Matrices 2D y 3D para estudiar la formación y la actividad invadosoma lineal

Resumen

Este protocolo describe cómo preparar una matriz mixta 2D, que consta de gelatina y colágeno I, y un colágeno 3D para estudiar invadosomas lineales. Estos protocolos permiten el estudio de la formación invadosoma lineal, la actividad de degradación de la matriz, y la capacidad de invasión de células primarias y líneas celulares de cáncer.

Resumen

La adhesión celular, la migración y la invasión están implicadas en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Por ejemplo, durante la formación de metástasis, las células tumorales tienen que cruzar barreras anatómicas para invadir y migrar a través del tejido circundante para llegar a los vasos sanguíneos o linfáticos. Esto requiere la interacción entre las células y la matriz extracelular (ECM). A nivel celular, muchas células, incluyendo la mayoría de las células cancerosas, son capaces de formar invadosomas, que son estructuras basadas en actina F capaces de degradar ECM. Los invadosomes son estructuras de actina protrusivas que reclutan y activan las metaloproteinasas de matriz (MMPs). La composición molecular, la densidad, la organización y la rigidez de la ECM son cruciales en la regulación de la formación y la activación invadosoma. In vitro , un ensayo de gelatina es el ensayo estándar usado para observar y cuantificar la actividad de degradación invadosoma. Sin embargo, la gelatina, que es colágeno desnaturalizado I, no es una matriz fisiológica eLement. Se desarrolló un nuevo ensayo utilizando fibrillas de colágeno tipo I y se utilizó para demostrar que esta matriz fisiológica es un potente inductor de invadosomas. Los invadosomas que se forman a lo largo de las fibrillas de colágeno se conocen como invadosomas lineales debido a su organización lineal en las fibras. Además, el análisis molecular de invadosomas lineales mostró que el receptor de dominio de discoidina 1 (DDR1) es el receptor implicado en su formación. Estos datos demuestran claramente la importancia de utilizar una matriz fisiológicamente relevante para comprender las complejas interacciones entre las células y la ECM.

Introducción

La remodelación de la matriz extracelular (ECM) se produce durante procesos fisiológicos y patológicos, como la angiogénesis y la invasión de células tumorales. En condiciones fisiológicas, muchos tipos de células, en su mayoría procedentes del linaje hematopoyético, son capaces de degradar elementos ECM. Por ejemplo, los macrófagos son capaces de cruzar las barreras anatómicas para llegar a los tejidos, y los osteoclastos degradan la matriz ósea para asegurar la homeostasis del calcio. Más globalmente, todas las matrices en el cuerpo se renuevan para mantener sus propiedades físicas y químicas. En los tejidos de cáncer, la composición del microambiente tumoral está alterada. Por ejemplo, en cáncer de mama y pulmón, el colágeno tipo I se sobreexpresa y se acumula alrededor del tumor. Además, esta acumulación se asocia con un mayor riesgo de desarrollar metástasis ^{1 , 2} . Las metástasis del cáncer dependen de la capacidad de las células cancerosas para degradar la ECM e invadir tejidos adyacentes.

