Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.
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Artículo de método
Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte
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Resumen
Resumen
Las células que mueren por apoptosis, también se hace referencia a la muerte celular como regulado, adquirir múltiples nuevas actividades que les permiten influir en la función de células vivas adyacentes. actividades vitales, como la supervivencia, proliferación, crecimiento y diferenciación, son algunas de las muchas funciones celulares modulados por las células apoptóticas. La capacidad de reconocer y responder a las células apoptóticas que parece ser una característica universal de todas las células, independientemente de linaje u órgano de la originación. Sin embargo, la diversidad y complejidad de la respuesta de las células apoptóticas mandatos que un gran cuidado en la disección de los eventos de señalización y vías responsables de un resultado en particular. En particular, hay que distinguir entre los múltiples mecanismos por los que las células apoptóticas pueden influir en vías de señalización intracelular en las células que responden viables, incluyendo: el reconocimiento del receptor mediada de la célula apoptótica, la liberación de mediadores solubles por la célula apoptótica, y / o el acoplamiento de la phagomaquinaria cytic. Aquí, proporcionamos un protocolo para la identificación de los eventos de señalización intracelulares que son inducidos en células de respuesta viables después de su exposición a células apoptóticas. Una ventaja importante del protocolo se encuentra en la atención que se presta a la disección del mecanismo por el cual las células apoptóticas modulan los eventos dentro de células que responden de señalización. Mientras que el protocolo es específico para una línea condicionalmente inmortalizadas riñón de ratón proximal célula tubular (células BU.MPT), que se adapta fácilmente a las líneas celulares que no son de origen epitelial y / o derivados de los órganos distintos del riñón. El uso de células muertas como estímulo introduce varios factores únicos que pueden obstaculizar la detección de eventos de señalización intracelular. Estos problemas, así como las estrategias para minimizar o eludir ellos, se discuten dentro del protocolo. La aplicación de este protocolo debe ayudar a nuestra creciente conocimiento de la gran influencia que las células muertas o moribundas ejercen sobre sus vecinos en vivo, tanto en la salud y en el diseÃse.
Introducción
La apoptosis, o muerte celular regulada 1, contribuye de manera esencial al mantenimiento y desarrollo de los tejidos. Vistos los que más simplemente, permisos de apoptosis de edades, dañados, o el exceso de células para ser eliminados sin causar daño a los tejidos circundantes 2,3. La contribución de la apoptosis a la homeostasis del tejido, sin embargo, es considerablemente más dinámica y variada. Las células que mueren por apoptosis adquieren múltiples nuevas actividades, tanto secretada y asociada a las células, lo cual les permite influir en la función de las células vivas adyacentes 4-10. Estudios anteriores se centraron en la capacidad de las células apoptóticas para suprimir la inflamación 11-16, pero las células apoptóticas también modulan una amplia gama de funciones celulares, incluyendo las actividades vitales como la supervivencia 4,9,10, la proliferación 4,9,10, diferenciación 17, la migración 18, 19 y crecimiento. Además, estos efectos no se restringen a los fagocitos profesionales, como macrófagoss, sino que se extienden a prácticamente todos los tipos y linajes de células, incluyendo las células tradicionalmente no fagocíticas, tales como células epiteliales y endoteliales 7,9,10,18-21.
La respuesta específica de células vivas adyacentes después de la exposición a las células apoptóticas depende de múltiples factores que se relacionan con las dos células que responden viables y las propias células apoptóticas. Por ejemplo, aunque la exposición a células apoptóticas inhibe la proliferación tanto de macrófagos murinos y las células epiteliales tubulares proximales renales (PTECs), estos dos tipos de células difieren drásticamente en su respuesta de supervivencia a las células apoptóticas 4,6,9,10. Las células apoptóticas promueven la supervivencia de los macrófagos, pero inducen la muerte apoptótica de PTECs 4,6,9,10. En particular, la respuesta a las células apoptóticas puede diferir incluso entre células de responder del mismo linaje, en función de órgano de la célula de responder de origen 10 (por ejemplo, PTECs renales frente epiteliales mamariascélulas) o estado de activación 22 (por ejemplo, neutrófilos). Por el contrario, las células apoptóticas pueden evocar respuestas diferentes en la misma célula en función de la naturaleza de la apoptosis de estímulo 10,23 o la etapa de la apoptosis 10,14.
