Artículo de método

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

DOI:

10.3791/54967

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26 de abril de 2017

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1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Resumen

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El procesamiento de la mayoría de los ARN eucariotas está mediado por RNA Binding Proteins (RBPs) con configuraciones modulares, incluyendo un módulo de reconocimiento de ARN, que se une específicamente a la diana pre-mRNA y un dominio efector. Anteriormente, hemos aprovechado el único modo de unión a ARN del dominio PUF en Pumilio humano 1 para generar un andamio de enlace de ARN programable, que se usó para diseñar varias RBPs artificiales para manipular el metabolismo de ARN. Aquí, un protocolo detallado se describe para construir Engineered Splicing Factors (ESF) que están específicamente diseñados para modular el empalme alternativo de los genes diana. El protocolo incluye cómo diseñar y construir un andamio PUF personalizado para un objetivo de ARN específico, cómo construir un plásmido de expresión de ESF fusionando un dominio PUF diseñador y un dominio efector y cómo usar ESFs para manipular el empalme de genes diana. En los resultados representativos de este método, se han descrito también los ensayos comunesde las actividades del FSE utilizando la prensa de empalme, la aplicación de FSE en células humanas cultivadas, y el posterior efecto de los cambios de empalme. Siguiendo los protocolos detallados en este informe, es posible diseñar y generar ESFs para la regulación de los diferentes tipos de splicing alternativo (AS), que proporciona una nueva estrategia para estudiar la regulación de empalme y la función de diferentes isoformas de empalme. Por otra parte, mediante la fusión de diferentes dominios funcionales con un dominio PUF diseñado, los investigadores pueden diseñar factores artificiales que se dirigen a ARN específicos para manipular diversos pasos de procesamiento del ARN.

Introducción

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La mayoría de los genes humanos se someten a splicing alternativo (AS) para producir múltiples isoformas con actividades distintas, que ha aumentado en gran medida la complejidad de codificación del genoma 1, 2. AS proporciona un mecanismo importante para regular la función de genes, y está estrechamente regulada a través de diversas vías en diferentes etapas celular y del desarrollo 3, 4. Debido misregulation empalme es una causa común de la enfermedad humana 5, 6, 7, 8, dirigido a la regulación de empalme está convirtiendo en una ruta terapéutica atractiva.

De acuerdo con un modelo simplificado de la regulación de empalme, AS está controlada principalmente por corte y empalme reguladores cis -Elementos (ERE) en pre-mRNA que funcionan como potenciadores de corte y empalme o silenciadores de exones alternativos. ThSREs ESE reclutan específicamente diversos factores de proteínas que actúan en trans (es decir, factores de empalme) que promueven o inhiben la reacción de corte y empalme 3, 9. La mayoría de los factores de empalme activo en trans tienen dominios de unión de ARN específico de secuencia separados de reconocer sus objetivos y dominios efectores para controlar empalme. Los ejemplos más conocidos son los miembros de la (SR) de la familia de proteínas serina / rico en arginina que contienen ARN de reconocimiento de motivos (EMRR), que se unen exonic splicing enhancers y RS C-terminales dominios N-terminales, que promueven la inclusión del exón 10 . A la inversa, hnRNP A1 se une a silenciadores exonic empalme a través de los dominios RRM e inhibe la inclusión del exón través de un dominio rico en glicina C-terminal 11. El uso de este tipo de configuraciones modulares, los investigadores deben ser capaces de diseñar los factores de empalme artificiales mediante la combinación de una específica de unión al ARN de dominio (RBD) con diferentes efecTor que activan o inhiben el empalme.

La clave de tal diseño es utilizar un RBD que reconoce dadas objetivos con ARN programable vinculante especificidad, que es análoga a la ADN vinculante modo de la TALE dominio. Sin embargo, la mayoría de los factores de empalme nativos contienen RRM o K Homología (KH) dominios, que reconocen los elementos cortos de ARN con afinidad débil y por lo tanto carecen de un predictivo de ARN-proteína de reconocimiento "código" 12 . El RBD de PUF proteínas de repetición ( es decir, el dominio PUF) tiene un único modo de reconocimiento de ARN, lo que permite el rediseño de PUF dominios para reconocer específicamente diferentes ARN objetivos [ 13 , 14] . El dominio PUF canónico contiene ocho repeticiones de tres hélices α, cada una de las cuales reconoce una única base en un objetivo de ARN de 8 nt. Las cadenas laterales de aminoácidos en ciertas posiciones de la segunda hélice-α forman enlaces de hidrógeno específicos con el borde de Watson-Crick de tél ARN base, que determina la especificidad de unión de ARN de cada repetición (Figura 1A). El código de reconocimiento de bases de RNA de la repetición PUF es sorprendentemente simple (Figura 1A), lo que permite la generación de dominios PUF que reconocen cualquier combinación posible 8-base (revisado por Wei y Wang 15).

