La estimulación del nervio vago ha demostrado tener una gran eficacia para disminuir la inflamación periférica. Aquí, presentamos un protocolo modificado de estimulación del nervio vago que permite exámenes adicionales de los mecanismos antiinflamatorios colinérgicos en respuestas inflamatorias limitadas.
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Artículo de método
El aumento del tiempo de recuperación y la disminución de la administración de LPS para estudiar la estimulación del nervio vago mecanismos en las respuestas inflamatorias Limited
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Resumen
Resumen
La inflamación es una respuesta local a la infección y al daño tisular mediada por macrófagos activados, monocitos y otras células inmunitarias que liberan citocinas y otros mediadores de la inflamación. Durante mucho tiempo, los mecanismos humorales y celulares se han estudiado por su papel en la regulación de la respuesta inmunitaria, pero los avances recientes en el campo de la inmunología y la neurociencia también han desentrañado mecanismos neuronales específicos con un interesante potencial terapéutico. Se ha descrito que la llamada vía antiinflamatoria colinérgica (CAP) controla las respuestas inmunitarias innatas y la inflamación de una manera muy potente. A principios de la década de 2000, Tracey y sus colaboradores desarrollaron una técnica que estimula el nervio vago e imita el efecto de la vía. La metodología se basa en la estimulación eléctrica del nervio vago a baja tensión y frecuencia, con el fin de evitar cualquier efecto secundario de la sobreestimulación, como la desregulación de la variabilidad de la frecuencia cardíaca. En la actualidad se dispone de dispositivos eléctricos para la estimulación, lo que facilita la puesta en marcha de la metodología en el laboratorio. El objetivo de esta investigación fue investigar la posible implicación de las prostaglandinas en la NAC. Desafortunadamente, basándonos en intentos anteriores, no pudimos utilizar el protocolo original, ya que la respuesta inflamatoria inducida era demasiado alta o no era adecuada para las propiedades del metabolismo enzimático. Los diferentes ajustes del protocolo quirúrgico original permanecieron prácticamente sin cambios, pero las condiciones con respecto a la inducción inflamatoria y el momento antes del sacrificio mejoraron para adaptarse a nuestros propósitos (es decir, para investigar la participación de la NAC en respuestas inflamatorias más limitadas).
La versión modificada del protocolo original, presentada aquí, incluye un rango de tiempo más largo entre la estimulación del nervio vago y el análisis, lo que se asocia con una menor inducción de respuestas inflamatorias. Además, al mismo tiempo que disminuimos el nivel de lipopolisacáridos (LPS) para inyectar, también encontramos nuevas observaciones sobre las propiedades mecanicistas en el bazo.
Introducción
La inmunidad innata proporciona una primera línea inmediata de defensa contra las infecciones y enfermedades en una amplia gama de organismos. No sólo se inicia la respuesta inmune primaria para eliminar la amenaza, sino que también desempeña un papel fundamental en la activación y educar a la inmunidad adaptativa que lleva a cabo respuestas inmunes secundarias de una manera específica del patógeno. La inflamación está orquestada por una gran cantidad de citocinas y quimiocinas, que a su vez tienen la capacidad de atraer otras células inmunitarias al sitio de la infección y para inducir los signos cardinales de la inflamación, tales como enrojecimiento, hinchazón, dolor, pérdida de función, y la fiebre . La duración y la intensidad de la inflamación dependen de varios factores, pero la resolución de la inflamación y la restauración de la homeostasis es un paso crítico para evitar la aparición de enfermedades inflamatorias crónicas. Los recientes avances en el campo de la neurología y la inmunología han desentrañado los mecanismos neuronales específicos con un inmenso potencial terapéutico para controlar la inflinflamación tanto en el sistema nervioso central y en la periferia. Uno de estos mecanismos es la vía anti-inflamatorio colinérgico (CAP), también conocido como el reflejo inflamatorio, que es accionado por el sistema nervioso autónomo 4, 5.
