Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar Drosophila Comportamiento de las larvas de arrastre

Resumen

La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo.

Resumen

Drosophila rastreo de las larvas se está convirtiendo en un poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta sensoriomotriz. Sin embargo, el comportamiento de rastreo de larvas en las superficies planas abiertas es complejo, incluyendo: hacer una pausa, girando, y meandros. Esta complejidad en el repertorio de movimiento dificulta el análisis detallado de los acontecimientos que ocurren durante un solo ciclo de rastreo zancada. Para superar este obstáculo, se hicieron canales de agarosa lineales que limitan el comportamiento de las larvas al sostenida, arrastre de la recta, rítmica. En principio, porque los canales de agarosa y el cuerpo de la larva de Drosophila son tanto ópticamente transparente, el movimiento de las estructuras de larvas marcadas por las sondas fluorescentes codificadas genéticamente se puede controlar en, las larvas se mueven libremente intacta. En el pasado, las larvas se colocaron en canales lineales y arrastrándose a nivel de todo el organismo, segmento, y el músculo se analizaron ^1. En el futuro, las larvas que se arrastra en los canales se puede utilizar para imágenes de calcio para controlar neurola actividad final. Además, estos métodos se pueden utilizar con larvas de cualquier genotipo y con cualquier canal investigador-diseñado. Así, el protocolo se presenta a continuación es ampliamente aplicable para los estudios que utilizan la larva de Drosophila como un modelo para comprender el control motor.

Introducción

El objetivo general de este método es el estudio de Drosophila rastreo de larvas en detalle. Los experimentos sobre la locomoción han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías sobre el control del motor ^2. Tradicionalmente se ha estudiado la locomoción de los animales acuáticos (por ejemplo, sanguijuela, lamprea, renacuajo) ^3. La naturaleza repetitiva de la locomoción en estos animales ha permitido el estudio de rhythmogenesis, para el análisis de los eventos biofísicos locomoción de conducción, y para el seguimiento de los patrones de activación neural que acompañan a la locomoción.

El uso de las larvas de Drosophila para los estudios de locomoción presenta una combinación única de ventajas sobre otros sistemas de modelos: genética Facile, desarrollo bien caracterizado, un cuerpo que es ópticamente claro en estadios primero y segundo, y una reconstrucción microscópico electrónico de transmisión en curso de la entera ^4-6 sistema nervioso. Sin embargo, Drosophila larval locoel movimiento en superficies planas abiertas es algo complejo que incluye pausas, giros y meandros arrastra ^7. Esta publicación presenta un método para utilizar canales de agarosa lineales para guiar el comportamiento locomotor Drosophila larvas de tal manera que las larvas Realizar sostenida, el comportamiento de rastreo rítmica recta.

El estudio de comportamiento de las larvas de Drosophila en los canales de agarosa, en lugar de comportamiento en superficies planas abiertas, tiene varias ventajas. En primer lugar, permite a los investigadores para seleccionar específicamente el comportamiento de rastreo de los muchos movimientos que forman parte del repertorio del comportamiento de las larvas. En segundo lugar, mediante el ajuste de la anchura del canal en comparación con el tamaño del cuerpo de las larvas, la velocidad de rastreo se puede ajustar. En tercer lugar, los canales permiten la larva a ser vista desde dorsal, ventral, o en el lado lateral en función de cómo se carga el larva y orientada dentro del canal. Esta versatilidad en la orientación de las larvas permite que cualquier estructura de interés que estar continuamente visibles durante el rastreo. Cuarto,canales son susceptibles para su uso con una amplia variedad de microscopios y objetivos. Por ejemplo, los canales lineales pueden ser utilizados para formación de imágenes de baja resolución en estereoscopios de campo brillante y / o de imágenes de alta resolución en la hilatura de discos microscopios confocales ^1. En quinto lugar, este método se puede utilizar en combinación con manipulaciones neuronales optogenética / thermogenetic en cualquier fondo genético. Por último, debido a que tanto el cuerpo de las larvas (en estadios primera y segunda) y los canales de agarosa son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar en el estudio de los movimientos dinámicos, o cambios en la intensidad de fluorescencia de las estructuras de larvas etiquetados por sondas fluorescentes codificadas genéticamente.

El método descrito es apropiado para estudios detallados de cinemáticas primera y segunda instar Drosophila comportamiento de las larvas. Esta publicación analiza los cambios dinámicos en la intensidad fluorescente de la CNS durante el rastreo larval hacia adelante para demostrar el uso de los canales y como un precursor de neuRonal imágenes de calcio.