Este principio de diseño modular permite la generación de un empalme Factor Engineered (FSE) que consiste en un dominio PUF personalizado y un dominio de modulación de empalme (es decir, un dominio de SR o un dominio Gly-ricos). Estos ESFs pueden funcionar ya sea como activadores de empalme o como inhibidores para controlar diversos tipos de eventos de empalme, y que han demostrado ser útiles como herramientas para manipular el empalme de genes endógenos relacionados con la enfermedad humana 16, 17. Como un ejemplo, hemos construido ESFs-de tipo Gly PUF para alterar específicamente el corte y empalme del gen Bcl-x, La conversión de la isoforma larga anti-apoptótica (Bcl-xL) a la pro-apoptótica isoforma corta (Bcl-xS). Desplazamiento de la relación de la Bcl-x isoforma era suficiente para sensibilizar a varias células cancerosas a múltiples fármacos de quimioterapia contra el cáncer 16, lo que sugiere que estos factores artificiales pueden ser útiles como reactivos terapéuticos potenciales.

Además de controlar el empalme con dominios de empalme efectoras conocidos (por ejemplo, una RS o Gly-rico de dominio), los factores de PUF ingeniería también se pueden utilizar para examinar las actividades de los nuevos factores de empalme. Por ejemplo, usando este enfoque, hemos demostrado que el dominio C-terminal de varias proteínas SR puede activar o inhibir empalme cuando la unión a diferentes regiones pre-ARNm 18, que el motivo rico en alanina de RBM4 puede inhibir de empalme 19, y que el motivo rico en prolina de DAZAP1 puede mejorar de empalme 20, 21 </ Sup>. Estos nuevos dominios funcionales se pueden utilizar para construir otros tipos de factores artificiales a splicing afinar.

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Protocolo

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1. Construcción de un andamio PUF con Customized Especificidad de unión al ARN por PCR de solapamiento