Dada la diverseness y la complejidad de la respuesta de las células apoptóticas, el gran cuidado debe ser tomado en la disección de los eventos de señalización y vías responsables de un resultado en particular. En primer lugar, las respuestas que requieren interacción física directa entre las células apoptóticas viables y deben diferenciarse de los provocados por los mediadores solubles liberados o generados por la célula apoptótica 3,6-10. Si se requiere la interacción física, a continuación, una mayor diferenciación debe ser realizada. eventos de señalización pueden depender de reconocimiento mediado por receptor de la célula apoptótica, independiente de inmersión posterior, o en la absorción fagocítica, independiente del receptor específico que se une la célula apoptótica 3-7,9,10,19. En el último caso, la respuesta no es específico de las células apoptóticas, y puede ser activado por cualquier material fagocítica 4,6.
La importancia de estas distinciones de nuevo puede ser apreciado por contrastar las respuestas de los macrófagos y PTECs renales. Para ambos tipos de células, la exposición a células apoptóticas altera la actividad de la pro-supervivencia quinasa Akt. La modulación es dependiente de la interacción física, ya que la separación de responder y células apoptóticas por una membrana de policarbonato de 0,4 micras suprime la respuesta 4,9,10,19. Sin embargo, la respuesta de PTECs es mediada por el receptor e independiente de la fagocitosis, mientras que la respuesta de los macrófagos es impulsado por fagocitosis 4,9,10,19. Esta conclusión se refuerza por el hecho de que la exposición a perlas de látex, un estímulo fagocítica neutral, no tiene ningún efecto sobre la actividad de Akt en PTECs, pero imita el efecto de las células apoptóticas en los macrófagos 4,9.
"> Aunque menos bien estudiado, las células que mueren por necrosis o muerte celular accidental 1, también modulan la función de las células viables en las inmediaciones 3-10,19. Como las células apoptóticas, las células necróticas ejercen sus efectos a través de una variedad de mecanismos, en particular la fuga del contenido intracelular a través de su membrana celular roto 3,5,6,9,24. Muchas células, incluyendo macrófagos y PTECs, poseen receptores que no compiten distintos para las células que mueren por necrosis 5,9. el acoplamiento de estos receptores induce eventos de señalización que son menudo opuesto a las inducidas por el acoplamiento de los receptores de las células apoptóticas 4-10,19. por ejemplo, en PTECs, las células necróticas aumentan la fosforilación de Akt, mientras que las células apoptóticas disminuyen fosforilación 9,10,19.A continuación, se describe un protocolo para la identificación de eventos de señalización intracelular inducidos en PTECs renales viables a través del reconocimiento mediada por el receptor de PTECs apoptóticas adyacentes 9,10,19. Mientras que el protocolo es específico para una línea celular inmortalizada condicionalmente PTEC conocidas como células BU.MPT 9,10,19,25,26, que se adapta fácilmente a las líneas celulares que no son de origen epitelial y / o derivados de órganos distintos el riñón. Es importante destacar que el uso de células apoptóticas como un estímulo celular plantea ciertas dificultades experimentales inherentes que no están presentes con ligandos solubles. La más importante de ellas es que las células apoptóticas se deben añadir en forma de suspensión en lugar de como una solución. Estas dificultades, así como las estrategias para minimizar o eludir ellos, se discuten dentro del protocolo. Casi todas las técnicas descritas en el protocolo son sencillos y estándar para el cultivo de células. La ventaja de este protocolo reside en su atención a los múltiples mecanismos por los que las células apoptóticas modulan la transducción de señales dentro de las células que responden. Estos mecanismos incluyen la unión a través de determinantes de superficie o moléculas puente a receptores específicos en la repondiente celular, la liberación de mediadores solubles, y / o la participación de la maquinaria de fagocitosis. Las células necróticas se incluyen en todos los experimentos para garantizar que los resultados son específicos para el modo de muerte celular, y no una respuesta generalizada a las células muertas. Un enfoque cuidadoso, como se recomienda en este protocolo, es fundamental para nuestra comprensión de la influencia cada vez más amplio que las células que mueren ejercen sobre sus vecinos en vivo, tanto en la salud y la enfermedad.