Actualmente se cree que los mediadores inflamatorios activan los nervios sensoriales y envían señales sobre el estado de la inflamación en el sistema nervioso central. Una respuesta refleja se activa a continuación, a través del nervio vago eferente. Un extenso estudio sobre los detalles anatómicos de la PAC ha revelado un modelo parasimpático-simpático compuesto de dos nervios, el nervio vago y el nervio esplénico, respectivamente 6. En el PAC, el colinérgico nervio vago eferente activado termina en el ganglio celíaco-mesentérica, lo que resulta en la activación del nervio esplénico adrenérgico por un mecanismo aún no se ha explorado. El nervio esplénico, activado de este modo, se sabe que internaVate en estrecha proximidad a las células inmunes en la pulpa blanca, de la zona marginal, y la pulpa roja del bazo, el órgano principal y obligatoria de la PAC 7, 8. La norepinefrina (NE) a partir de las terminaciones nerviosas esplénicas se une a los correspondientes receptores adrenérgicos β 2 expresados en los linfocitos T esplénicas. Esto induce la liberación de colina acetil transferasa (ChAT) acetilcolina mediada (ACh), que a su vez activa los receptores nicotínicos de acetilcolina a7 (α7nACh) sobre los macrófagos, lo que limita la producción de citoquinas y la inflamación 2. En consecuencia, ahora está claro que el sistema nervioso es capaz de regular la inflamación en los tejidos periféricos y restaurar la homeostasis inmune local.
Como el nombre de la vía sugiere, el sistema de ACh es de importancia fundamental para el funcionamiento de esta vía de regulación neuro-inmune. Curiosamente, los mecanismos implicados en la activación dela PAC parece ser diferente en la periferia y en el sistema nervioso central. Si bien la importancia de los receptores nicotínicos (α7nAChR) en el bazo se ha demostrado anteriormente 9, los receptores muscarínicos (mAChR) son obligatorios para la activación central de la vía 10, 11. Más recientemente, la administración periférica de un agonista muscarínico M1 de acción central suprimió significativamente suero y tumorales bazo factor de necrosis α (TNF) durante la endotoxemia letal murino, una acción que requiere nervio vago intacto y el nervio esplénico de señalización 12. También hemos demostrado recientemente que los ratones que carecen de la prostaglandina E 2 (PGE 2) no fueron capaces de responder a la estimulación del nervio vago y no disminuye la liberación inducida por LPS de citoquinas en el suero y el bazo 3. Por lo tanto, la PAC también puede ser regulada por sistemas distintos de la principal pathw AChsí.
El nervio vago ha sido nombrado como tales debido a su curso errante en el cuerpo, que inervan los órganos principales incluyendo el hígado, pulmón, bazo, riñones, y el intestino 13. Teniendo en cuenta este gran inervación y el efecto inmunosupresor muy potente del nervio vago, el potencial terapéutico de la PAC podría cubrir un amplio rango de condiciones inflamatorias. El nervio vago puede ser eléctricamente (o mecánicamente) activado, con el control de la tensión y la frecuencia, y contrariamente al tratamiento convencional, sin fármacos añadidos al cuerpo. Actualmente se están realizando ensayos en pacientes reumáticos, por ejemplo, para probar la significación clínica de la estimulación del nervio vago en el tratamiento de la inflamación crónica 14. En total, la comunicación y la regulación de la inflamación neuro-inmune están actualmente bajo investigación, que proporcionará un tratamiento posible alternativa a la terapia convencional. Por lo tanto, el análisis de la estimulación del nervio vagon efecto en los diferentes órganos inervados, sino también la caracterización del potencial de acción terapéutica en modelos animales de inflamación crónica, sin duda dar ideas y la esperanza de nuevas dianas terapéuticas potenciales.
La metodología original desarrollado por Tracey y sus colegas 4 no podía aplicarse a nuestro campo de la investigación debido a la sobre-estimulación de la respuesta inflamatoria (por una dosis letal de LPS) y un intervalo de tiempo demasiado corto entre la activación de la PAC y de la lectura de salida. En el presente trabajo, presentaremos los cambios realizados en el protocolo original, comparar las dos metodologías diferentes en los niveles de citoquinas, y poner de relieve una nueva y opuesta de observación en el órgano diana (bazo).
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados por el Comité de Ética local en el Instituto Karolinska, Estocolmo. El Comité de Ética local sigue las directrices de la Unión Europea sobre el cuidado de los animales.
NOTA: Los principales cambios desde el protocolo original son el tiempo de recuperación después de la cirugía (6 hr frente a 1 hr) y el nivel de LPS inyectados (2 mg / kg frente a 15 mg / kg). De lo contrario, los diferentes ajustes relacionados con la cirugía en sí no se han cambiado.