losInvasiva de las células se atribuye a las estructuras especializadas ricas en actina conocido como invadosomes. Este término incluye podosomas e invadopodia, que están presentes, respectivamente, en células normales y de cáncer ( por ejemplo, macrófagos, células endoteliales y células cancerosas, como la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231). In vitro , los invadosomes pueden organizarse en diferentes formas: puntos, agregados o rosetas ³ . Clásicamente, los invadosomas se componen de un núcleo de F-actina que contiene varias proteínas, como la proteína de andamio Tks5 y la cortactina, rodeadas por moléculas de placa de adhesión, tales como integrinas y vinculina ⁴ . Recientemente, se demostró que Tks5 y RhoGTPase Cdc42 se puede utilizar como una firma molecular mínima para invadosomes funcionales [ ^5] . Estas estructuras son capaces de degradar la ECM mediante el reclutamiento y la activación de proteínas metaloproteasas específicas, como MT1-MMP y MMP-2 ⁶. En un estudio anterior, se informó de que la interacción entre las fibrillas de colágeno tipo I y el receptor de dominio de la discoidina 1 (DDR1), un receptor específico de fibrillas de colágeno tipo I, conduce a la formación de una nueva clase de invadosomes, llamados invadosomes lineales. Lineales invadosomas se forman a lo largo de tipo I fibrillas de colágeno [ ^7] . Estas estructuras son capaces de degradar las fibrillas de colágeno tipo I mediante el reclutamiento y la activación de MT1-MMP / MMP2. Además, su formación depende de Tks5 y Cdc42 ⁵ . In vitro , se demostró la existencia de invadosomas lineales y la implicación de DDR1 en su formación y actividad ⁸ utilizando diferentes estrategias consistentes en una combinación de diversos elementos de matriz, incluyendo: i) cubreobjetos fluorescentes revestidos con gelatina, ii) fibrilos de colágeno tipo I fluorescente Cubreobjetos, y iii) tapones de colágeno tipo I en 3D. Debido al uso de diferentes matrices, pudimos estudiar y caracterizarIze la formación invadosoma lineal y su actividad de degradación ^{7 , 8} .

Por último, para comprender mejor la biología de las células invasivas, se utilizó una combinación de componentes ECM en sistemas de cultivo 2D y 3D, imitando la complejidad de la composición microambiental tumoral. A continuación se presentan protocolos para el recubrimiento de cubreobjetos con gelatina / colágeno tipo I en sistemas de cultivo 2D y 3D.

Protocolo

NOTA: Antes de la fijación, todos los pasos se completan en una campana estéril de flujo laminar.

1. Matriz 2D

NOTA: Las matrices 2D se utilizan para determinar el porcentaje de células que forman invadosomas y el área de degradación de la matriz por célula.