Protocolo

1. Preparación de las larvas

1. Una semana antes de grabar el comportamiento, configure una cruz (mínimo de 25 vírgenes y 5 machos). Mantener todos los cruces y la progenie a 25 ° C.
   NOTA: La temperatura de las condiciones de cultivo puede ser alterado, pero tendría que ser ajustado para tener en cuenta los cambios en la velocidad del desarrollo de la línea de tiempo se describe a continuación.
2. 5 días antes de la grabación, a primera hora de la mañana, colocar la cruz en una jaula de recogida con una cápsula de agar / jugo y un lenguado (0,5-1 ml) de pasta de levadura en el centro de la tapa de agar / jugo.
   1. Para hacer una jaula de recogida, hacer agujeros en un 6 oz. polietileno cuadrada botella de Drosophila.
   2. Para hacer que las tapas agar / jugo, mezclar 18 g de agar con 600 ml de agua en un matraz cónico. En un matraz de mezcla 20 g de sacarosa por separado con jugo de manzana 200 ml. Microondas hasta que los sólidos se disuelven. Combinar y agitar, permitiendo mezcla se enfríe a 60 ° C. Añadir 20 ml de 10% de metil-p-hidroxibenzoato de etanol al 95% y se agita. Añadir 7 ~ml a la media parte inferior de una placa de Petri redonda 35 x 10 mm. Permitir agar / jugo se solidifique durante 1 hora a RT. Almacenar a 4 ° C.
   3. Para hacer la pasta de levadura, añadir partes iguales por volumen de levadura seca y el agua. Almacenar a 4 ° C.
3. Comprobar el estado de las colecciones de larvas.
   1. Por la mañana, 4 y 3 días antes de la grabación, retire la tapa y coloque una tapa fresca en la jaula. Cambiar las tapas al mismo tiempo cada día para conseguir una colección de 24 horas de los huevos y larvas recién eclosionadas.
   2. Después se retira cada tapa, examinarlo para ver cuántos huevos la cruz está sentando. Esperar entre 500-2.000 huevos. Ajustar el número de adultos, si es necesario.
      NOTA: Algunas huevos deberían haber eclosionado en larvas, y las larvas recién nacida se encuentran lejos de la pasta de levadura.
   3. Envejecer cada tapa durante 24 horas. Volver a examinar la tapa para determinar si las larvas son saludables.
      NOTA: La mayoría de los huevos deben han eclosionado en larvas, y las larvas deberían haber metido en la ospasta de AST. Los signos de mala salud incluyen un gran número de huevos sin eclosionar, los cuerpos de larvas muertas de distancia de la pasta de levadura, y las larvas con importantes manchas oscuras en el abdomen, lo que indica una reacción inmune. Si las larvas no son saludables, cambiar la jaula, hacer tapas frescas / pasta de levadura, y comprobar el genotipo.
   4. Desechar las viejas tapas.
4. Recoger las larvas para las grabaciones de comportamiento.
   1. En ambos 2 y 1 día antes de la grabación, retire la tapa y reemplazar con una tapa fresca.
   2. Etiqueta de cada tapa retirada y mantener a 25 ° C. Esto producirá una serie de etapas de larvas para las grabaciones de comportamiento. Las larvas recién nacidas de (0-4 hr después de la eclosión) a través de segundo instar (24-48 hr después de la eclosión) se puede utilizar en los canales. Guarde los casquillos para las grabaciones en días consecutivos.
   3. Deseche todos los tapones después de 48 horas.
   4. Si es necesario, repita los pasos 1.4.1-1.4.3 para un máximo de 5 d adicional. Después de que menos producen huevos fertilizados.

2. Preparación de Canales

1. Preparar el PDMS canal lineal (polidimetilsiloxano, un elastómero de silicona) molde de fundición (Figura 1A). PDMS moldes de fundición están disponibles en el laboratorio de Heckscher bajo petición.
   1. Limpiar el molde de fundición con alcohol isopropílico. Deje secar al aire, séquelo con toallitas de laboratorio, o usar aire comprimido.
   2. Colocar el molde de colada en un Petri tapa 10 cm plato u otro recipiente.
2. Preparar y verter solución de agarosa.
   1. Hacer una solución 3% de agarosa en agua (3 g en 100 ml) en el microondas hasta que esté completamente disuelto.
   2. Enfriar a 55 ° C, lo que permite burbujas suban a la superficie.
   3. Verter la mezcla de agarosa en la placa de Petri que contiene el molde de colada de manera que el molde quede cubierto. Deje conjunto de agarosa hasta que se solidifique.
3. Quitar los canales de agarosa a partir del molde de fundición. Recortar los bordes del disco de agarosa con una hoja de afeitar.
   1. Ponga el canals en un plato de 10 cm Petri sumergido en agua. Se pueden conservar a 4 ° C durante 7 días.

3. Carga de una larva en un canal de Comportamiento Registro

NOTA: Si la memorización de canales a 4 ° C, permiten que los canales que alcanzara la temperatura ambiente antes de usar para la grabación del comportamiento.

