Artículo de método

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo

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DOI:

10.3791/54901

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29 de noviembre de 2016

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

Se presenta un método basado en la formación de imágenes de inmunofluorescencia para la localización espacial y temporal de ERK activa en la C. diseccionado gónadas elegans. El protocolo aquí descrito se puede adaptar para la visualización de cualquier señalización o la proteína estructural en la C. elegans gónada, proporciona un reactivo de anticuerpo adecuado está disponible.

Resumen

La señal extracelular conservado evolutivamente transducción vía RTK-RAS-ERK es un importante quinasa cascada de señalización que controla múltiples procesos celulares y de desarrollo, principalmente a través de la activación de ERK, la quinasa terminal de la vía. estrecha regulación de la actividad de ERK es esencial para el desarrollo normal y la homeostasis; ERK resultados excesivamente activos en la proliferación celular excesiva, mientras que baja actividad de ERK causa la muerte celular. C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance que ha ayudado a caracterizar la función y regulación de la vía de señalización RTK-RAS-ERK durante el desarrollo. En particular, la vía de RTK-RAS-ERK es esencial para C. elegans desarrollo de la línea germinal, que es el foco de este método. El uso de anticuerpos específicos para la forma activa, difosforilado de ERK (dpERK), el patrón de localización estereotipada puede visualizarse dentro de la línea germinal. Debido a que este patrón es tanto espacial como temporalmente controlled, la capacidad para someter a ensayo reproducible dpERK es útil para identificar reguladores de la ruta que afecta a la duración de la señal dpERK y la amplitud y el desarrollo tanto de la línea germinal. Aquí demostramos cómo diseccionar con éxito, las manchas y dpERK imagen dentro de la C. gónadas elegans. Este método se puede adaptar para la localización espacial de cualquier señalización o la proteína estructural en la C. elegans gónada, proporciona un anticuerpo compatible con inmunofluorescencia está disponible.

Introducción

El receptor de la tirosina quinasa (RTK) -rat Sarcoma (RAS) señal -Extracellular vía kinasa regulada (ERK) transmite las señales extracelulares a través de una cascada quinasa conservado que resulta en la fosforilación y activación de ERK 1-3. Proteínas ERK son miembros de la MAP conservada dirigidas por prolina serina / treonina (por mitógenos proteína activada) de la familia quinasa, y se activan directamente por MEK a través de fosforilación dual en la treonina (T) y tirosina (Y) del motivo TEY conservada. ERK activa (referido como difosforilado ERK, o dpERK) y luego regula muchos procesos celulares y de desarrollo a través de su fosforilación de una batería de sustratos aguas abajo 1-3. Por lo tanto la actividad de ERK anormal conduce a muchos teléfonos y defectos de desarrollo 4-7.

estricta regulación de la actividad de ERK es fundamental para el desarrollo normal: en los sistemas de mamíferos exceso de actividad de ERK conduce a la excesiva proliferación celular líderal crecimiento oncogénica; muy poca actividad conduce a la muerte celular 4,6. Además, los cambios en la duración de la actividad de ERK también pueden conducir a resultados distintos: en las células PC12, la activación de ERK por 30 min o menos induce la proliferación celular, pero la activación de ERK por 60 min o más induce la diferenciación neuronal 8,9. estrecha regulación de la actividad de ERK es, pues, sin duda esencial para el desarrollo normal y la homeostasis.

C. elegans es un modelo de sistema de gran alcance, y genéticamente maleable para diseccionar la función y regulación de la vía de señalización RTK-RAS-ERK 3,10-15. En relación con los sistemas de mamíferos, que contienen múltiples genes para RAS y ERK, C. elegans contiene un gen RAS (let-60) y un gen ERK (mpk - 1), lo que hace que un sistema genéticamente más fácil en el que para diseccionar la función de esta vía 3,10-14. El C. elegans línea germinal es esencialmente un tubo que consiste en mitóticoLas células en su extremo distal y ovocitos maduros en su extremo proximal (Figura 1) 16 de vástago. Las células germinales inician meiosis justo proximal a la zona mitótico distal, y el progreso a través de una profase meiótica extendida (pachytene), después de lo cual comienzan a formarse los ovocitos en la región del bucle, finalmente sometidos a maduración de los ovocitos en la región proximal 16.