Figura 1: Protocolo. Resumen del protocolo utilizado para preparar matrices de gelatina y colágeno I. Es posible hacer solamente la matriz de gelatina o una matriz mixta de gelatina y colágeno I. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Matriz de gelatina
   NOTA: Se usan matrices de gelatina fluorescente para cuantificar la degradación de la matriz, y se usa gelatina no fluorescente para promover la adhesión de fibras de colágeno I. Estera de gelatina fluorescenteLos arroces también se utilizan para estudios de podosomas e invadópodos (ver Figura 1 ).
   1. Bajo una campana de flujo laminar estéril, coloque un trozo de parafilm (20 cm x 15 cm) en el área de trabajo y desinfiérelo con etanol al 70%.
   2. Alícuota de 20 μL de gotitas de 1 mg / ml de gelatina en una línea, separadas aproximadamente a 1 cm; Consulte la Figura 1 para la organización de gotas.
   3. Cubra cada 20 μL de gotita de gelatina con un cubreobjetos de vidrio esterilizado en autoclave (12 mm de diámetro).
   4. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Si la gelatina es fluorescente, protéjala de la luz.
   5. Alícuota de 40 μL de gotitas de glutaraldehído al 0,5% en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una línea, cada una espaciada aproximadamente 1 cm por debajo de la línea de cubreobjetos de la etapa 1.1.3.
      PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es un agente fijador tóxico. Use guantes y no inhale.
   6. Usando fórceps con joyas, transfiera cada cubreobjetos recubiertos de gelatina a una gotita de glutaraldehído.
      NOTA:Es normal que una pequeña gota de gelatina permanezca en el parafilm. No lo reutilice para otro experimento.
   7. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente. Para los cubreobjetos fluorescentes, protéjalos de la luz.
   8. Tome una placa de cultivo celular de 24 pocillos y llene cada pocillo con 500 μl de 1x PBS estéril. Coloque los cubreobjetos, gelatina hacia arriba, en cada pozo.
   9. Lavar dos veces en 1x PBS durante 5 min cada uno.
      NOTA: En este paso, los cubreobjetos pueden utilizarse para experimentación o almacenarse en 1x PBS a 4 ° C. Los cubreobjetos no fluorescentes se pueden almacenar durante una semana y los cubreobjetos fluorescentes se pueden almacenar durante 48 horas.
2. Matriz de colágeno fibrilar de tipo I
   NOTA: La matriz de colágeno Fibrilar tipo I se usa para estudiar la formación de invadosomas lineales y la degradación de la matriz asociada. Una combinación de colágeno fluorescente I y cubreobjetos de gelatina no fluorescentes se utiliza para colocalizar marcadores invadosoma con fibras de colágeno ( por ejemplo, F-actina iN el canal rojo lejano, el colágeno I en el canal rojo, Tks5 en el canal verde y el colorante Hoechst para una tinción nuclear). Por otra parte, se utiliza una combinación de colágeno no fluorescente I con cubreobjetos de gelatina no fluorescentes para maximizar el número de marcadores invadosomas teñidos ( por ejemplo, F-actina en el canal rojo lejano, cortactina en el canal rojo, Tks5 en El canal verde, y el colorante Hoechst para una tinción nuclear). Por último, se utiliza una combinación de colágeno no fluorescente I con cubreobjetos de gelatina fluorescente para cuantificar la degradación asociada a gelatina ( por ejemplo, actina F en el canal rojo lejano, Tks5 en el canal rojo, en el canal verde y colorante Hoechst Para una tinción nuclear) (véase la figura 1). Hoechst tinte se utiliza para teñir el núcleo, y también se comprueba la contaminación por micoplasmas, además de una prueba de PCR realizada regularmente en las líneas celulares utilizadas.
   1. Colágeno fluorescente I
      1. Utilizar colágeno comercial I extraído del tendón de la cola de rata en ac acético 0,02 Nre. Retirar la cantidad de colágeno I necesaria para preparar 500 μl de solución por cubreobjetos a una concentración final de 0,4 mg / ml de colágeno I.
      2. Se añade éster succinimidílico de 5-carboxi x rodamina a una concentración final de 10 μg / ml, calculado para el volumen final de solución de colágeno I (nx 500 μl).
      3. Mezclar la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      4. Diluir hasta el volumen final con solución salina tamponada con fosfato 1X Dulbecco (DPBS) que contiene calcio y magnesio, y usar directamente.
   2. Colágeno fibrilar, cubreobjetos
      1. Utilice los cubreobjetos de gelatina no fluorescentes o fluorescentes previamente preparados en el paso 1.1.
      2. Preparar una solución de colágeno fluorescente o no fluorescente I a una concentración final de 0,4 mg / ml en 1X DPBS que contiene calcio y magnesio.
      3. Añadir 500 μl de solución de colágeno I fluorescente o no fluorescente porCubreobjetos en una placa de cultivo celular de 24 pocillos.
      4. Incubar durante 4 h a 37 ° C para la polimerización de colágeno I.
      5. Después de la incubación, eliminar el exceso de colágeno I inclinando la placa y pipeteando en el lado del pozo (no directamente en la cubreobjetos) para evitar dañar la matriz.
         NOTA: Esta matriz no se puede almacenar. Sembrar las células inmediatamente después de retirar el exceso de colágeno I.

2. Siembra celular, tiempo de cultivo y fijación

1. Dependiendo del tipo de célula, preparar las células en el medio de cultivo apropiado y añadir células para un volumen final de 500 μL por pocillo.
2. Para caracterizar la capacidad de una línea celular de formar invadosomas lineales y degradar la matriz, se plancha las células durante 4 h, 12 h y 24 h en la matriz de colágeno I para determinar la cinética de formación de invadosomas lineales y la actividad de degradación asociada.
   NOTA: La Tabla 1 contiene ejemplos de líneas celularesEn el laboratorio.