1. Utilice una hoja de afeitar limpia para cortar un único canal de los preparado en la Etapa 2 (Figura 2A).
2. Use un par de pinzas para colocar el canal ranurado de lado sobre un cubreobjetos de vidrio (Figura 2B). El tamaño y el grosor del cubreobjetos depende del alcance específico utilizado para la imagen.
3. Utilice unas pinzas finas para seleccionar una larva de la tapa de agar / jugo preparado en el Paso 1 y el lugar en el canal de corte (Figura 2C).
   1. No apriete la larva. Recogerlo suavemente con la punta del diente fórceps. También es posible manipular larva con un pincel con una punta fina.
      NOTA: Esto es importante ya que las larvas son muy sensitive al tacto. Si no se manejan con cuidado, las respuestas nociceptivas pueden dominar su comportamiento durante los primeros segundos del experimento.
   2. Lavar las larvas sumergiendo brevemente en agua.
   3. Después de colocar la larva en el canal de corte, utilice la punta del diente fórceps para burlarse suavemente la larva en el bosque de canal.
      NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones de la anchura de la larva y la anchura del canal deben coincidir. La anchura media de larvas en diferentes etapas de desarrollo de la siguiente manera: 0 horas después de la eclosión - 140 micras, 24 horas después de la eclosión - 180 micras, 48 horas después de la eclosión - 320 micras, 72 horas después de la eclosión - 500 micras, 96 horas después de la eclosión - 750 micras ^8. Los canales vienen en los siguientes anchos: 100, 150, 200, 250, y 300 micras, y todos los canales son 150 micras de profundidad.
   4. Use la punta de un diente con fórceps o un pincel para ajustar la posición de la larva dentro del canal. Se puede orientarse en cualquier dirección: ventralarriba, abajo ventral, ventral a un lado, dependiendo de lo que es la estructura a explorar.
4. Con unas pinzas, mueva suavemente sobre el canal de tal manera que la larva se encuentra ahora en la cubierta de vidrio. Coloque una o dos gotas de agua en los extremos del canal para que se llena de agua (Figura 2D).
   1. levantar suavemente los lados del canal para eliminar las burbujas de aire.
   2. Ajustar la orientación de la larva. Para ello, empujar suavemente el canal pero no el vidrio de cubierta para rodar la larva. Si esto no cambia la orientación, retire la cubierta de vidrio y ajustar la posición de las larvas. La larva está listo para ser fotografiado.
   3. Image el canal / cubreobjetos en un microscopio invertido. Si las imágenes en un microscopio vertical, sólo tiene que invertir el canal / cubreobjetos.

4. Medir característica de interés en la grabación del Comportamiento

1. Para una estructura de interés (por ejemplo, cola, CNS), mida una característica de interés (por ejemplo,, La intensidad de fluorescencia, la ubicación) con el tiempo.
   NOTA: Estructuras tales como la cabeza y la cola se pueden anotar manualmente. Por ejemplo, la cabeza puede ser identificado como que contiene ganchos de la boca en forma de H oscuros, y la cola puede ser identificado como que contiene spiricles traqueal posterior. Este documento se centra en el cordón nervioso. Utilice la línea de GAL4 neuronal elav-GAL4 para conducir un transgén UAS-MYR-GFP (elav> GFP) ^9,10 para etiquetar de manera fluorescente del sistema nervioso central (SNC). El SNC contiene dos lóbulos del cerebro anterior conectado al cable de nervio, que se extiende a la parte posterior (Figura 3).
2. Medir la intensidad de los píxeles de la cordón nervioso (f _(NC)) en cada punto de tiempo (t). A continuación se describe un método manual de anotación, pero este paso podría ser automatizado.
   1. En Fiji (o software similar) en el menú "Analizar" utilizar el "conjunto Mediciones ..." cuadro de diálogo para informar el valor de gris medio y SLICposición e.
   2. Extraer manualmente una caja en el centro del cordón nervioso en el primer fotograma de la película (Figura 3). Este paso también podría automatizarse con segmentación de imágenes y algoritmos de registro.
   3. Utilice el comando "medida" en el menú "Analizar" para informar de la intensidad media de píxeles en la región en caja de interés. Esto genera una ventana "Resultados".
   4. En el siguiente cuadro, vuelva a colocar manualmente el cuadro sin cambiar el tamaño mediante el uso de las teclas de flecha. Utilice el comando "medida" de nuevo. Los resultados actualizados se muestran en la "Resultados" de la ventana. Repita este paso para cada trama de intereses.
   5. Guarde los "Resultados" utilizando la opción 'Guardar como ...' comando desde el menú Archivo. Los resultados se pueden exportar como un archivo .xls.