Los estudios genéticos de varios laboratorios, incluyendo el nuestro, han demostrado que la vía RTK-RAS-ERK es esencial para el desarrollo de la línea germinal en C. elegans 12,13,15,17-19. Específicamente, encontramos que los controles de ERK y coordina al menos nueve procesos biológicos distintos durante el desarrollo de la línea germinal, que van desde los interruptores del desarrollo, tales como la apoptosis de células germinales a la celda procesos biológicos tales como 11,18 crecimiento de los ovocitos. Al igual que en los sistemas de mamíferos, el exceso de actividad de ERK en la C. elegans resultados de la línea germinal en la producción de múltiples ovocitos pequeños, mientras que muy liresultados de la actividad ttle en un ovocito grande 11. Por lo tanto la regulación estricta de dpERK es esencial para el desarrollo normal de la línea germinal. La forma activa de ERK, como se visualiza por un anticuerpo específico para dpERK, muestra una dinámica patrón estereotípico,, bimodal localización: dpERK es alta durante la mitad del paquiteno (Zona 1, Figura 1), bajo en la región de bucle y de alta de nuevo en madura ovocitos (Zona 2, Figura 1). Recientemente, hemos encontrado que la nutrición actúa a través del factor de crecimiento similar a la insulina-1 receptor (daf-2) para activar ERK en la Zona 1 12; trabajo anterior mostró que la señal de esperma (a través de la tirosina quinasa del receptor Efrina) activa ERK en la Zona 2 13.

Dado que las funciones de ERK activos como un reóstato en la línea germinal para regular el crecimiento de los ovocitos, localización espacial y temporal, así como la amplitud de dpERK, es clave para entender el resultado normal de señalización. Utilizando el método descrito aquí, los cambios en ellocalización estereotipada de dpERK se puede controlar con facilidad y predicciones deriva sobre el impacto de las perturbaciones ambientales o genéticas en la actividad de ERK y por lo tanto la función. Por lo tanto, el ensayo de dpERK permite una comprensión completa de su papel durante el desarrollo de la línea germinal.

Protocolo

El protocolo descrito aquí es principalmente para el sistema modelo de invertebrados C. elegans, y sigue todas las pautas éticas establecidas por la institución.

1. Mantenimiento de Animales

  1. Mantener C. elegans trabajando cultivos madre en medio de crecimiento de nematodos 20,21 (NGM, ver Tabla de Materiales) de agar sembradas con E. OP50 coli.
  2. Mantener las poblaciones de gusano a temperaturas entre 16 ° C y 25 ° C.
    NOTA: El cultivo de gusanos a temperaturas mayores resultados en la tasa de crecimiento más rápido, a menudo, el desarrollo de la línea germinal aberrante e inferior tamaños de cría. Además, los genotipos sensibles a la temperatura se mostrarán diferentes fenotipos a diferentes temperaturas.
  3. Transferencia de gusanos a nuevas placas de NGM cada 2 - 3 días en función de su tasa de crecimiento a fin de mantener un suministro constante de gusanos bien alimentados.
    NOTA: Para cualquier experimento dado que implica niveles dpERK, gusanos NO deben ser obtenidos a partir de un muerto de hambre o de la muchedumbreplaca ed. El hacinamiento o impactos de hambre señalización de la insulina en los gusanos 22, y la señalización de la insulina regula la actividad de ERK 12. Así gusanos de placas de inanición o de hacinamiento darán lugar a patrones de tinción variables y difíciles de reproducir.