  1. Diseñar una serie de cebadores de PCR que contienen las secuencias PUF que reconocen específicamente diferentes nucleótidos de ARN en cada posición 12 (véase la Tabla 1 para las secuencias del cebador y vea la Figura 1 A para la ARN: código de reconocimiento PUF). Para cada repetición PUF, de diseño cuatro cebadores diferentes para reconocer una base diferente en cada posición.
    NOTA: Estos cebadores se utilizan en una serie de cuatro rondas de reacciones de PCR para generar fragmentos PUF que se unen (Figura 1 B).
  2. Seleccionar el sitio de reconocimiento del gen diana cerca del sitio de empalme alternativo.
    NOTA: Este sitio puede ser decidido por el usuario, y por lo general se elige dentro de 10 - 50 nt de los sitios de empalme alternativo.
  3. Ronda 1: Generar secuencias de codificaciónpara las repeticiones 4 PUF, fragmentos puente universales, y fragmentos de capitalización.
    1. Utilizar el sitio de destino para definir el código de reconocimiento para cada repetición de la PUF personalizado. Seleccione el conjunto de cebadores de PCR para PUF repite 1 - 8. Conducta cuatro rondas consecutivas de PCR para producir un dominio PUF personalizada, tal como se describe a continuación (Figura 1 B).
    2. En la primera ronda de PCR, configurar mezclas estándar de reacción de PCR (que contiene 2,5 l de 10x tampón, 0,5 l de dNTPs 10 mM, 0,5 l de 10? M de avance y cebadores, 50 ng de la plantilla de ADN (ADNc humano o vector de expresión revertir de WT dominio PUF), y 0,5 U de alta fidelidad de ADN polimerasa en un volumen final de 25! l).
      NOTA: Estas reacciones producirán secuencias de ADN correspondientes a cada repetición PUF, a fragmentos puente universales, y a dos fragmentos casquillo con diferentes sitios de restricción (Figura 1 B). Una breve lista de plantillas, cebadores, Los productos de PCR y generados usado en esta etapa se muestran en la Tabla 2.
    3. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 15 s a 72 ° C; y 5 min de incubación a 72 ° C. Utilice de alta fidelidad de ADN polimerasa para minimizar mutaciones puntuales durante la PCR.
  4. Ronda 2: generar secuencias de codificación para R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) y R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Separar los productos de PCR obtenidos en la etapa 1.3.3 utilizando electroforesis con un gel de agarosa al 1,5% (25 min a una tensión constante de 120 V). Gel-purificar todos los productos del tamaño esperado usando un kit de purificación de gel. Use una mezcla diferente de estos productos como molde en las siguientes rondas de PCR.
      NOTA: Mezclar los tres productos de PCR en aproximadamente una relación 1: 1: 1. Por lo general no deben ser cuantificados, siempre y cuando la intensidad de cada producto tiene una apariencia similar en el gel.
    2. Mezclar aproximadamente el 5% de los productos de PCR purificado como una temEn la siguiente ronda de PCR. Alternativamente, cuantifique los productos de PCR purificados usando un espectrofotómetro UV-Vis y utilice 15 ng de cada producto de PCR en la mezcla de molde.
    3. Utilizar productos de PCR purificados R1 / R2, R3 / R4 y Bridge 2/3 como plantillas mixtas y R1-F y R4-R como cebadores. Configure la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener el producto R1 - 4 de PCR solapado.
    4. Utilizar productos de PCR purificados R5 / R6, R7 / R8 y puente 6-7 como plantillas mixtas y R5-F y R8-R como cebadores para obtener el producto de PCR superpuesto R5-8 ( Figura 1 B ). Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C y 30 s a 72 ° C; Y 5 min a 72 ° C. Gel-purificar R1-4 y R5-8.
  5. Ronda 3: Generar secuencias de codificación para R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 sin tapas).
    1. En la tercera ronda de PCR, utilizando el purificado R1-4, R5-8 y Bridge 4/5 como plantillas mixtas y R1-F yR8-R como cebadores, estableció la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener la superposición de PCR producto R1-8 sin tapas.
    2. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 55 s a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C. Gel-purificar el R1-8 sin tapas.
  6. Ronda 4: generar secuencias de codificación para dominios PUF completas.
    1. En la última ronda de PCR, utilizando el R1-8 purificado sin las tapas y las tapas de extremo 5 'y del extremo 3' como plantillas mixtos y Cap-F y Cap-R como cebadores, configurar la reacción de PCR como se describe en el paso 1.3 para obtener los dominios PUF mutados finales.
    2. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 1 min a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C.
    3. Gel-purificar los productos de PCR de los dominios PUF reprogramadas finales. Usar estos productos para la construcción del plásmido de expresión FSE en las etapas subsiguientes. Sequrencia la construcción final para verificar las secuencias reprogramadas de dominios PUF.
      NOTA: Cap-F codifica NLS (PPKKKRKV) entre BamH I y los sitios Xba I y Cap-R codifica un codón de parada y el sitio Sal I (sitios de restricción fueron diseñados para la construcción de vectores de expresión de ESFs, Figura 1 C).

2. Construcción de un módulo funcional de ESF

  1. Dos estrategias se utilizan comúnmente para clonar módulos funcionales de ESFs (dominios RS o dominios Gly-ricos): para amplificar estos dominios mediante PCR utilizando ADNc humano total como plantilla (paso 2.2) o para sintetizar directamente los fragmentos de ADN que codifican para diferentes RS o dominios Gly-ricos (paso 2.3).
  2. Uso de PCR para clonar RS dominios desde los residuos 123 - 238 de 9G8 (NP001026854), residuos 180-272 de SRp40 (NP008856), o residuos 117 - 221 de SC35 (NP003007). Clonar dominios Gly-ricos de los residuos 195 a 320 de hnRNP A1 (NP_002127), residuos 203 - 353 de hnRNP A2 (NP112533), o residuos 211 - 378 de hnRNP A3 (NP919223).
    1. Utilice la herramienta de diseño de cebadores NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) o Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) para diseñar cebadores para la clonación de dominios RS o dominios Gly-ricos (módulo funcional de SESF).
      NOTA: El cebador directo contiene una etiqueta FLAG N-terminal después de que el sitio NheI. El cebador inverso contiene un sitio BamH I para la clonación en vectores de expresión (Figura 1 C).
    2. Configurar la reacción de PCR estándar, como se describe en el paso 1.3, para amplificar las RS o dominios Gly-ricos. Ajuste el programa de PCR como sigue: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, y 30 s a 72 ° C; y 5 min a 72 ° C.
  3. Clon RS dominios o dominios Gly-ricos a través de la síntesis de ADN directa. En lugar de generar productos de PCR que codifican para los dominios efectores en el paso 2.2, Synthetamaño de un oligonucleótido que codifica un dominio de fragmento corto RS (RSRSRSRSRSRS) o un dominio Gly-rico (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) usando una fuente comercial de oligonucleótidos de ADN.