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Protocolo
1. Preparativos
Nota: En este protocolo, dos o más líneas celulares o cultivos celulares primarios, se preparan de forma independiente bajo condiciones específicas. Estas preparaciones incluyen células apoptóticas (Protocolo 1), células necróticas (Protocolo 2), y las células que responden sanos (Protocolo 3). Después de la preparación independiente, se añaden células apoptóticas o necróticas para las células que responden y la transducción de la señal resultante se supervisa (Protocolos 4, 5, y 6).
- Preparar los medios de cultivo y reactivos
- Preparar 500 ml de medio de cultivo A (para el uso al crecer las células en condiciones permisivas, véase la sección 1.2) mediante la combinación de los siguientes: de 1x Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) que contiene 4,5 g / l de glucosa, 584 mg / L ʟ-glutamina, 110 mg piruvato / L de sodio, 100 unidades / ml de penicilina-estreptomicina, 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS), y 10 unidades / ml de interferón-γ (IFN-γ).
- Preparar 500 ml de medio de cultivo B (para uso WHen suero de las células de hambre en condiciones no permisivas, véase la sección 1.2) omitiendo FBS y IFN-γ a partir de la receta del medio de cultivo A. Para hacer crecer las células en condiciones no permisivas (antes de la privación de suero), añadir 10% v / v FBS al medio de cultivo B.
- Preparar 0,4% (v / v) de paraformaldehído, pH 7,2, en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x (DPBS) a partir de 4% stock paraformaldehído para la fijación de las células muertas.
Nota: El paraformaldehído es tóxico, y apropiado se debe tener precaución en su uso.
- BU.MPT células de cultivo
- Descongelar del nitrógeno líquido de un vial de células BU.MPT.
Nota: BU.MPT es una línea de riñón de ratón proximal de células epiteliales tubulares (PTEC) derivado de un ratón transgénico que lleva un (ts) mutación sensible a la temperatura (tsA58) del antígeno tumoral grande de SV40 (TAg) bajo el control del ratón importante complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) H-2K b clase I promotor 25,26. - células de la placa en poliestir estériltratados platos de cultivo de tejidos eno de plasma con gas al vacío (~ 5 x 10 6 células por placa de 100 mm de diámetro).
- Se cultivan las células en condiciones permisivas en un humidificado 5% (v / v) CO 2 atmósfera.
Nota: Las condiciones permisivas, que se definen como de cultivo a 33 a 37 ºC en presencia de IFN-γ, permiten la expresión estable del transgén mutado TAg-tsA58. A diferencia de los cultivos primarios de PTEC riñón de ratón, que no sobreviven más de un solo paso o dos, BU.MPT cultiva bajo condiciones permisivas pueden ser pasados de manera indefinida.- Células de paso al menos tres veces después de la descongelación antes de usarlos en un experimento.
- Para células de paso, añadir 1 ml de 0,05% de tripsina por plato 100 mm, y se incuban en un humidificado 5% (v / v) CO 2 atmósfera a 37 ºC durante 5 min. Neutralizar la tripsina mediante la adición de 10 ml de medio A. Aspirar las células desprendidas, y dividir 1: 3 a 1: 5 en nuevos 100 mm TISS tratado estéril de poliestireno con gas al vacío de plasmaplacas de cultivo de la UE. Añadir un medio para llevar el volumen hasta un total de 10 ml por placa de 100 mm.
- Células de paso al menos tres veces después de la descongelación antes de usarlos en un experimento.
- En la preparación para uso experimental como de responder las células, cultivar las células hasta la confluencia en un humidificado 5% (v / v) de atmósfera de CO 2 bajo condiciones no permisivas (es decir, a 39 ºC en ausencia de IFN-γ [medio B que contiene 10% v v FBS]). /
Nota: En condiciones no permisivas, la expresión del transgén mutado TAg-tsA58 se inhibe por> 95%, y las células BU.MPT comportan como cultivos primarios de PTEC riñón de ratón.
- Descongelar del nitrógeno líquido de un vial de células BU.MPT.
2. Preparación de células apoptóticas BU.MPT (Protocolo 1)
Nota: Este protocolo es específico para células BU.MPT como la fuente de células apoptóticas, y estaurosporina como el método de inducción de la apoptosis. Alternativamente, otra línea celular, o cultivo de células primarias, se pueden utilizar como una fuente de células apoptóticas, con la apoptosis inducida por protoco estandarizadols para ese tipo de célula particular y el método de inducción de la apoptosis.