2. La disección de los gusanos adultos para la obtención de las gónadas

  1. Escoja 100-150 WT (N2) o genotipo deseado de gusanos en la etapa de desarrollo deseado y específico (L1, L2, L3, L4, adultos, etc.) En 100 l de tampón de M9 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Llenar el tubo de microcentrífuga con 900 l de tampón M9 (véase la Tabla de Materiales). Centrifugar los tubos a 1.000 xg en una microcentrífuga durante 1 min a temperatura ambiente.
  3. Retire con cuidado 900 l del tampón M9 y desechar. Retire la memoria tampón bajo un microscopio de disección para asegurarse de que los gusanos no se eliminan accidentalmente.
  4. Repita los pasos 2.2 - 2.3 dos veces más con tampón M9 fresco cada vez.Esto asegura que cualquier bacteria que se llevaron de nuevo con los gusanos se lavan con eficacia de distancia.
  5. Después del lavado final eliminar 900 l de tampón M9 del tubo y de descarte.
  6. Transferir el 100 l de buffer restante M9 que contiene los 100 - 150 gusanos con una punta de 200 l-micropipeta a un plato de vidrio de reloj de fondo plano. Asegúrese de que la punta de la micropipeta se corta en la marca de 10 l antes de su uso. No corte la punta resultará en cizallamiento de los gusanos.
  7. Añadir 1 - 3 l de 0,1 M levamisol al plato reloj de cristal que contiene los gusanos en tampón M9. Hacer girar suavemente el levamisol y la M9 para permitir la mezcla incluso hasta que los gusanos dejan de moverse.
    NOTA: stocks Levamisol se puede almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Aquí, utilizar la mayor concentración de 1 - 3 mM de lo que se ha descrito en la literatura 23 de 0,2 a 0,25 mM de levamisol el fin de obtener una rápida pérdida de la movilidad en los animales. Si los animales Flay alrededor durante demasiado long en la suspensión líquida, los patrones resultantes de dpERK en las gónadas pueden ser variables (debido a la tensión o la falta de nutrición o ambos). patrones de tinción más reproducibles se han logrado con 1-3 levamisol mM para la disección.
  8. Adjuntar dos agujas de 25 G a dos jeringas de 1 ml (el tamaño de la jeringa no importa, el calibre de la aguja es crítico). Coloque una jeringa en cada mano (Figura 2).
  9. Bajo un microscopio de disección, la posición de cada aguja bajo y sobre cada gusano como se muestra en la Figura 2 y colocar un corte fino en el gusano cerca de la segunda bombilla de la faringe en un movimiento de tijera. Después de un corte en el gusano pasar a la siguiente animal hasta que todos los animales en el plato se han reducido al menos una vez.
    NOTA: tener en cuenta que los pasos 2.8 hasta 2.9 son sensibles al tiempo. Diseccionar todos los gusanos en el plato en menos de cinco minutos para un patrón dpERK reproducible. tiempos más largos de disección se traducirá en un desvío de la señal dpERK, especialmente en Zuno 1. Ajuste el número de gusanos por ronda de disección (es decir, 50 gusanos vs. 150) si es necesario para permanecer en el marco de tiempo asignado.
    1. En caso de que una de las gónadas extruido no es visible durante la disección, no intente otro corte en el mismo animal. Por lo general, eso sólo cizallar el animal y no dar lugar a la extrusión de la gónada. En su lugar, pasar a la siguiente animal. Worms, donde las gónadas no extruir aparecerán como tales en las diapositivas que se harán en el apartado 6 y pueden ser ignorados durante la exploración
      NOTA: A través de todos los pasos de disección y procesamiento, es importante tener en cuenta que la gónada permanecerá unido a la caja / carcasa. No fuerce la gónada y el cuerpo de separación, con la aguja. Muchas veces un desgarro aberrante en el tejido gonadal en un intento de romper la gónada del cuerpo pueden dar lugar a la señal de anticuerpo espuria. El cuerpo / carcasa pueden ser ignorados durante las etapas de formación de imágenes (sección 6), y sólo la gónada crear una imagen. Además, sometimes las células intestinales también pueden servir como controles internos / controles somáticas para el anticuerpo que se está ensayando.

