La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

Bogumila Swietek; Akshay Gupta; Archana Proddutur; Vijayalakshmi Santhakumar

doi:10.3791/54880

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Artículo de método

La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

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DOI:

10.3791/54880

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31 de diciembre de 2016

Bogumila Swietek¹ , Akshay Gupta² , Archana Proddutur² , Vijayalakshmi Santhakumar²

¹Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, ²Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.

Resumen

Los registros electrofisiológicos de células por medio de la técnica de patch clamp han permitido la identificación de los diferentes tipos neuronales basados en patrones de descarga. La inclusión de biocitina / neurobiotin en el electrodo de registro permite la recuperación post-hoc de los detalles morfológicos, que son necesarios para determinar la arborización dendrítica y las regiones seleccionadas por los axones de las neuronas registradas. Sin embargo, dada la presencia de neuronas morfológicamente similares con las identidades y funciones neuroquímicas distintas, la tinción inmunohistoquímica de las proteínas de células de tipo específico es esencial para identificar definitivamente las neuronas. Para mantener la conectividad de la red, las secciones del cerebro para las grabaciones fisiológicas se preparan con un grosor de 300 micras o mayor. Sin embargo, este espesor a menudo dificulta el posprocesamiento inmunohistoquímico debido a problemas con la penetración de anticuerpos, lo que requiere la resección del tejido. Resección de las rebanadas es un arte difícil, a menudo Resulting en la pérdida de tejido y la morfología de las células de las que se obtuvo datos electrofisiológicos, haciendo que los datos inutilizable. Dado que la recuperación de la morfología limitaría la pérdida de datos y la guía en la selección de marcadores neuronales, hemos adoptado una estrategia de recuperación de la morfología celular primero, seguido de inmunotinción secundaria. Se introduce un enfoque práctico para biocitina llenando durante los registros fisiológicos y inmunotinción siguiente de serie para la recuperación de la morfología, seguido por el restaining de las secciones para determinar la identidad neuroquímico. Nos informan de que las secciones que estaban llenos de biocitina, fijadas con paraformaldehído (PFA), manchadas, y coverslipped se pueden quitar y restained con un segundo anticuerpo primario días posteriores. Este restaining consiste en la eliminación del cubreobjetos, el lavado de las secciones en una solución tampón, y la incubación de los anticuerpos primarios y secundarios para revelar la identidad neuroquímico. El método es ventajoso para la eliminación de datuna pérdida debido a la imposibilidad de recuperar la morfología y de la reducción a los marcadores neuroquímicos a ensayar sobre la base de la morfología.

Introducción

El cerebro es conocida por la diversidad en las características estructurales y funcionales de sus elementos neuronales individuales. La comprensión de las funciones de los distintos tipos neuronales en la función cerebral y la patología requiere la caracterización e identificación inequívoca de las neuronas. Estructuralmente, las características morfológicas definidas por ubicación somato-dendrítica determinan las entradas potenciales que recibe una neurona determinada, mientras que el patrón de arborización axonal identifica posibles dianas postsinápticos. La diversidad estructural de las neuronas ha sido apreciado desde los días de los estudios histológicos semina....