1. Preparar el material para la estimulación
- Encender el ordenador y el sistema de adquisición de datos vinculados a la electrodo de estimulación (Figura 1A).
- Abra el programa de Reconocimiento.
- Preparar una solución madre de LPS a una concentración de 5 mg / ml en 1X PBS, alícuota, y almacenarlo a -20 ° C. En el día del experimento, descongelar una alícuota y preparar un ademuestra cuada de LPS (0,5 mg / ml) con el fin de inyectar alrededor de 100 l en el animal, de acuerdo con el peso.
2. Preparación del animal para la anestesia
- Utilice ratones C57BL / 6. Mantener ellos en condiciones de clima controlado con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad, alimentarlos comida estándar para roedores, y darles agua ad libitum.
- Realizar la cirugía en ratones que pesan alrededor de 25 g en el día del experimento.
Nota: Cuando se inducen reacciones inflamatorias, es particularmente importante para llevar a cabo revisiones regulares y observaciones de las reacciones clínicos en los animales. Se necesita la eutanasia prematura mediante inhalación de CO2 si la condición animal no cumple los criterios éticos. - Ajuste la máquina de anestesia.
- Asegúrese de que el tubo está conectado correctamente y no está dañado de alguna manera. Asegúrese de que el área de ventilación está funcionando correctamente. Conectar el filtro llave de la botella de isoflurano y llene el vaporizer con una cantidad suficiente de isoflurano.
- Abra el suministro de gas (aire y oxígeno) y asegúrese de que las botellas contienen suficiente gas para el experimento. Un conector de tres vías es entonces capaz de enviar el flujo de isoflurano a la cámara de inducción o la máscara.
- Gire el conector de tres vías a la cámara de inducción. Elige una ratón de la jaula hogar e insertar el animal en la cámara. Ajuste el regulador de flujo de 1,0 L / min de oxígeno y 1,0 L de aire / min. Ajustar la concentración de isoflurano al 4 - 5%.
- Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, Cuando se alcanza el nivel deseado de anestesia, afeitar el área quirúrgica y mover el animal de la cámara a la máscara. Gire el conector de tres vías para el flujo máscara. Ajuste el regulador de flujo de 0,25 L / min de oxígeno y 0.25 L de aire / min.
- Ajustar la concentración de isoflurano a 1.5 a 2.5%. Comprobar el nivel de anestesia por control reflejo y la frecuencia respiratoria antes de iniciar el procedur quirúrgicomi.
- Fije las patas del ratón al banco de trabajo utilizando cinta adhesiva. Asegúrese de que la nariz del animal está siendo cuidadosamente colocado en la máscara.
3. Cirugía y la estimulación del nervio vago
- Desinfectar el área quirúrgica con 70% de etanol.
- El uso de un escalpelo, incisión cuidadosamente la piel a nivel del cuello (incisión de alrededor de 1 a 1,5 cm).
Nota: En el protocolo, el procedimiento de cirugía termina aquí para los animales con operación simulada. De hecho, se ha demostrado que apenas tocando el nervio con una herramienta de metal ya que estimula, en cierta medida. Por lo tanto, para obtener un animal de control cirugía más precisa cuando se utiliza una pequeña cantidad de LPS, detener la cirugía en este paso. - Con la ayuda de un microscopio (objetivo 12,5X), aislar el nervio vago izquierdo desde la arteria carótida usando fórceps de disección. En primer lugar localizar el músculo esternocleidomastoideo mediante la eliminación de capas de la piel y la grasa, y luego retractarse enfin de poner las pinzas detrás de tanto nervio y la arteria.
Nota: El siguiente paso es muy complicado, ya que el nervio y la arteria están estrechamente adheridas entre sí. Por lo tanto, es muy fácil de cortar el vaso y matar al animal. Sin embargo, mediante la colocación de las pinzas con mucho cuidado entre el nervio y la arteria, con el tiempo se separan, y es posible aislar el nervio. - Coloque el electrodo (Figura 1B) bajo el nervio vago. El electrodo de aguja es bastante largo, por lo que incluso si el nervio se mueve ligeramente durante la estimulación, siempre estará en contacto con el electrodo.