5. Analizar las mediciones

1. Normalizar cada f _(NC) valor a un valor entre 0 y 1 (z _(t) </ Em>).
   1. En la hoja de cálculo (u otro programa), abra el archivo Results.xls. Este archivo tendrá dos columnas que representan número de cuadro y la intensidad media de fluorescencia.
   2. Hacer una nueva columna y utilice la fórmula z _(t) = f _{(NC [t])} -min _{(f [NC])} / max _{(f [NC])} -min _{(f [NC])} para generar un valor de fluorescencia normalizada correspondiente a cada punto de tiempo.
2. Determinar el período de paso para cada paso en la grabación.
   NOTA: Un ciclo de zancada es la unidad de movimiento repetitivo de todo el cuerpo para adelante (y revertir) el rastreo. Por convención se inicia un delantero del paso grande (y termina) con el movimiento de avance de la cola, la cabeza, y otros órganos internos tales como el intestino o el sistema nervioso central ^1.
   1. Inspeccionar manualmente la grabación del comportamiento y registrar los tiempos de iniciación (i) de cada paso (i _{(Stride Ciclo [n])).}
      NOTA: En el siguiente ejemplo, el movimiento hacia adelantedel sistema nervioso central como se utilizó el inicio de un ciclo de paso (Figura 3).
   2. Por cada paso que calcular el periodo: Δ t _{(ciclo de zancada) =} i _{(Stride Ciclo [n + 1])} -i _{(Stride Ciclo [n]).}
3. Calcular el porcentaje de ciclo de zancada transcurrido para cada punto de la grabación del tiempo.
   1. Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el tiempo transcurrido desde el inicio de un ciclo de paso (c). Tiempo establecido desde el inicio paso a cero al inicio de cada paso (c _{(Stride Ciclo [n])} = 0). Ajuste veces después de la iniciación en consecuencia.
   2. Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el ciclo ciento zancada transcurrido (ciclo de zancada%) Dividir tiempos ajustados por el período de zancada y se multiplica por 100 para convertir a porcentaje de ciclo de zancada transcurrido:. Ciclo% zancada = (c _{(Stride Ciclo [n] ))} / (Δ t ₍Ciclo de zancada) * 100).

6. Generar coordenadas polares Parcelas para representar dinámica de las estructuras de interés durante el ciclo de rastreo

1. En MATLAB, utilice el diálogo "Importar datos" en la pestaña Inicio para importar el Results.xls actualizada.
2. Hacer una nueva matriz "Theta" valores del ciclo de zancada que contiene ciento (% ciclo de zancada). ( "Theta = Var1" donde Var1 representa ciclo de zancada%).
3. Hacer una nueva matriz "Rho" contiene los valores de fluorescencia normalizados (z _(t)). ( "Rho = Var2" donde Var2 representa z _(t)).
4. Utilice el comando 'PolarPlot' para hacer de coordenadas polares parcelas con el ciclo ciento zancada como el ángulo, y la fluorescencia como el radio ( "PolarPlot (Theta, Rho)").

Resultados

Este artículo describe un método para guiar el comportamiento de las larvas de Drosophila utilizando canales de agarosa y para medir la dinámica de estructuras de larvas en un ciclo de rastreo. Las larvas en los canales lineales realizar combates sostenidos de rastreo rítmica (Figura 3). Debido a que tanto las larvas y los canales son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar con larvas expresar sondas fluorescentes expresados ​​en cualquier estructura d...

Discusión

Un dispositivo de microfluidos se construyó para hacer canales de agarosa lineales que pueden alojar las larvas de Drosophila (Figura 1). Cuando las larvas de Drosophila se colocan en estos canales de agarosa lineales su repertorio de comportamiento se limita a rastreo, que permite la observación detallada de la dinámica de estructuras de larvas durante el ciclo de rastreo.

Una grabación exitosa ocurre cuando una larva de realizar una seri...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Botella cuadrada de Drosophila de 6 oz	Scimart	DR-103
agar	sigma	A1296
sacarosa	sigma	S9378
jugo			de manzana no concentrado
Tegosept	Fisher	T2300	metil-p-hidroxibenzoato
35 x 10 mm placa de Petri redonda	Fisher	351008
levadura
molde de fundición PDMS	FlowJem		se puede solicitar a los autores
Alcohol isopropílico	Fisher	A417-1
toallitas de laboratorio	Fisher	06-666-11
aire enlatado	Fisher	18-431
placa de Petri de 10 cm	BioPioneer	GS82-1473-001
agarosa	Fisher	50-444-176
de afeitar	pinza Fisher	12-640
FST		11241-40
22 x 40 cubreobjetos, #1.5	Fisher	50-365-605
Fiji (versión 1.51d)	NIH		fiji.sc
Excel 2016	Microsoft		www.microsoftstore.com
MATLAB R2016	Mathworks		www.mathworks.com