3. Fijación de las gónadas

  1. Después de la disección es completa, agregar 2 ml de 3% de paraformaldehído (PFA) directamente al plato de reloj de vidrio que contiene el 100 L de M9 y los animales disecados y cubrir con Parafilm. Coloque el plato de vidrio de reloj cubierto por una campana química.
    Precaución: PFA es una sustancia química peligrosa. Por lo tanto, la fijación se debe realizar en la campana de humos química.
  2. Incubar a TA durante 10 min.
  3. Usando una pipeta desechable 9 "Pasteur de vidrio añadir 3 ml de 1x PBS-T (véase la Tabla de Materiales) a la placa de vidrio de reloj que contiene los animales disecados. Mix dibujando la solución PFA y el 1x PBS-T con los animales disecados en el Pasteur pipeta y liberando suavemente de nuevo en el plato de vidrio de reloj. no Vortex los tubos durante los lavados.
  4. El uso de un fresh pipeta Pasteur de vidrio dibujar el 5 ml de líquido (que contiene gusanos disecados, PFA y 1x PBS-T) de la placa de vidrio de reloj en la pipeta Pasteur y transferir el contenido en un tubo cónico de vidrio de 5 ml fresca.
  5. Centrifugar los tubos cónicos de 30 segundos en una centrífuga clínica a 1.000 x g. Utilizar pipetas Pasteur de vidrio y tubos cónicos como gónadas disecados se adhieren al plástico.
  6. Retirar y desechar el sobrenadante teniendo cuidado a fin de no molestar a los animales disecados. Eliminar el líquido después de cada lavado del tubo cónico bajo un microscopio de disección a fin de no afectar a las gónadas disecados, y minimizar su pérdida.
  7. Utilizando una pipeta Pasteur fresco, añadir 5 ml de 1x PBS-T a los tubos cónicos. Centrifugar los tubos cónicos en una centrífuga clínica durante 30 s a 1.000 x g. Retirar y desechar el sobrenadante teniendo cuidado a fin de no molestar a los animales disecados.
  8. Repita el paso 3.7 para un total de tres veces.
  9. Con una pipeta Pasteur fresca, añadir 2 ml de 100%metanol para los tubos y mezclar suavemente las gónadas con el metanol mediante la elaboración en la pipeta Pasteur. Incubar el tubo a -20 ° C durante un mínimo de 1 h.
    NOTA: disecado gónadas se pueden almacenar en metanol durante un máximo de 2 días para la tinción dpERK. Almacenamiento durante más de 2 días y un máximo de 2 semanas es compatible con otras aplicaciones de tinción de anticuerpos, tales como anticuerpos anti-Lamin, pero no con el anticuerpo dpERK.
  10. Después de que el tiempo de incubación deseado, repetir el paso 3.7 para un total de tres veces para lavar las gónadas. No agite los tubos durante los lavados. Después del lavado final dejar 500 l de 1x PBS-T en el tubo cónico de 5 ml.
  11. Utilizando una pipeta Pasteur fresco transferir el contenido del tubo de vidrio cónico en un tubo nuevo 1 ml de vidrio (6 mm x 50 mm). Permitir que los animales disecados se asienten por gravedad 5 - 10 min.
  12. Con una pipeta Pasteur fresco y bajo un microscopio de disección, eliminar la mayor cantidad del lavado como sea posible desde el 1 ml tubos de vidrio ingenioHout perturbar las gónadas disecados.

4. Tratamiento anticuerpo primario Bloqueo y

  1. Añadir 100 ml de 30% suero de cabra normal (NGS) diluido en 1X PBS-T (véase la Tabla de Materiales) a los animales disecados en los tubos de vidrio de 1 ml. 30% NGS sirve como el tampón de bloqueo. Cubrir el tubo con Parafilm para evitar la evaporación del líquido. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche.
  2. Después del tiempo deseado de incubación, retirar el tampón de bloqueo usando una pipeta Pasteur fresca, eliminar la mayor cantidad de líquido posible. Use un microscopio de disección para asegurar que las gónadas no se ha redactado en la pipeta Pasteur.
  3. Diluir el anticuerpo MAPKYT (véase la Tabla de Materiales, se hace referencia en este método como dpERK) a 1: 400 en 30% de NGS. Preparar la dilución de anticuerpos suficiente para utilizar 100 l por tubo. anticuerpo no utilizado, se diluyó se puede almacenar a 4 ° C durante una semana.
  4. Añadir 100 ml del anticuerpo anti-dpERK diluida tanlución de los tubos de vidrio 1 ml que contenían los animales disecados. Sellar los tubos con parafilm. Incubar los tubos a 4 ° C durante la noche.
  5. Después de la incubación durante la noche, añadir 800 l de 1x PBST a los tubos a TA.
  6. Extraer la muestra en una nueva pipeta Pasteur de vidrio y liberar suavemente para asegurar que las gónadas se suspenden uniformemente en el 1x PBS-T. Deje que las gónadas depositan en el fondo con la gravedad. Eliminar el sobrenadante. Esto asegura que las gónadas disecados se lavan pero no dañados durante el proceso.
  7. Repita los pasos 4.5 a 4.6 para un total de tres lavados. No agite los tubos durante los lavados. Después del tercer lavado, asegúrese de retirar y desechar tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los animales disecados. Asegúrese de que una pipeta Pasteur fresca se utiliza cada vez.