- Realizar una inyección intraperitoneal (ip) de LPS (2 mg / kg) con la ayuda de una jeringa (para la lectura de salida en los niveles de citoquinas, es decir, para medir el efecto de regulación hacia abajo).
- Esperar 5 min antes de comenzar la estimulación.
- Estimular el nervio vago durante 5 min a 5 V y 1 Hz pulsando el botón de inicio en el programa Reconocer.
- Remover el electrodo y suturar la herida del animal con hilo de sutura quirúrgica.
- Rociar una Película Barrera No Irritante (PBNI) sobre la herida con el fin de mejorar la cicatrización y para protegerse de las infecciones.
4. Recuperación de los Animales
- Después de la cirugía, mover al animal a su jaula para despertar y recuperación. Bajo la luz de infrarrojos con el fin de mantener la temperatura corporal, asegúrese de controlar al animal hasta la plena conciencia se ha recuperado.
- Deje que el animal se recupere en su jaula durante 6 horas antes del sacrificio para el análisis.
Nota: El efecto de la estimulación del nervio vago es muy rápido y también se ha demostrado que ser de larga duración (hasta 48 h), por lo que el tiempo de recuperación puede ser establecido por el experimentador de acuerdo con las necesidades del estudio.
5. Sacrificio para su posterior análisis
- Colocar el animal en una jaula vinculado a un dispositivo de administración de CO 2.
- Permite configurar el dispositivo en un 5ciclo -min de inhalación de CO2.
- Cuando se realiza la eutanasia, recoger los órganos de interés y congelar directamente en hielo seco para análisis adicional (por ejemplo, la medición de los niveles de citoquinas en los extractos de bazo usando un TH1 ratón / TH2 ensayo 9-Plex) 3.
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Resultados
Nivel de TNF y la interleucina-1β (IL-1β) después de aumentar la Lapso de tiempo después de la cirugía y la disminución de la dosis de LPS
Como se indica anteriormente, utilizando el protocolo original, VNS disminuyó los niveles de TNFa (169,3 ± 24,9 pg / mg en SHAM frente a 39,7 ± 10,8 pg / mg en VNS, p <0,001) y la IL-1β (360,0 ± 40,21 pg / mg en SHAM frente a 191,7 ± 27,2 pg / mg en VNS, p <0,01) en el bazo después de la...
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Discusión
Desde su descubrimiento en la década de 2000, los mecanismos de la PAC han sido estudiados a fondo. Ahora tenemos una buena imagen de la vía y, en particular, el órgano diana, el bazo, donde NE, las células T de memoria, Ach, y macrófagos trabajo como un equipo muy eficiente para regular a la baja mediadores inflamatorios 2. También hemos publicado recientemente datos sobre la importancia de un sistema de prostaglandina funcional en ratones, en particular, PGE 2, que es obviamente un c...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, la Asociación Sueca de Reumatismo, las Fundaciones del Instituto Karolinska, el Consejo del Condado de Estocolmo, la Fundación Wallenberg y la Fundación GV 80 Años para la investigación. Los autores también desean agradecer a Hannah Aucott por la revisión del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Computadora | Toshiba-Cualquier | computadora es realmente compatible | |
| Sistema de adquisición de datos MP-150 | Sistemas Biopac | MP150WSW | |
| software de reconocimiento | Biopac Systems | ||
| Ratones C57Bl/6 | Charles River Máquina | ||
| Botella | de | ||
| oxígeno médico | AGA | 107563 | |
| Botella de aire medicinal | AGA | 108639 | |
| Vetflurano (1.000 mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Solución salina | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluido 10 veces para la concentración utilizada |
| Jeringa (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Agujas 23 G | KD-FINE | 0,6 x 30 mm (azul) | |
| Pinzas de microdisección (curvas) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Tijeras de disección | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Sutura quirúrgica 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Unidad de eutanasia | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon Película | de barrera antipicadurasEnsayo 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex, kit ultrasensible | MesoScale Discovery | K15013C-1 | |
| Dispositivo de electrodos estimulantes | Biopac Systems | STIMSOC | |
| Aesculap Aisis afeitadora | Agnthos | GT420 | |
| R70 | Dieta para roedores de Lantmannen, Estocolmo, Suecia |
Referencias
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