancerígeno, y equipo de protección personal, incluyendo guantes y una mascarilla, debe utilizarse para evitar la irritación de la piel y la inhalación. PFA es inflamable y debe mantenerse fuera del alcance de los incendios. PFA no se dispone en el desagüe y deben ser recogidos como basura química. fijación PFA debe ser aislado de las áreas utilizadas para la preparación rebanada vivo para evitar la contaminación de la configuración de la fisiología, incluyendo pipetas de transferencia.
10. 24 - 48 h después de la fijación de PFA, transferir las rebanadas de 0,1 buffer fosfato salino-M (PBS) para el almacenamiento antes de la inmunotinción.
    NOTA: Idealmente, biocitina recuperación y la inmunotinción son mejores cuando se lleva a cabo poco después de la fijación, aunque por tinción formado dentro de 7 d de los rendimientos de fijación buenos resultados. Las rebanadas se pueden mantener en PBS con 0,02 - 0,05% de azida de sodio para la tinción realizado hasta más de 90 días después de la fijación. Aunque la fijación durante la noche en PFA funciona bien para la mayoría de los anticuerpos, es posible que algunos anticuerpos funcionan mejor cuando se reduce la duración de la incubación en fijador. Fijación en PFA durante más de 48 h reduce la disponibilidad de antígenos y disminuye las posibilidades de éxito inmunotinción secundaria para los marcadores neuroquímicos.
    PRECAUCIÓN: La azida sódica es extremadamente peligroso e irritante al contacto con la piel o los ojos o con la ingestión o inhalación. Una severa sobre exposición puede causar la muerte. La carcinogenicidad y mutagenicidad del compuesto no se conocen. Utilice equipo de protección personal apropiado incluyendo guantes, gafas protectoras contra salpicaduras, una bata de laboratorio, y un respirador para polvo. azida de sodio no se dispone en el desagüe y deben ser recogidos como basura química.

e_title "> 2. La tinción de la Primera anticuerpo primario y Biocitina

(Día 1)
NOTA: El siguiente procedimiento es para la inmunotinción libre flotación secciones y requiere agitación continua a una velocidad baja (2 revoluciones / minuto, rpm) en un agitador durante todas las etapas de incubación.

1. Lavar el tejido 3x durante 10 min cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
   NOTA: 0,1 M de PBS se puede adquirir en el comercio o en el laboratorio de la siguiente manera (hace 1 L): 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na ₂ HPO _4, y 0,24 g de KH ₂ PO ₄ en 1 l de dH ₂ 0.
   NOTA: Si se conoce el marcador neuroquímico se desea, la tinción de una proteína / péptido puede realizarse simultáneamente con la tinción de biocitina (pasos 2.2 hasta 2.4). Si la tinción de biocitina solamente, continúe en el paso 2.5.
2. OPCIONAL: Bloque con 10% suero de bloqueo (BS; suero normal de cabra (NGS) diluido en 0,3% de Triton X-100 en PBS durante 1 h a TA).
   NOTA: Cada pocillo deberecibir el mismo volumen de la solución; el volumen recomendado es de entre 250 a 500 l / pocillo. La selección del suero de bloqueo se basa en las especies en las que se crían los anticuerpos secundarios (por ejemplo, NGS se utiliza para anti-cabra conjugado de tinte (especie de anticuerpo primario respectivos)). Si surge la necesidad de utilizar anticuerpos secundarios levantados en diferentes especies a inmunotinción secciones, incluir 10% de cada suero normal en el bloqueo de la etapa (2) y 3% de cada suero normal para los pasos de incubación de anticuerpo primario y secundario.
3. (OPCIONAL) Se incuban las secciones en anticuerpo primario, CB ₁ R (policlonal, conejillo de indias) con 0,3% Triton X-100, y 3% BS en 0,1 M PBS a temperatura ambiente O / N. CB ₁ R se utiliza para identificar cannabinoide tipo de receptor 1 de expresión.
   NOTA: Este paso es opcional y no es necesaria para revelar el relleno biocitina. La Figura 2 ilustra una sección etiquetada para biocitina y CB ₁ R durante el primer proceso de tinción. O / N incubación a temperatura ambiente es suficiente para la mayoría de los anticuerpos primarios; sin embargo, ciertos anticuerpos primarios, incluyendo CB ₁ R, requieren 3-5 días de incubación. Si la incubación tiene que ser más largo que 1 d, se recomienda incubar a 4 ° C porque Triton X-100 puede permeabilizar rebanadas y puede conducir a la desintegración del tejido durante la incubación prolongada a temperatura ambiente. Incluir un control negativo que carece de anticuerpo primario en al menos una sección para cada serie de experimentos como un control para la especificidad del anticuerpo secundario. Para los controles negativos, se omite el anticuerpo primario, sino que se añaden el 0,3% de Triton X-100 en PBS 0,1 M y BS.