   Línea celular	Número de células por cubreobjetos	Tiempo de contacto con la matriz para la cuantificación invadosoma lineal	Tiempo de contacto con la matriz para la cuantificación de la actividad de degradación invadosoma lineal
   MDA MB 231	40.000	4 h	12 h
   HUH7	40.000	12 h	24 h
   HEP 3B	40.000	12 h	24 h
   SNU 398	40.000	12 h	24 h
   NIH 3T3 src	30.000	4 h	12 h
   A431	50.000	6 horas	24 h
   A549	40.000	12 h	24 h# 160;
   CRUDO	40.000	12 h	12 h
   PAE	40.000	12 h	12 h

   Tabla 1: Tiempo de siembra de células y tiempo de incubación. Esta tabla presenta una lista no exhaustiva de líneas celulares utilizadas para el estudio de invadosomas lineales. Indica el número de células a sembrar en la matriz, el tiempo necesario para observar las invadosomas lineales y el tiempo necesario para observar la degradación de la matriz asociada. Los invadosomas lineales tienen una vida corta. Para poder observar invadosomas lineales en el número máximo de células, las células tienen que estar en contacto con la matriz de colágeno I durante un corto período de tiempo. Por otra parte, para poder visualizar la degradación de gelatina descrita, las células deben estar en contacto con la matriz de colágeno I durante un período de tiempo más largo que las enumeradas anteriormente.
3. Después de la eliminación del medio de cultivo celular,Fijar los cubreobjetos durante 10 minutos en 500 μl de paraformaldehído al 4% en 1X PBS.
4. Lavar dos veces con 1x PBS.
5. Conservar a 4 ° C, protegido de la luz.

3. Inmunofluorescencia

1. Permeabilizar las células durante 10 min con una solución recién preparada De 0,2% de Triton X-100 en 1x PBS. No reutilice esta solución.
2. Lave los cubreobjetos dos veces con 1x PBS.
3. Coloque un pedazo de parafilm (20 cm x 15 cm) sobre el banco.
4. Diluir el anticuerpo primario en 4% de albúmina de suero bovino (BSA) en 1x PBS, como se describe en la Tabla de Materiales .
5. Alícuota de 50 μL de gotitas de solución de anticuerpo primario en una línea, cada una espaciada aproximadamente 1 cm entre sí.
6. Coloque cada cubreobjetos en una gotita.
7. Incubar durante 40 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
8. Después del período de incubación, lavar dos veces con 1x PBS.
9. Diluir el anticuerpo secundario, la faloidina y el colorante Hoechst en BSA al 4% en 1xPBS.
10. Alícuota de 50 μL de gotitas de la mezcla, cada una espaciada aproximadamente 1 cm por debajo de la primera línea de cubreobjetos, como se hizo anteriormente.
11. Coloque cada cubreobjetos en una gotita.
12. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.
13. Después de la incubación, lavar dos veces con 1x PBS.
14. Lavar una vez con agua destilada para eliminar las sales.
15. Monte los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con medio de montaje polimerizante.
16. Deje que los cubreobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente, protegidos de la luz, antes de la microscopía.

4. Cuantificaciones

Figura 2: Cuantificación invadosoma lineal. La macro requiere imágenes confocales de F-actina y tinción Tks5 (formato: 1,024 x 1,024). ( A ) En primer lugar, abra la imagen de la F-actina y realice una máscara. ( B ) A continuación, abraLa imagen Tks5 y el umbral. Aplicar la macro. ( C ) Los resultados analizados aparecerán en dos cuadros. El número de invadosomes lineales por celda y otra información, como el área porcentual utilizada por invadosomas lineales en la celda, estará en la tabla Resumen. El tamaño de cada invadoso lineal estará en la tabla Resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Porcentaje de células que forman invadosomas lineales
   1. Cuente las células que forman invadosomas lineales, aproximadamente 100 células por cubreobjetos (use triplicados técnicos). Cuantificar al menos 300 células por n, con n = 3.
   2. Calcular el porcentaje de células que forman invadosomas lineales tomando el promedio de tres experimentos independientes, resultando en 900 células cuantificadas.
2. Tamaño y número de invadosomas lineales por celda
   
3. Utilice ImageJ con la macro suplementaria.

Degradación por celda

1. Utilice tres cubreobjetos por condición.
2. Tome 30 imágenes por cubreobjetos de gelatina fluorescente y núcleos teñidos por Hoechst.
3. Utilice el software ImageJ tal como se describe en Martin KH et al. ⁹ .