5. Tratamiento anticuerpo secundario

  1. Durante el anticuerpo primario lavados Preparar la dilución para el anticuerpo secundario. Diluir el anti-ratón seanticuerpo cundaria a escala 1: 500 en 30% de NGS. Al igual que con el anticuerpo primario, usar 100 l por tubo. anticuerpo no utilizada se puede almacenar a 4 ° C durante una semana.
  2. Añadir 100 l solución de anticuerpo secundario a los tubos de vidrio 1 ml que contenían los animales disecados. Cubrir cada tubo con Parafilm, y luego envolver los tubos en papel de aluminio para mantener el contenido del tubo en la oscuridad. Incubar los tubos a TA durante 2 h, o, alternativamente, a 4 ° C durante la noche.
  3. Después del tiempo deseado de la incubación, añadir 800 l de 1x PBS-T a los tubos y repita los pasos 4/5 a 4/6 para un total de tres veces. Después del lavado final, retirar y eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible bajo un microscopio de disección con una pipeta Pasteur fresco.
  4. Preparar la solución de DAPI durante los lavados para el anticuerpo secundario. Diluir 1 l de DAPI (de una población de 1.000 x de 1 mg / ml se almacena a -20 ° C) in- 1 ml de 1x PBST.
  5. Añadir 800 l de la solución DAPI diluida a los tubos que contienen elanimales disecados. Cubrir la boca del tubo con Parafilm, y envolver cada tubo en papel de aluminio. Incubar a TA durante 20 min.
  6. Después de la incubación con DAPI, eliminar la mayor cantidad de la solución de DAPI como sea posible con una pipeta Pasteur fresco, bajo un microscopio de disección a fin de no molestar a los animales disecados.
  7. Añadir 1 gota de solución a los tubos de montaje. Envolver cada tubo en papel de aluminio.
    NOTA: Para visualizar la tinción dpERK, gónadas teñidas se debe montar para microscopía inmediatamente. Para otras aplicaciones de anticuerpos tales como serina fosforilada 10 Histona H3, las gónadas se pueden mantener en medios de montaje para un máximo de 2 semanas a 4 ° C en la oscuridad.

6. Montaje de diapositivas e Imagen

  1. Coloque una capa de cinta de laboratorio a lo largo, en la parte superior, de dos portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm x 1 mm) como se ve en la figura 3. Coloque una limpia portaobjetos de vidrio fresco en medio de las dos diapositivas grabadas.
    NOTA: El espesorde la cinta ayuda a generar una almohadilla de agarosa en la diapositiva medio. Espesor de la almohadilla de agarosa es casi igual a la de la cinta, como la cinta sirve como un espaciador para la creación de la almohadilla de agarosa.
  2. Gota ~ 200 l de fundido 2% de agarosa (hecho en agua destilada) en el portaobjetos de microscopio en el medio. colocar rápidamente en un portaobjetos limpio fresco, perpendicular y en la parte superior, de la agarosa.
  3. Deje que la solidificación de agarosa (1 - 2 min).
  4. Retire el portaobjetos de microscopio superior muy suavemente, de manera que la almohadilla de agarosa no se destruye. La almohadilla de agarosa puede permanecer unida ya sea al principio o al final de la diapositiva. No importa que se deslizan la almohadilla de agarosa permanece unido a, siempre y cuando se trata de una superficie lisa de agarosa.
  5. Utilizando una pipeta Pasteur transferir los animales disecados en la almohadilla de agarosa. Eliminar cualquier exceso de líquido de la lámina usando una pipeta Pasteur bajo un microscopio de disección.
  6. El uso de un pelo de las pestañas o capilar finamente dibujada, empujar el gónadas y los intestinos de unaforma el uno del otro con el fin de difundir las gónadas a cabo en la diapositiva.
  7. Cubrir el portaobjetos de microscopio con un 24 mm x 50 mm cubreobjetos tamaño. Tener cuidado para asegurar que el cubreobjetos se baja suavemente sobre el portaobjetos con burbujas de aire mínimo que se forman entre el cubreobjetos y el portaobjetos.
  8. Almacenar a 4 ° C durante la noche en una caja de portaobjetos (una caja de portaobjetos opaco con las diapositivas acostado, cubreobjetos hacia arriba) para permitir que el exceso de líquido se evapore y las gónadas para convertirse en algo aplanada (debido al peso del cubreobjetos sobre las gónadas). El ligero aplanamiento de las gónadas permite obtener una mejor imagen de un tubo gonadal de lo contrario todo el año.
    1. Una vez montado el cubreobjetos, no para aplicar presión en la parte superior del cubreobjetos con los dedos. A menudo, esto se traduce en una distorsión de las gónadas y la pérdida de la señal dpERK.
    2. Aplanar las gónadas durante la noche sólo para imágenes más eficaz. Las diapositivas están listos para ser visto tan pronto como se montan. Para tomar imágenes inmediatamente, absorber suavementeel exceso de líquido entre el cubreobjetos y el portaobjetos de las esquinas utilizando un tejido de laboratorio limpia.
  9. Después del período durante la noche, sellar el portaobjetos y el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente capa de acabado en las cuatro esquinas del cubreobjetos y el límite de diapositivas. El / sello de esmalte de uñas cubreobjetos asegura que el cubreobjetos no se mueve mientras que las imágenes y protege contra la destrucción de las muestras.
  10. Imagen de las gónadas con un microscopio compuesto a 63X. Sin embargo la lente del objetivo y el microscopio se pueden variar en base a la disponibilidad de microscopios y aplicación de usuario. Debido a que el tamaño de toda la gónada de la región proliferativa a los ovocitos es más grande que puede ser capturado en una imagen, las imágenes se toman como un montaje con los límites superpuestas como se muestra en la Figura 4. 11-14, 18.
    1. En muchos casos, editar el canal, después de la proyección de imagen final y ensamblaje, siempre y cuando no hay alteraciones importantes están hechos a la imagen de la línea germinal. tienda tél imágenes en bruto a lo largo de la imagen montada para permitir la comparación del "antes" de montaje / edición y "después" de montaje / edición de las imágenes.
      NOTA: Las imágenes de microscopía no deben ser alteradas para la fuerza de la señal o la saturación durante el montaje del montaje.