Figura 2. El éxito de CCK tinción 1 semana después de la recuperación de Biocitina tinción y C annabinoid receptor tipo 1 _(CB1 R) - etiquetado. (A - C) Las imágenes confocales en 60X que muestran la neurona biocitina lleno (A) y CB ₁ R inmunorreactividad (B), indicado por la punta de flecha. En la misma sección se procesó para inmunotinción CCK después de 1 semana (C). La superposición de imágenes se muestra en D. CCK inmunoreactividad se reveló usando el rojo lejano y era de color seudo-en cian. (E) la reconstrucción morfológica de la célula biocitina lleno en A. Obsérvese que la biocitina y CB ₁ R tinción son evidentes incluso después de la segunda inmunotinción CCK. También tenga en cuenta la distribución esperada de CB ₁ R y patrones de inmunotinción CCK. (F - H) imagen ampliada del axón de la célula, como en A, espectáculo de cierre co-localización de biocitina y CB ₁ R en los axones (puntas de flecha). Barra de escala: 50 m (A - D), 100 micras (E), y 10 micras ( et al. 2015 ^9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

(Dia 2)

4. Lavar el cerebro secciones 3 veces durante 10 minutos cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
5. Incubar las secciones de estreptavidina conjugada colorante rojo (concentración: 1: 1000; de excitación: 594 nm con la emisión en el espectro rojo visible) con 0,3% Triton X-100 y 3% BS en 0,1 M PBS a 4 ° CO / N en el oscuro (envuelto en papel de aluminio) para revelar la biocitina. OPCIONAL: Incluir un anticuerpo secundario, de cabra anti-cobaya (concentración: 1: 500; de excitación: 488 nm y emisión en verde), con la incubación anterior, si después de la incubación primaria opcional en el paso 2.3.
   Se necesitará Anticuerpo secundario sólo si se lleva a cabo la tinción con el anticuerpo primario opcional (paso 2.3): NOTA. Para visualizar biocitina, un streSe recomienda conjugado ptavidin-fluoróforo con un espectro de emisión en rojo, ya que ayuda a visualizar los axones finos en detalle y con un mejor contraste (Figuras 1 - 3). Durante la inmunotinción doble o triple, a fin de evitar la reactividad cruzada de anticuerpos secundarios entre sí, añadir anticuerpos secundarios, uno tras otro de una manera en serie (2 intervalo h entre las adiciones de serie de los anticuerpos es suficiente). La Figura 3A ilustra una célula biocitina lleno de procesado sin la tinción de anticuerpo primario opcional y la imagen antes de la resección.

Figura 3. En segundo lugar inmunotinción con éxito después de la recuperación de Biocitina Morfología y resección. (A1) Confocal imagen de una sección 300 micras que muestra la recuperación de la morfología dendrítica de una célula biocitina-llenado. ( A2) rastros voltaje de la membrana de la neurona en respuesta a +500 y -100 pA inyecciones actuales. (B) La recuperación del soma biocitina lleno en una sección de 50 micras obtenida después de la resección de la sección 300 micras (en A1) después del montaje y de imagen. (B2) inmunotinción posterior de la sección delgada reveló colocalización de la soma biocitina lleno (panel derecho) con CCK (panel medio). La imagen resultante de la fusión se ilustra en el panel derecho. Barra de escala: 50 micras. Grupo A2 se reproduce con permiso de Yu et al. , En prensa ^25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

(Día 3)

6. secciones de cerebro Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
7. Para proteger la fluorescencia y para facilitar la re-tinción en el futuro, montar el secciones en un medio de montaje de base acuosa y sellar los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
   NOTA: Es mejor restain secciones tan pronto como sea posible para evitar dificultades en la eliminación del esmalte de uñas de la diapositiva, la infestación de moho, y la deshidratación del tejido debido a la fuga de la solución de montaje del portaobjetos de vidrio. La contaminación microbiana se puede prevenir mediante el uso de azida de sodio 0,02% en PBS.
   PRECAUCIÓN: La azida de sodio es altamente tóxico e inflamable cuando se encuentra en contacto con el agua. Por favor refiérase a los procedimientos operativos estándar para la manipulación y eliminación de productos químicos peligrosos.
   (Días 4 - 7)
8. Realizar imagen confocal con excitación a 594 y 488 nm y con un aumento de 20X o 40X para revelar las neuronas biocitina lleno en los marcadores rojos y neuroquímicos (CB ₁ R) en verde. Evaluar colabeling (Figura 2).
9. Ajuste la exposición de la cámara a menos de 100 ms para evitar photobleaching y obtaen pilas de imágenes confocal de las glorietas axonales y dendríticas de toda la neurona. Use pilas de imágenes confocal y rastreo de paquetes de software de neuronas para reconstruir la morfología neuronal.

