Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Resumen

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Resumen

Las células dendríticas (CD) reconocen estructuras extrañas de diferentes patógenos, como virus, bacterias y hongos, a través de una variedad de receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) expresados en su superficie celular y, por lo tanto, activan y regulan la inmunidad.

La función principal de las CD es la inducción de inmunidad adaptativa en los ganglios linfáticos mediante la presentación de antígenos a través de las moléculas MHC I y MHC II a los linfocitos T naïv. Por lo tanto, las CD tienen que migrar de la periferia a los ganglios linfáticos después del reconocimiento de patógenos en los sitios de infección. Para los experimentos in vitro o las estrategias de vacunación contra las CD, las CD derivadas de monocitos se utilizan de forma rutinaria. Estas células muestran similitudes en fisiología, morfología y función con las células dendríticas mieloides convencionales. Se generan mediante la estimulación de la interleucina 4 (IL-4) y del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) de monocitos aislados de donantes sanos. Aquí, demostramos cómo se aíslan y estimulan los monocitos a partir de sangre humana anticoagulada después del enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los monocitos humanos se diferencian en CD inmaduros y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico después de 5 días de incubación.

Introducción

Las células dendríticas (DC) son las más importantes células presentadoras de antígeno especializadas de nuestro sistema inmune. Inmaduros países en desarrollo (IDC) residen en la piel o en los tejidos de las mucosas y son, por tanto, una de las primeras células inmunes para interactuar con los patógenos invasores. DCs representan el puente entre el innato y el sistema inmune adaptativo ^1, ya que pueden activar células T y B respuestas después de la detección de patógenos. Además, contribuyen a la respuesta inmune pro-inflamatorias, debido a la secreción de grandes cantidades de citoquinas, tales como IL-1β, IL-6, y IL-12. DCs también activar las células N....

Protocolo

Ética declaración: Escrito se obtuvo el consentimiento de todos los donantes de sangre que participaron por el Instituto Central de Transfusión de Sangre y Departamento inmunológica, Innsbruck, Austria. El uso de las muestras sobrantes anónimos para fines científicos fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Innsbruck.

1. enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

1. La concentración de las PBMC por centrifugación.
   1. Abra la bolsa de sangre y la sangre dividida en tubos de centrífuga de 50 ml estériles de acuerdo con la cantidad de sangre recibida.
   2. Si es necesario,....

Resultados

Después de la centrifugación de la sangre anticoagulada usando un colchón de sacarosa, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se enriquecen en una interfase en la parte superior del medio de gradiente de densidad (Figura 1). Después de que los PBMCs se extraen, el análisis FACS se realiza para caracterizar las diferentes poblaciones de células dentro de los PBMCs utilizando marcadores de linaje (por ejemplo, CD3 para los linfocitos T, CD14 para m.......

Discusión

Este protocolo describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) a través del aislamiento de los monocitos humanos de sangre anticoagulada utilizando un ensayo basado en nanopartícula magnética. En este protocolo, las etapas de centrifugación se llevan a cabo aguas arriba del procedimiento de aislamiento de células, lo que conduce a un enriquecimiento de la fracción de PBMC. Aunque las células se pierden durante la centrifugación, para superponer el contenido de una bolsa de sangre entera en u.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratón APC Anti-Humano CD19 Clon HIB19 BD	Biosciences	555415
Ratón APC Anti-Humano CD83 Clon HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Humano CD14 Partículas Magnéticas	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Fracción de Albúmina V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plate	Costar	3506
Medios de gradiente de densidad: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10  ml Pipeta Serológica	Corning	357551
Falcon 25  ml Pipeta Serológica	Corning 357525
Falcon 50  ml Tubo de centrífuga PP de alta claridad	Corning	352070
Falcon Tubos de fondo redondo	Corning	352054
FITC Ratón Anti-humano CD3 Clon HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Reactivo de viabilidad celular)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
FBS (suero fetal bovino) inactivado por calor, origen aprobado por la UE (América del Sur)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Tampón de aislamiento: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
solución de L-glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
Ratón PE Anti-humano CD14 Clon M5E2	BD Biosciences	555398
PE Ratón Anti-Humano CD209 Clon DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medio	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020