3. Construcción de plásmidos de expresión FSE

  1. Construir FSE plásmidos de expresión utilizando cualquier vector de expresión.
    NOTA: una construcción de expresión pGL-Gly-MS2 (un regalo de Dr. R. Breathnach del Instituto de Biologie-CHR 11) se utilizó originalmente, que codifica a partir de la N- al C-terminal, un epítopo FLAG, un Gly dominio rico en de hnRNP A1, y la proteína de cubierta de MS2. Por lo tanto, esta construcción de expresión se utiliza como un ejemplo en la siguiente etapa.
    NOTA: Otros vectores de expresión con sitios de clonación múltiple también se puede utilizar, y los pasos de clonación estándar será aplicado para unir los fragmentos juntos.
  2. Digerir 1,5 g de los plásmidos de expresión (pGL-Gly-MS2) mencionados en el paso 3.1 para eliminar el fragmento de proteína de cubierta de MS2. Usar la restricEndonucleasas BamH I y Sal I durante 1 h a 37 ° C. Digerir el módulo de reconocimiento de ESFs (codificación de un NLS y reprogramado PUF dominios, generados en el paso 1.5) con BamH I y Sal I en la misma condición.
  3. Añadir 5 x colorante de carga a las reacciones de digestión de restricción y electroforer lentamente el volumen total con un gel de agarosa al 1,5% que contiene una tinción de gel de ADN durante 40 minutos a 120 V. Purificar con gel los productos digeridos.
  4. Preparar 10 μL de reacciones de ligación con un módulo de reconocimiento purificado de insertos de ESF y ADN de vector de expresión en una relación de 3: 1, 1 μl de ADN ligasa y 1 μl de tampón de ligación 10x. Incubar las reacciones de ligación durante una noche a 4ºC; El constructo resultante expresa una ESF de tipo Gly-PUF (pGL-Gly-PUF) bajo el control de un promotor CMV ( Figura 1C ).
  5. Se elimina el fragmento que codifica el dominio rico en FLAG / Gly con digestión con Nhe I y BamH I durante 1 h a 3ºC7 ° C. Sustitúyala por un fragmento que codifique el dominio RS (generado en el paso 2.2, también digerido por Nhe I y BamH I); La construcción resultante expresa un ESF de tipo RS-PUF ( Figura 1C ).

4. Construcción del reportero de empalme

  1. Sintetizan oligonucleótidos que contienen las secuencias candidatas ( es decir, secuencias diana de dominios PUF) flanqueadas por sitios Xho I y Apa I o sitios Xho I y EcoR I. Se recubren los oligonucleótidos durante 5 min a 55ºC para obtener insertos de doble cadena que contienen los sitios de reconocimiento de los dominios PUF flanqueados por los extremos cohesivos de los sitios Xho I y Apa I o Xho I y EcoR I.
  2. Comience con un reportero de empalme modular 22 previamente descrito, pGZ3, que contiene dos exones de GFP separados por un exón de prueba (exón 12 del IGF2BP1 humano, Ensembl ID ENSG00000159217) y sus acompañamiento intrones.
    NOTA: El exón prueba fue diseñado con los sitios Xho I y Apa I, que pueden ser utilizados para insertar los oligonucleótidos sintetizados que contienen las secuencias candidatas (secuencias diana de dominios PUF). Este reportero empalme modular (pGZ3) se proporciona a través del plásmido repositorio Add-gen.
  3. Digerir el reportero de base pGZ3 (preparado en la etapa 4.2) con las endonucleasas de restricción Xho I y Apa I para 1 h a 37 ° C.
  4. Gel-purificar los productos digeridos tal como se describe en el paso 3.3.
  5. Preparar 10 l de reacciones de ligación con los insertos de doble hebra generados en la etapa 4.1 y el vector digerido pGZ3 generados en la etapa 4.4 en una relación molar 3: 1, 1 l de ADN ligasa, y 1 l de 10x tampón de ligación. Se incuban las reacciones de ligación durante la noche a 4 ° C para obtener el constructing empalme reportero vector pGZ3.
  6. Insertar los insertos de doble hebra generados en la etapa 4.1 en el anteriormente(Utilizando sitios Xho I y EcoR I) y pEZ-2F (usando sitios Xho I y Apa I) 23 , para obtener el reportero 5 'ss competitivo y el reportero 3' ss competidor, como se describe en los pasos 4.3-4.5.
    NOTA: Los dos tipos de reporteros de empalme estarán disponibles a través de Add-gene.