Resultados

En los animales hermafroditas adultos WT, dpERK típicamente se visualiza en la región de mediados de pachytene, Zona 1, y, en los ovocitos más maduros de -1 a través de -4 o -5 (Zona 2). Las perturbaciones en este patrón de activación reflejar los cambios en la vía de señalización. Germlines femeninas no especifican esperma, y por lo tanto no muestran la activación de ERK en la Zona 2, sólo con la activación débil en la zona 1. Estos están representados en la Figura 5.

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Figura 1: C. Imagen de contraste diferencial de interferencia (DIC) de un hermafrodita adulto con el brazo gónadas en forma de U esbozado con la línea blanca de la línea germinal elegans Morfología.. La gónada hermafrodita adulto contiene células mitóticas en la punta distal. Las células mitóticas entran en meiosis y el progreso a través de la profase meiótica (pachytene) se conviertan en mature ovocitos en la gónada proximal. Zona 1 y Zona 2 marca la localización estereotipada de dpERK en una gónada hermafrodita adulto. Escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Demostración de la aguja posiciones durante disecciones Izquierda:. Fotografía de una disección en el proceso. Derecha:. Posiciones de aguja con referencia al gusano Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Demostración de agarosa Preparación de los portaobjetos. (A) Colocar una cinta de lengthwise través de 2 portaobjetos de microscopio limpios. Colocar un portaobjetos limpio fresco entre las dos diapositivas con la cinta como se muestra. Las tres diapositivas están uno al lado del otro a lo largo. (B) Añadir agarosa derretida a la diapositiva en el centro. (C) Colocar un portaobjetos de microscopio fresca perpendicular a, y en la parte superior de la corredera medio, que lleva la gota de agarosa. ( D) Permitir que la agarosa solidifique. (E) Eliminar el carro superior dejando atrás la almohadilla de agarosa solidificada. Utilice la corredera inferior con la almohadilla de agarosa para germlines montaje disecados y manchados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes de los rieles como un montaje Montaje de una línea germinal de tipo salvaje con DAPI (t.op) y dpERK canal (parte inferior). Imágenes tomadas a 63X con los límites de la superposición, se tomaron cajas blancas para el panel A y B y cuadros de color verde para el panel B y las imágenes C. El DAPI y dpERK para cada panel simultáneamente en dos canales diferentes. La imagen de ensamblado se muestra en la Figura 5A. Barra de escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Dinámica temporal / espacial activación de ERK. (AC) WT (N2) de adultos (de 24 horas más de media L4 etapa de desarrollo) germlines hermafroditas manchadas de ADN (B, DAPI, blanco) y dpERK (C, rojo). La señal dpERK en la zona 1, la región pachytene, y la Zona 2, los oocitos maduros se pone de relieve. (DF)niebla-2 (oz40) germlines hembra (a las 8 h pasado etapa de mediados de L4 de desarrollo) teñidas para DNA (E, DAPI) y dpERK (F). germlines mujeres jóvenes muestran dpERK débil en la zona 1, y en un solo ovocito de una manera independiente de los espermatozoides. Zona 2 es dependiente de esperma, y ​​por lo tanto ausente en la línea germinal femenina. Barra de escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