5. 3D Collagen Invasion Assay

Figura 3: Esquema del ensayo de invasión. Resumen del protocolo de ensayo de invasión. El colágeno I se reticula con colorante de éster de succinimidilo y se polimeriza durante 1 ha 37 ° C. Las células se añaden en medio libre de suero en la parte superior del tapón de colágeno I. El inserto se coloca en medio wi10% de FBS. Los tapones de colágeno I se fijan 1 h después de la siembra de células en el control y 3 días después de la siembra de células en la condición experimental para determinar la capacidad de invasión de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación del tapón de colágeno I
   1. Hacer un curso de tiempo de 4 h, 12 h, 24 h, 48 h y 72 h para el primer experimento para determinar la cinética de invasión en el gel de acuerdo con el tipo de célula. Para cada experimento, añada un punto de tiempo de 1 h como punto de referencia cuando no se produzca ninguna invasión.
   2. Prepare la solución de colágeno I en hielo bajo una campana estéril de flujo laminar. Prepare 500 μl de solución para 3 insertos de cámara Boyden.
   3. Aspirar 1 mg de colágeno comercial I de cola de rata para preparar una solución con una concentración final de 2 mg / ml de colágeno I.
   4. Se añade éster succinimidílico de 5 - carboxi x rodamina aUna concentración final de 1 μg / ml, calculada para el volumen final de solución de colágeno I (en este caso, 500 μl).
   5. Mezclar bien e incubar durante 5 min en hielo bajo la campana estéril de flujo laminar, protegido de la luz.
   6. Añadir 50 μL de PBS 10X filtrado y enfriado con hielo y 6,25 μL de hidróxido de sodio 1 M (NaOH) enfriado con hielo.
   7. Añadir agua estéril de acuerdo con la fórmula 443.75 - x μl de colágeno I.
   8. Añadir 100 μl de solución por inserto de cámara Boyden.
   9. Incubar durante 1 h a 37 ° C para permitir la polimerización.
   10. Añadir el medio de cultivo celular enriquecido con suero fetal bovino (FBS) en nuevos pocillos; Coloque insertos en estos pocillos.
   11. Semilla 30.000 células en la parte superior del colágeno I tapón en medio libre de FBS.
   12. Después de cultivar las células a 37ºC, fijar el tapón de colágeno I durante 30 minutos en paraformaldehído al 4% en 1x PBS.
   13. Completar la inmunofluorescencia como en el paso 3, con la excepción de los siguientes pasos: permeabiliZe con 0,2% de Triton X-100 en 1x PBS durante 30 min, no 10 min; Incubar con soluciones de anticuerpos primarios y secundarios durante 1,5 h cada uno, en vez de 40 min y 30 min, respectivamente. Mancha para F-actina o núcleos para localizar las células.
   14. Después de la inmunofluorescencia, utilice un bisturí para cortar alrededor de la membrana del inserto y transfiera cuidadosamente el colágeno I a un plato de fondo de vidrio. Asegúrese de que la parte superior del tapón de colágeno I esté en contacto con el cristal. Mantenga la membrana inserta unida a la parte inferior del colágeno I tapón con el fin de mantener la integridad del tapón.
       NOTA: El tapón de colágeno I permanece intacto en el plato de fondo de vidrio. La profundidad entre el fondo del vidrio y el plástico que rodea el fondo del vidrio es equivalente al espesor del tapón.
   15. Coloque un cubreobjetos en el colágeno I enchufe y monte con medio de montaje de polimerización para evitar que el enchufe se seque.
   16. Utilice un microscopio confocal invertido para la imagen del colágeno I tapón; la parte superior deEl tapón está en contacto con el fondo de vidrio del plato.
       1. Adquirir una pila z desde la parte superior hasta la parte inferior del colágeno que enchufo para visualizar la invasión celular. Determine el grosor de la pila z examinando cuán profundamente las células invaden el campo de imágenes. Realice adquisiciones con un objetivo de aceite 40X en un formato 512 x 512 con un tamaño de paso z de 0,25 μm.
          NOTA: Para referencia, la pila z media de las células MDA-MB-231 3 días después de la siembra es de 30 μm.