5. Construcción de vectores de expresión lentivirales para el FSE

  1. Establecer la reacción de PCR estándar como se describe en el paso 1.3 para amplificar los ESFs de longitud completa de los vectores de expresión originales (pGL-Gly-PUF o pGL-RS-PUF) con cebadores que contienen sitios Mlu I / Spe I. Ajuste el programa de PCR de la siguiente manera: 5 min a 95 ° C; 28 ciclos de 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C y 1,5 min a 72 ° C; Y 5 min a 72 ° C.
  2. A través de una reacción de digestión, purificación en gel y reacción de ligación, integrar los ESFs en el vector de expresión lentiviral, pWPXLd, entre el Mlu I / sitios Spe I, tal como se describe en los pasos 3.2-3.4.
  3. Utilice el método de precipitación con fosfato de calcio estándar, como se informó anteriormente 24, para generar los lentivirus mediante cotransfección de células HEK293T por el envasado de los vectores, psPAX2 y pMD2.G, ya sea con pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF ( en peso) (como un control de especificidad), o pWPXLd-GFP (mock).
    1. Seed 5x10 6 células HEK293T en placas de 10 cm y crecer las células durante la noche en 10 ml de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) por placa en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 . Realizar la transfección cuando las células son un 70 - 90% de confluencia.
    2. Preparar la mezcla de plásmido mediante la adición de los tres plásmidos (7.5 g del vector de embalaje, psPAX2; 2,5 g de pMD2.G; y 10 g de o bien pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (en peso) o pWPXLd-GFP) a un tubo de 2 ml.
    3. Añadir 560! L de 0,25 M CaCl2 y 560 μl de 2x solución de BBS al tubo de 2 ml. Se mezcla suavemente varias veces y se incuba durante 15 minutos a TA para preparar la mezcla de transfección.
    4. Añadir todas las mezclas de transfección a los platos de 10 cm. Agitar suavemente los platos e incubarlos durante la noche al 3% de CO 2 y 37 ° C.
    5. Eliminar el medio, agregar 10 mL de DMEM fresco con 2% de FBS a cada plato, e incubarlos a 10% de CO 2 y 37 ° CO / N.
    6. Recoger el primer sobrenadante de los platos. Añadir 10 ml de DMEM fresco con 2% de FBS a cada plato. Incubar los platos O / N a 10% de CO 2 y 37 ° C. Guarde el sobrenadante a 4 ° C.
    7. Recoger el segundo sobrenadante de los platos. Reúna el sobrenadante de la primera y segunda cosecha. Limpiar el sobrenadante de los desechos celulares filtrando a través de un filtro de 0,4 μm. Utilice el sobrenadante limpiado directamente o guárdelo a -80 ° C.
  4. Determinar el título del lentivirus infectando HEK2Células 93T con diluciones en serie de la preparación de virus, como se informó anteriormente 25.