- Después del paso a 100 mm de diámetro platos de cultivo de tejidos tratada con plasma con gas al vacío de poliestireno estéril, las células crecen BU.MPT hasta la confluencia en un humidificado 5% (v / v) atmósfera de CO 2 en condiciones permisivas (es decir, a 37 ºC en medio de cultivo A en 10 ml por placa de 100 mm), como se describe en la sección 1.2.3.
- Enjuagar la monocapa de células adherentes tres veces con medio de cultivo B, utilizando 10 ml por enjuague.
- Inducir la apoptosis mediante la incubación de las células en medio de cultivo B que contienen estaurosporina, un inhibidor de proteína quinasa no selectivo, a 1 mg / mL durante 3 h en un humidificado 5% (v / v) CO 2 atmósfera a 37 ºC.
- Aspirar el medio que contiene estaurosporina que contiene "flotantes" células apoptóticas que se han desprendido de la monocapa. Centrifugar este medio durante 10 min a 500 xg, desechar el sobrenadante, lavar el precipitado tres veces con medio de cultivo B, yañadir el pellet de nuevo a las células recogidas en el paso siguiente, 2.5.
- Separar las células adherentes restantes de los pasos 2.3 y 2.4 mediante la adición de 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético) EDTA en 1 x Ca 2 + - y Mg 2 + exento de DPBS a 1 ml por placa de 5 min. Aspirar el medio que contiene EDTA que contiene células apoptóticas unifamiliares, y poner en común las células separadas con los "flotantes" células apoptóticas desde el paso 2.4 en un tubo de poliestireno de centrífuga estéril de 15 ml.
- Lavar las células apoptóticas tres veces por centrifugación durante 10 min a 500 xg y resuspensión en 10 ml de 1x Ca + 2 - y Mg + 2 -free DPBS por lavado.
- Después del último lavado, suspender las células apoptóticas en medio de cultivo fresco en B ~ 5 x 10 6 células por ml antes de su uso para estimular las células que responden. Alternativamente, fijar las células apoptóticas lavados en 0,4% (v / v) de paraformaldehído en 1x DPBS durante 30 minutos, y luego lavar tres veces con la culturaB medio, antes de la suspensión en medio de cultivo B.
- Según el caso, confirmar la inducción de la apoptosis por citometría de flujo usando una preparación por separado de las células apoptóticas (o mediante la reserva de algunas células para este propósito), como se describió anteriormente 6,9,10,15.
Nota: las primeras apoptóticas tienen membranas celulares intactas, y aparecen como yoduro de propidio (PI), las células gramnegativas y anexina V-positivo de disminución de tamaño de las células (en relación con células viables). Fines de células apoptóticas tienen membranas celulares no intactos, y aparecen como células PI-positivas y anexina V-positiva de disminución de tamaño de las células. Utilizando el protocolo actual, preparaciones típicas contienen ~ 85% de apoptosis temprana y ~ 15% de células apoptóticas tardías. - Añadir células apoptóticas a BU.MPT células respondedoras (Protocolo 3) a una relación de células apoptóticas-a-respondedor de 1: 1, ya sea directamente o después de la fijación de células apoptóticas por 30 min con 0,4% (v / v) de paraformaldehído en 1x DPBS .
Nota: la fijación de las células apoptóticas antes de la estimulación de los socorristas debenno afectar a los resultados, a menos que los eventos de señalización observados se deben a la liberación de un mediador soluble (Tabla 1).
3. Preparación de las células necróticas BU.MPT (Protocolo 2)
Nota: Este protocolo es específico para células BU.MPT como la fuente de células necróticas, y la calefacción como el método de la inducción de necrosis. Alternativamente, otra línea celular, o cultivo de células primarias, se pueden utilizar como una fuente de células necróticas, con necrosis inducida por protocolos estandarizados para ese tipo de célula particular y método de inducción de necrosis.
- Después del paso a 100 mm de diámetro platos de cultivo de tejidos tratada con plasma con gas al vacío de poliestireno estéril, las células crecen BU.MPT hasta la confluencia en un humidificado 5% (v / v) atmósfera de CO 2 en condiciones permisivas (es decir, a 37 ºC en medio de cultivo A en 10 ml por placa), como se describe en la sección 1.2.3.