Resultados

Usando una combinación de dos tipos de matrices, gelatina y colágeno tipo I ( Figuras 1 y 4 ), hemos resaltado un nuevo tipo de invadosomas, conocidos como invadosomes lineales. El etiquetado de estas matrices permite la observación de la formación invadosoma lineal a lo largo de fibras de colágeno I y de sus capacidades de degradación ( Figura 5 ). El número de estructuras invasivas puede entonces ser cuantificado por la macro descrita ...

Discusión

Clásicamente, los invadosomes se estudian in vitro sin tener en cuenta el microambiente y la matriz en la que se cubren las células. Actualmente se utilizan varios tipos de matrices, incluyendo gelatina, fibronectina, vitronectina o colágeno fibrilar de alta densidad (HDFC) ^{7 , 11} ; Sin embargo, a menudo no son representativos del microambiente en el que residen las células y no son fisiológicamente relevantes. Aquí, un nuevo tipo de matriz, que consist...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de gelatina	Sigma	G1393	Caldo 20 mg/ml utilizado a 1 mg/ml Gelatina
de piel de cerdo Oregon green 488 conjugado	Molecular probe life technologies	G13186	5mg diluido a 1 mg/ml en agua estéril
Cubreobjetos de microscopio	Marlenfeld GmbH & Co	111520	y Oslash; 12 mm No.1
2.5% Glutaraldehído en tampón de cacodilato de sodio 0.1M pH 7.4	Ciencia de microscopía electrónica	15960	Diluir al 0.5 % en agua estéril
1x PBS pH 7.4	Gibco por life technologies	10010-015	Utilice este PBS en todos los pasos antes de la fijación
Colágeno I Cola	rata Corning	354236
5 carboxiy X Rhodamimina éster de siccinimidil	Life technologies	C-6125
DPBS 1x + calcio + magnesio	Gibco de life technologies	14040-091
Solución de paraformaldehído al 16%	Ciencia de la microscopía electrónica	15710	Diluido al 4% en 1X PBS
Triton X 100	Sigma	T9284
10x tampón PBS pH 7.4	Ambion	AM9625	Diluido a 1X en agua Úselo en pasos después de la fijación
Anticuerpo	Tks5Santa Cruz	sc-30122	Marcadores de invadosoma Dilución: 1/100
Anticuerpo de cortactina 4F11	Millipore	5180	Marcadores de invadosoma Dilución: 1/100
Anticuerpo DDR1	Señalización celular	5583	Receptor de invadosoma lineal
Dilución: 1/100
Faloidina FluoProbes	Interchim	FT-AZ0330	Marcador de actina fibrilar Dilución :1/200
Hoechst	Sigma	33258	Dilución del marcador de núcleo: 1/200
Anticuerpos secundarios FluoProbes	Interchim	FP-488 FP-547H o FP-647H
Albúmina de suero bovino	Sigma	A2153	Diluido al 4% en 1X PBS
Fluoromount G	Interchim	FP 483331
ImageJ	Dominio		públicohttp://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Inserto de cultivo celular	Corning	353097	8.0µ m tamaño de poro / 24 pocillos
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma	221465