ERK activa (dpERK) sigue un patrón de localización espacial y dinámica estereotipada en el C. de la línea germinal elegans. Este patrón estereotipado dpERK espacial (Figura 5), y la amplitud en un adulto C. elegans gónada, se puede correlacionar con eficacia con los muchos procesos biológicos que ERK regula. Por ejemplo, la incapacidad para activar ERK en la Zona 2 da como resultado una detención en ovocitos en profase de la meiosis, un fenotipo observado en líneas germinales femeninas que no especifican los espermatozoides, y por lo tanto no active ERK en ovocitos maduros (Figura 5). Apareamiento con machos resultados en la acumulación efectiva de dpERK en la Zona 2 en las líneas germinales femeninas 11,13, junto con el inicio de la maduración de ovocitos y la ovulación. Así, el análisis de los patrones espaciales y temporales de la activación dpERK sobre ciertas perturbaciones genéticas (como ARN de interferencia mediada por la inactivación de genes) o tratamientos químicos permite la identificación de los factores que REGUfines de señalización de ERK y procesos biológicos tanto ERK-dependientes. Estos análisis también permiten el descubrimiento de nuevas interacciones genéticas entre las vías de señalización.

Un cuello de botella crítico para cualquier análisis basado en formación de imágenes es la disponibilidad de reactivos funcionales, tales como anticuerpos que son específicos de la aplicación. Si un reactivo tal existe, entonces métodos tales como el descrito anteriormente pueden adaptarse fácilmente para el análisis de patrón de localización para cualquier proteína de interés. La aplicación está por tanto limitada por la disponibilidad de un anticuerpo funcionamiento. Además, debido a que el método describe la disección y la tinción en un momento dado del desarrollo, sólo se permite la captura de información en un marco de tiempo, y no vierte luz sobre la dinámica o la regulación de proteínas en tiempo real o la tasa de recambio de proteínas.

El método descrito anteriormente se adapta de Francis et al. 23, que es distinta de la Seydoux y Dunn mÉTODO 24 para la extrusión de las gónadas y la tinción de anticuerpos. El método basado en Francis et al. Será llamado el "método de suspensión" y el método Seydoux y Dunn llamada la "congelación de craqueo método" para la comparación. El método de suspensión ha sido muy eficaz en nuestras manos para la obtención de patrones de localización reproducibles de moléculas de señalización tales como dpERK, que son inherentemente más sensibles a las condiciones de manipulación duras. En el caso de dpERK localización, en nuestra experiencia, la señal en la zona 1 es prácticamente indetectable con el método de craqueo congelación. Además, el secado de la muestra, que a menudo puede producirse con el método de craqueo de congelación, los resultados en señales de anticuerpos espurias. El método de suspensión minimiza el secado de la muestra, ya que las gónadas se suspenden en líquido durante todo el proceso. También encontramos que el método de suspensión es útil para obtener imágenes de varios genotipos diferentes en una sola diapositiva. Por ejemplo, si dos genotipos, como hermafroditas vslas hembras son para ser comparado directamente para dpERK localización, los dos genotipos pueden mezclarse entre sí y se procesan. Esto es posible debido a que los fenotipos son distintos y se pueden distinguir a través de morfologías DAPI. La tinción en el mismo tubo seguido de formación de imágenes en la misma diapositiva permite la comparación directa entre las gónadas de diferentes genotipos. Alternativamente, si las morfologías DAPI no son distinguibles, a continuación, una tinción de anticuerpos de dos etapas puede ser adoptado. En primer lugar cada genotipo individuo se trata con dos anticuerpos distintos, Anticuerpo A para WT y el anticuerpo B para mutante (ambos anticuerpos necesita ser levantada en un huésped distinto del anticuerpo dpERK). Una vez que los dos genotipos se han teñido con el anticuerpo primario, y se lavó, se pueden mezclar juntos en un tubo y ahora se tiñeron con el anticuerpo dpERK, seguido de un tratamiento con el anticuerpo secundario de visualizar todos los anticuerpos en el tubo. La capacidad de comparar los diferentes genotipos en una sola diapositiva, especialmente cuando dSe están haciendo eductions de los patrones de activación asegura interpretaciones precisas no afectados por las condiciones de tinción distintos.