- Enjuagar la monocapa de células adherentes tres veces con medio de cultivo B, usando10 ml por enjuague.
- Separar las células por adición de EDTA 5 mM en 1 x Ca + 2 - y Mg + 2 -free DPBS a 1 ml por placa de 5 min. Aspirar el medio que contiene EDTA que contienen células desprendidas, y añadir la suspensión celular a un tubo de poliestireno de centrífuga estéril de 15 mL.
- Se lavan las células tres veces por centrifugación durante 10 min a 500 xg y resuspensión en 10 ml de Ca + 2 - y Mg + 2 -free DPBS por lavado.
- Después del último lavado, suspender las células en medio de cultivo fresco en B ~ 5 x 10 6 células por ml.
- Inducir la necrosis mediante el calentamiento de las células a 70 ºC durante 45 min en un baño de agua, vórtex suavemente la suspensión de células cada 10 min.
- Se incuban las células durante 2 h en un humidificado 5% (v / v) CO 2 atmósfera a 37 ° C. vórtice suavemente la suspensión celular cada 15 min.
- En su caso, confirmar la inducción de la necrosis por citometría de flujo usando una preparación separada de necélulas crotic (o mediante la reserva de algunas células para este propósito), como se describió previamente 6,9,10,15.
Nota: Las células necróticas se han roto las membranas celulares, y aparecen como células PI-positivo del aumento de tamaño de las células (en relación con células viables). Utilizando el protocolo actual, preparaciones típicas contienen ≥ 95% de células necróticas. Alternativamente, la inducción de la necrosis y la pérdida de integridad de la membrana se puede confirmar por tinción con azul tripán.
4. Preparación de las células de respuesta en BU.MPT (Protocolo 3)
Nota: Este protocolo es específico para células BU.MPT como la fuente de células de respuesta. Alternativamente, otra línea celular, o cultivo de células primarias, se pueden utilizar como células de respuesta. Antes de uso experimental, quiescencia puede ser inducida durante la noche por protocolos estandarizados dentro del laboratorio.
- Se cultivan las células BU.MPT en placas de cultivo tisular de 100 mm estériles en condiciones permisivas en medio de cultivo A en 10 ml por placa hasta que logran ~85% de confluencia.
- cultura Aspirar medio A, y enjuagar las células tres veces con medio de cultivo B en 10 ml por enjuague. Suero de comer a las células durante la noche durante 18 a 24 h en una atmósfera humidificada al 5% (v / v) de atmósfera de CO 2 en condiciones no permisivas (es decir, a 39 ° C en medio de cultivo B en 10 ml por placa), tal como se describe en la sección 1.2 0,4, con el fin de inducir la quiescencia. Alternativamente, las células de crecer en medio de cultivo B más 10% (v / v) FBS al 39 ºC durante un día antes de las células de suero de hambre durante toda la noche en medio de cultivo B sin FBS.
- Etiqueta de una placa de cultivo de tejidos separados de células confluentes BU.MPT para cada condición experimental.
- Incluir los siguientes seis condiciones: la estimulación de la respuesta BU.MPT viables con factor de vehículo o de crecimiento epidérmico (EGF) durante 15 minutos, después de su exposición durante 30 min a cualquiera sin células, células apoptóticas o células necróticas.
Nota: La exposición a las células muertas puede estimular o inhibir el nivel de actividad de un giVen molécula de señalización. La estimulación se detecta mejor por encima de una línea de base baja (por ejemplo, ausencia de EGF), mientras que la inhibición se detecta mejor a partir de una alta línea de base (por ejemplo, presencia de EGF). Dado que el efecto de la estimulación con las células muertas es a priori desconocida, se recomienda llevar a cabo todos los estudios tanto en la ausencia y la presencia de EGF.
5. La estimulación de las células que responden con apoptóticas y células necróticas (Protocolo 4)
- Aspirar el medio de cultivo B desde platos pre-etiquetados de reposo (sin suero) BU.MPT células de respuesta (Protocolo 3).