3. La tinción de la Segunda anticuerpo primario

NOTA: Mientras que la segunda etapa se puede realizar la inmunotinción 90 d después de la primera tinción, se consigue tinción óptima si la segunda tinción con anticuerpo primario se realiza plazo de 7 - 10 d.

(Después del 7 - 90 días)

1. Aplicar acetona para un hisopo de algodón y pelar el esmalte de uñas fuera de la lámina de vidrio.
2. Quitar el cubreobjetos con cuidado con unas pinzas de punta fina y poner unas gotas de PBS 0,1 M en las secciones.
3. Retirar con cuidado las secciones de la lámina usando un pincel fino y lavar en PBS 0,1 M durante 24 - 48 h en un agitador cubierto de papel de aluminio en condiciones de poca luz a 4 ^° C.
   NOTA: Es fundamental para cubrir las secciones con unapapel de aluminio para evitar luminum photobleaching.
4. Para asegurar la eliminación completa del medio de montaje, lavar las secciones 1 - 2x en el día siguiente en 0,1 M PBS durante 10 min cada uno.
5. Proceder con la incubación en el segundo anticuerpo primario (por ejemplo, la colecistoquinina, un neuropéptido que se encuentra en ciertos interneuronas GABAérgicas (CCK; concentración: 1: 1000; anticuerpo monoclonal de ratón)) para 1 d (Figura 2).
   NOTA: Este procedimiento es similar a la etapa 2.3, pero utiliza un anticuerpo diferente. Además, la etapa de bloqueo se omite durante la re-tinción.
6. Se lavan las secciones del cerebro tres veces durante 10 min cada uno en 0,1 M PBS (pH = 7,4).
7. La mancha con el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón fluoróforo conjugado (concentración: 1: 500; de excitación de longitud de onda: 647 nm), asegurándose de que el espectro de emisión de excitación del anticuerpo secundario no se solapan con estreptavidina (concentración: 1: 1000; longitud de onda de excitación: 594 nm) e inmunofluorescencia antesmanchas.
8. Montar las secciones en medio de montaje acuoso y sellar los bordes de la hoja de la cubierta con esmalte de uñas transparente.
   NOTA: Guarde las secciones a 4 ° C en una caja de almacenamiento opaca para proteger la fluorescencia.

Resultados

Al completar con éxito, las secciones retienen el relleno biocitina y la immunolabeling realizan en el paso 2 y se pueden obtener imágenes utilizando confocal o microscopía de epifluorescencia. Además, las secciones procesadas también mostrarán inmunotinción para el antígeno marcado durante el procesamiento posterior en el paso 3. En la sección ilustrada en la Figura 2, la morfología de una neurona biocitina lleno en una sección gruesa (300 micras) se reveló usando estre...

Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Llenar la celda parcheado con biocitina es el paso más importante para garantizar la recuperación completa de la morfología. Para la recuperación total de la célula, es esencial para seleccionar una orientación óptima rebanada para minimizar la ruptura de los procesos durante el rebanado. Esta orientación puede variar en función del tipo de circuito y de la célula bajo examen. A continuación, es esencial para permitir un tiempo adecuad...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Sigma	S7653	Inmunotinción
KCl	Fluka	60129	Inmunotinción
Na2HPO4	Sigma	S7907	Inmunotinción
KH2PO4	Sigma	229806	Inmunotinción
Triton X-100	Sigma	T8787	Inmunotinción
para conejillos de indias anti CB1	Sigma	Af530-1	Inmunotinción
para ratones anti CCK	CURE, UCLA	cortesía de G. Ohning	Inmunotinción
Conejo anti parvalbúmina	Swant	PV27	Inmunotinción
Estreptavidina, Alexa Conjugado con flúor	Sondas moleculares	S11227	Inmunotinción
Suero normal de cabra (NGS)	Sigma	G9023	Inmunotinción
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Inmunotinción
Anticuerpos secundarios	Invitógeno Sondas moleculares	Alexa Colorantes conjugados con flúor	Inmunotinción Labnet
orbit agitador de baja velocidad	Bioexpress	S-2030-LS	Pinza de inmunotinción
	Dumont	11231-30	Inmunotinción
Carpetas de portaobjetos	EMS	71520	Inmunotinción
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Electrofisiología
Amplificador Multiclamp 700B	Dispositivos moleculares	Multiclamp 700B	Electrofisiología
pCLAMP 10 Software	Dispositivos moleculares	pCLAMP 10	electrofisiología
Digitalizador	Dispositivos Moleculares	Digidata 1440 Digitalizador	Electrofisiología
Puntas de filtro	Nalgene	171-0020	Electrofisiología
Sonicador	Fisher Scientific	15-335-100	Microcargadores de electrofisiología
	Eppendorf	930001007	Electrofisiología
Biocytin	Sigma	B4261	Electrofisiología