Mientras ventajosa, hay varios pasos en todo el método de suspensión que requieren manipulación cuidadosa. Es fundamental que las disecciones se producen en un tiempo de manera eficiente; importante, las disecciones no deben tomar más de 5 minutos. disección veces más largos dan como resultado la señal dpERK variable, que a menudo pueden ser mal interpretados como cambios reguladas en la activación de ERK, en lugar de fracasos como técnicos. Es crucial comenzar con más de 100 - de 150 animales para cada disección porque a través de las diversas etapas de lavado las gónadas pueden perderse fácilmente a partir de los tubos debido a los errores de pipeteo. La pérdida de las gónadas se puede reducir, ya sea mediante la disección en múltiples lotes pequeños (por ejemplo, tres lotes de 50 animales cada uno) que se pueden combinar, o mediante la disección de un gran lote de 150. Otro reto es conseguir que las gónadas se sitúe en un bien espaciados formaciónen el portaobjetos de modo que toda la gónada distal se pueden obtener imágenes. Para permitir esto, utilizar una pestaña en una cerilla o una pipeta tirado espaciar las gónadas. Sin embargo, se debe tener cuidado para no dañar las gónadas durante este proceso. A menudo con estas técnicas se tarda varios intentos para dominar las disecciones así como las disposiciones de las gónadas sobre los portaobjetos.

Una vez que esta técnica ha sido dominado, que sirve como un poderoso método para análisis biológicos variados, y se puede utilizar para estudiar más que los niveles dpERK. Por ejemplo, este método se puede utilizar para visualizar niveles activos de p38, o los niveles de CDK activos, o cualquier proteína para la que existe un reactivo de anticuerpo. Además, el método puede ser acoplado con una pantalla de inhibición química en animales enteros para el ensayo de nuevos inhibidores o activadores de la vía, a través de ensayar los niveles de dpERK. Esto permitirá una lectura en vivo tanto de la reacción y la sensibilidad a los inhibidores que pueden interact con la vía de señalización RTK-RAS-ERK. Por otra parte, este método se puede utilizar en combinaciones de anticuerpos con múltiples salidas de señalización que pueden ser usados ​​y visualizarse a la vez. El uso de múltiples anticuerpos permite la correlación entre múltiples vías, su estado de activación, y los resultados todo ello dentro del mismo tejido, lo que permite una mejor comprensión de estas interacciones. Estos son sólo algunos ejemplos de aplicaciones adicionales de este método, pero este sistema se pueden modificar para estudiar múltiples líneas de investigación.

Divulgaciones

Los autores declararon que no existen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

El trabajo en el Laboratorio Arur está respaldado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, NIHGM98200; Instituto de Investigación para la Prevención del Cáncer de Texas, CPRIT RP160023; el Premio Académico de Investigación de la Sociedad Americana Contra El Cáncer (ACS RSG014-044-DDC); y por los Fondos Anna Fuller.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaSigma Inc.A9539Disolver 2 g en 100 ml para hacer la solución al 2% Plato de
reloj de vidrio de fondo planoAgar ScientificAGL4161Usamos vidrio porque las gónadas disecadas a menudo se adhieren al plástico
Agujas de 25 GBD PrecisionGlide305122
Jeringas (pueden ser de 1 o 5 mL)BD Jeringasde 1 mL: BD 309659
Portaobjetos de microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)Fisherbrand12-550-343
Cubreobjetos (24 x 50 mm)Corning2935-245
Tubo cónico de vidrio de 5 mLCorning8060-5
Pipeta Pasteur desechable de 9"Fisherbrand13-678-20D
Centrífuga
Tubos de vidrio (6 x 50 mm)Fisherbrand14-958-A
*M9 solución
LevamisolSigmaL9756
3% Paraformaldehído (PFA)Servicios demicroscopía electrónica17500Obtenido como solución al 16% en ampollas, y diluido al 3% en tampón de fosfato de potasio
1x PBS-T1x PBS con 0.1% Tween 20
MetanolServicios de microscopía electrónica18510
Cabra normal suero (NGS)Señalización celular5425diluido al 30% en 1x anticuerpo PBS-T
MAPKYT (dpERK) Sigma Inc.M9692Dilución 1:400 en 30% NGS
Anticuerpo secundarioInvitrogenA-11005Dilución 1:500 en 30% NGS
DAPISigmaD9542
VectashieldVector LabsH-1000
*M9 Receta3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g de NaCl, 1 mL 1 M de MgSO4, H2O a 1 L.
**PBS (1x)8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 0,133 g de CaCl2, 0,10 g de MgCl2, H2O a 1 L
de medio de crecimiento de nematodos (NGM)3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona, 975 mL de agua en 2 L de matraz Erlenmayer. Autoclave durante 50 min. Enfríe y agregue 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol, 1 mL de 1 M de MgSO4 y 25 mL de 1 M de KPO4.
clínica de sobremesa de tampón

Referencias

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