6. Específicamente modulación de inclusión del exón y el uso alternativo de los sitios de empalme con ESFs

  1. Seed 2 x10 5 células HEK293T en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Cultivar las células durante la noche en 500! L de DMEM suplementado con 10% FBS en una incubadora humidificada a 37 ° C y 5% de CO2.
  2. Mezclar el reactivo de transfección liposomal invirtiendo suavemente las botellas antes de su uso. Diluir 2 l de reactivo de transfección liposomal en 50 l de medio de suero reducido. Mezclar suavemente y se incuba durante 5 min a TA.
  3. Diluir 0,04 g de vectores de expresión de pGL-Gly-PUF y 0,2 g de plásmidos informadores pGZ3 en 50 l de medio de suero reducido en un tubo estéril. Diluir 0,4 g de vectores de expresión PGL-RS-PUF y 0,2 g de plásmidos informadores pGZ3 en 50 l de medio de suero reducido en un tubo estéril. reSe obtuvieron 0,4 μg de vectores de expresión pGL-RS-PUF y 0,2 μg de plásmidos reporter pEZ-1B o pEZ-2F en 50 μl de medio de suero reducido en un tubo estéril.
  4. Después de 5 min de incubación a TA, mezclar suavemente el reactivo de transfección liposomal diluido preparado en la etapa 6.2 con los plásmidos diluidos preparados en la etapa 6.3. Incubar la mezcla durante 20 minutos a TA.
  5. Añadir todas las mezclas de transfección que contienen los vectores de expresión y el reactivo de transfección preparados en el paso 6.4 a cada pocillo e incubar durante al menos 12 h en un incubador humidificado a 37ºC y 5% de CO2.
  6. Después de 12 h en una incubadora humidificada a 37ºC y 5% de CO2, desechar el medio de cada pocillo y lavarlos con 500 mu l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) / pocillo.
  7. Deseche el PBS y añada 200 μl de tripsina a cada pocillo. Incubar la placa en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 5 min. Añadir 1 ml del medio para detener el diAdministrar y transferir las células a un tubo estéril de 1,5 ml.
  8. Centrifugar los tubos durante 3 min a 5.000 xg y descartar el medio. Añadir 0,5 ml de tampón de extracción de ARN por tubo para lisar las células mediante pipeteo repetitivo. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 min.
  9. Para cada muestra tratada con tampón de extracción de ARN, añadir 0,1 ml de cloroformo por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN. Invertir los tubos durante 15 s e incubarlos durante 3 min a RT.
  10. Centrifugar los tubos durante 15 min a 12.000 xg y 4 ° C. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir 0,25 ml de isopropanol por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN utilizado para la homogeneización inicial.
  11. Se mezclan agitando vorticialmente y se incuban a RT durante 10 min. Centrifugar los tubos a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, el precipitado de ARN es usualmente visible en el fondo del tubo.
  12. Desechar el sobrenadante y lavar el sedimento de ARN con 0,5 ml de etanol al 75% por 0,5 ml de tampón de extracción de ARN.
  13. Vórtice vigorosamente y centrifugar a 7,500 xg durante 5 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se seca la pastilla de ARN. Disolver el ARN en 50 μl de agua libre de RNasa.
  14. Añadir 2 μl de 5U / μL de DNasa I, 7 μL de tampón 10x y 11 μl de H2O a cada solución de 50 μl de ARN. Incubar los tubos a 37 ° C durante 1 h. Calentar a 70 ° C durante 15 min para inactivar la DNasa.
  15. Para cada muestra, añada los siguientes componentes a un tubo sin nucleasa de 0,2 ml: 1 μl de 50 μM de oligo dT, 5 μl de 400 ng / μL de ARN (2 μg), 1 μl de dNTP 10 mM y 3 μl de H 2 O. Realizar la PCR inversa.
    1. Calentar la mezcla a 65 ° C durante 5 min e incubar en hielo durante al menos 2 min para evitar la reforma de la estructura secundaria. Se añaden los siguientes componentes al mismo tubo: 4 μl de tampón de primera cadena 5x, 1 μl de DTT 0,1 M, 1 μL de 200 U / μL de transcriptasa inversa y 4 μL de H2 </ Sub> O. Mezclar pipeteando suavemente arriba y abajo y se incuba a 50 ° C durante 60 min. Detener la reacción por calentamiento a 70 ° C durante 15 min.
  16. Para cada muestra, añadir los siguientes componentes a un tubo de PCR con el fin de completar el etiquetado cuerpo-PCR: 2,5 l de 10x tampón de PCR, 0,5 l de 10 mezcla de dNTP mM, 1 l de cebador directo 10? M, 1 l de 10? M cebador inverso, 0,25 l de 5 ADN Taq U / l polimerasa, 0,5 l de 25 nM Cy5-dCTP, y 2! l del ADNc preparado en la etapa 6.15.
    1. Se calienta la reacción a 94 ° C durante 2 min para desnaturalizar las moléculas, lleve a cabo 25 ciclos de PCR (94 ° C durante 30 s, 60 ° C 30 s, y 72 ° C 30 s), mantener la reacción a 72 ° C durante 7 min, y luego dejarlo en un mantenimiento a 4ºC.
  17. Resolver los productos de PCR por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10% con una base 1x Tris, ácido bórico, y tampón de EDTA (TBE). Realizar un análisis usando un escáner de fluorescencia. Medir laCantidad de cada isoforma de empalme usando un software de densitometría.

7. Utilizar ESF para modular el empalme Bcl-x endógeno y medir sus efectos sobre la apoptosis

  1. Placa 2 x 105 células HeLa a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Cultivar las células durante la noche en 500 μ l de DMEM suplementado con 10% de FBS en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  2. Después de 12 h, se transfectan las células con 2 μg de pGL-Gly-PUF (WT) o 0,2 μg, 1 μg y 2 μg de pGL-Gly-PUF (531) (un dominio PUF reprogramado que reconoce Bcl-x pre- MRNA con alta afinidad, véase la Figura 2 A ).
  3. 24 h más tarde, cosecha las células. 1/3 de las células son para el aislamiento de ARN y análisis de PCR (pasos 6.8 - 6.17) y 2/3 son para el aislamiento de proteínas.
  4. Para el análisis de transferencia de Western, hervir los gránulos de células totales en tampón de carga 2X Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) durante 10 min, Y luego resolver las proteínas en un 12% SDS-PAGE gel. Transferir las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa.
  5. Bloquear la membrana con leche al 5% durante 1 h a RT e incubar los anticuerpos primarios de membrana O / N con Caspase-3 (1: 1.000), PARP (1: 1.000) o beta-actina (1: 5.000) 5% de leche) a 4 ° C.
  6. Lavar la membrana con PBS conteniendo 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 5 minutos a RT 3x en un agitador de balanceo. Incubar la membrana con anticuerpos unidos a HRP (1: 5.000, diluidos en leche al 5%) durante 1 h a RT.
  7. Lavar la membrana con PBS-T 3x a RT, y luego desarrollar la membrana utilizando reactivos de detección Western Blot de ECL.
  8. Añadir 250 μL de poli-L-lisina (PLL) sobre cubreobjetos, incubarlos durante 15 minutos a RT y sifonar el líquido. Lavar los cubreobjetos de vidrio recubiertos con PLL con PBS 3x durante 5 minutos cada uno. Para el ensayo de inmunofluorescencia que mide la apoptosis, siembra 5 x 105 células HeLa sobre cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-lisina en una placa de 6 pocillos. Transfect pGLF-Gly-PUF (WT) o pGL-Gly-PUF (531) en las células HeLa usando un reactivo de transfección liposomal (véanse los pasos 6.1 a 6.5).
  9. 24 h después de la transfección, fijar las células en los cubreobjetos con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en 1x PBS durante 20 min a RT. PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica; Manejarlo con cuidado en una campana extractora.
  10. Lavar suavemente las células en los cubreobjetos mediante la adición de 2 ml de 1x PBS. Incubarlos durante 5 min. Retire el PBS con pipetas. Repita el lavado 3x.
  11. Permeabilizar las células con 0,2% de Triton X-100 en 1x PBS durante 10 min, y luego lavarlas 3x con 1x PBS.
  12. Bloquear las células con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) en 1x PBS durante 10 min y lavarlas 3 veces con 1x PBS.
  13. Diluir el anticuerpo FLAG 1: 1.000 en BSA al 3% / PBS y pipetear 30 μl del anticuerpo FLAG diluido sobre una lámina de parafilm.
  14. Saque el cubreobjetos con las células, seque cuidadosamente el exceso de tampón con toallitas de laboratorio y colóquelo boca abajo (lado de la celda hacia abajo) sobre los 30 μL anti-FLAG solución. Incubar durante 1 h a TA.
  15. Añadir aproximadamente 500 l de 1x PBS a un lado del cubreobjetos se incubaron con el anticuerpo primario hasta que el cubreobjetos flota en la parte superior de la solución. Volver a la placa de 6 pocillos con 1x PBS en los pocillos.
  16. Lavar 3x con 1x PBS durante 5 min cada uno.
  17. Diluir el anticuerpo secundario anti-ratón (1: 500) en 3% BSA / PBS; de nuevo, utilizar 30 l para cada cubreobjetos. Ponga el cubreobjetos al revés en la solución de anticuerpo secundario e incubar durante 15 min a TA.
  18. Retire el cubreobjetos de la parafina, como se describe en el paso 7,15. Poner de nuevo en la placa de 6 pocillos y se lava con 1x PBS 3x durante 5 min cada uno.
  19. Montar los cubreobjetos con medio (con DAPI) de montaje, eliminar el exceso de medio, y sellar el borde con esmalte de uñas.
  20. Visualizar las células utilizando un microscopio de fluorescencia (con un aumento de 100X) y fotografiarlos usando una cámara digital.
    NOTA: La expresión del FSE se visualiza mediante la fluorescencia de labeled anticuerpo secundario contra la etiqueta FLAG, y la fragmentación nuclear se visualizaron usando tinción con DAPI.

8. Medir la apoptosis de las diferentes células cancerosas que expresan FSE

  1. Dividir 2 x 10 6 células HeLa, células MDA-MB-231, y las células A549 en placas de 60 mm con 4 ml de DMEM suplementado con 10% FBS en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 para detectar la apoptosis con propidio yoduro (PI) tinción.
  2. 24 h más tarde, volver a cargar el medio y preparar el lentivirus, como se informó anteriormente 24.
  3. Diluir (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), o pWPXld-GFP stocks-Gly-PUF pWPXld 10 x 10 6 lentivirus en 4 ml de medio fresco para hacer que la relación de virus al número de células igual a 5.
  4. Cambiar el medio en las placas a 4 ml de medio que contiene virus preparado en la etapa 8.3 y se incuban las placas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2. 12 h después de la infección, cambiar el medio.
  5. Después de 24 h de infección, recoger y teñir las células durante 5 min en una solución de PBS que contenía una concentración final de 2 mg / ml PI.
  6. Analizar las células PI-teñidas con un citómetro de flujo, como se ha descrito previamente 16.

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Resultados

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Este informe describe el protocolo completo para el diseño y construcción de ESF y reporteros de empalme. También describe la aplicación adicional de ESFs en la manipulación del AS de genes endógenos 16. Para ilustrar los resultados típicos de empalme cambios FSE mediada, se utilizan los datos de nuestro trabajo anterior como un ejemplo. El SESF con diferentes dominios funcionales se pueden utilizar para promover o inhibir la inclusión del exón casete de destino <...

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Discusión

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Este informe proporciona una descripción detallada para el diseño y construcción de los factores de empalme artificiales que pueden manipular específicamente el corte y empalme alternativo de un gen diana. Este método toma ventaja del modo de unión a la ARN única de PUF repite para producir un andamio de unión al ARN con especificidad personalizado. Se puede utilizar para activar o reprimir empalme.

El paso crítico en este protocolo es la generación del dominio PUF reprogramed que define la ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01-CA158283 y la subvención NSFC 31400726 a ZWYW es financiado por el Programa de Young Thousand Talents y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 31471235 y 81422038). XY es financiado por la fundación científica postdoctoral de China (2015M571612).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ADN polimerasa de alta fidelidad (Phusion High-Fidelity) con tampón de PCRNew England BiolabsM0530L
DNA ligasa (T4 DNA ligasa)New England BiolabsM0202L
Reactivo de transfección liposomal (Lipofectamine 2000)Invitrogen11668-019
Medio sérico reducido (Opti-MEM)Gibco31985-062
RNA tampón de extracción (reactivo TRIzol)El reactivo TRIzolambion15596018incluye fenol, que puede causar quemaduras. Use guantes cuando manipule
PBS (1x)Life Technologies10010-031
SuperScript III Anticuerpo de transcriptasa inversa (RT)Invitrogen18080044
Caspasa-3Tecnología de señalización celular9668
Anticuerpo PARPTecnología de señalización celular9542
Bcl-x anticuerpoBD Bioscience610211
anticuerpo de beta-actinaSigma-AldrichA5441
anticuerpo alfa-tubulinaSigma-AldrichT5168
anticuerpo FLAGSigma-AldrichF4042
Membrana de nitrocelulosaAmersham-PharmaciaRPN203D
ECL Western Blotting reactivos de detecciónInvitrogenWP20005
Cy5-dCTPGE HealthcarePA55021
Clasificador de células activado por fluorescencia (FACS)BD BioscienceFACSCalibur 
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)GE HealthcareSH30243.01
Suero fetal bovino (FBS)Invitrogen26140079
Yoduro de propidio (PI)SigmaP4170
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA7638-5G
Triton-X100PromegaH5142
Poly-L-Lisina SigmaP-4832Filtrar-esterilizar y almacenar a 4 & grados; C
Vector pWPXLdAddgene12258
Vector pMD2.GAddgene12259
Vector psPAX2Addgene12260
DNasa I (libre de RNasa)New England BiolabsM0303S
Oligo(dT)18 PrimerThermo ScientificSO131 
Anticuerpo secundario anti-ratón (Anti-ratón IgG, anticuerpo ligado a HRP)Tecnología de señalización celular7076S
de

Referencias

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