Nota: Después del cultivo durante la noche bajo condiciones no permisivas, las células BU.MPT debería comportarse como cultivos primarios de PTEC riñón de ratón. - Por placa de 100 mm, agregar 2 ml de uno de los siguientes: medio de cultivo B (sin células); suspensión de células apoptóticas en ~ 5 x 10 6 células por ml en medio de cultivo B (Protocolo 1); o suspensión de las células necróticas en ~ 5 x 10 6 células por mln medio de cultivo B (Protocolo 2).
- Distribuir la suspensión 2 ml de células muertas de manera uniforme sobre la placa de 100 mm, y tener el tiempo para que se asienten al mínimo. Para lograr esto, distribuir la gota de suspensión de células muertas a gota con una amplia punta de la pipeta sobre toda la superficie de los platos de células respondedoras. Utilizar un volumen de 2 ml como un compromiso entre reducir al mínimo el tiempo de estabilización y evitar la aglutinación de las células muertas.
Nota: El uso de una suspensión de células muertas como estímulo conlleva una serie de consideraciones especiales, que se describen a continuación en mayor detalle (Tabla 2 y Discusión). - Lograr una relación de célula-dead-a respondedor de ~ 1: 1 mediante la adición de 2 ml de células muertas en ~ 5 x 10 6 células por ml a un plato mm confluente 100, que contiene ~ 10 x 10 6 células. Alternativamente, con el fin de establecer la dependencia de la dosis de cualquier evento de señalización observadas, variar la relación de muertos a las células que responden de forma continua por dilución progresiva de cultoUre medio B de las suspensiones de células muertas preparadas en los Protocolos 1 y 2.
- Distribuir la suspensión 2 ml de células muertas de manera uniforme sobre la placa de 100 mm, y tener el tiempo para que se asienten al mínimo. Para lograr esto, distribuir la gota de suspensión de células muertas a gota con una amplia punta de la pipeta sobre toda la superficie de los platos de células respondedoras. Utilizar un volumen de 2 ml como un compromiso entre reducir al mínimo el tiempo de estabilización y evitar la aglutinación de las células muertas.
- Hacer girar suavemente los platos, a continuación, se incuba a 37 ° C en un humidificado 5% (v / v) de CO 2 atmósfera.
- Después de 30 min, estimular las células de respuesta con vehículo o 50 nM EGF, de acuerdo con la pre-etiquetado de la placa de cultivo.
- Incubar durante 15 min a 37 ° C en un humidificado 5% (v / v) CO 2 atmósfera.
- Lavar las células muertas mediante la adición de 5 ml de helado 1x DPBS, girando el plato, y aspirar el líquido de lavado. Repetir tres veces.
- Inmediatamente colocar los platos de células respondedoras en hielo para su posterior procesamiento.
- Preparar lisados celulares
- Preparar tampón de lisis celular que contiene lo siguiente: 1 × Tris solución salina tamponada (TBS), pirofosfato de sodio 10 mM, 0,5% w / v de desoxicolato, 0,1% w / v de SDS, 10% de glicerol, y fluoruro de sodio 25 mM.
- Inmediatamente antes de la lisis celular, añadir el siguiente en el orden exacto dado en la indconcentraciones icated: mini cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA (1 comprimido por 10 ml de tampón de lisis), 10% (v / v) de Triton X-100, ditiotreitol 1 mM (DTT), 1 mM fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF), y 10 ortovanadato de sodio mM.
- Añadir 700 l de tampón de lisis celular helada por 100 mm placa de células que responden recién estimulados en el hielo desde el paso 5.7. Raspar las células con un raspador de células, y transferir el lisado a pre-refrigerada 1,5 microtubos ml. Mantener los tubos en hielo durante 15 min.
- lisados Someter a ultrasonidos en hielo con 10 pulsos de 20 Hz, menos de un segundo cada uno de duración. Evitar la creación de espuma en la interfase gas / líquido, ya que esto puede sobrecalentar las muestras. sumerja completamente la sonda de ultrasonidos en los microtubos que contienen lisados antes de encender el aparato de ultrasonidos en, y encienda el aparato de ultrasonidos antes de retirar la sonda a partir de los lisados.
- Se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C, la transferencia de los sobrenadantes en microtubos fresca previamente enfriadaY se almacena a -70 ºC.
- Realizar electroforesis en gel e inmunotransferencia en sobrenadantes de lisados, como se describió anteriormente 6,9,10,15.
- Preparar tampón de lisis celular que contiene lo siguiente: 1 × Tris solución salina tamponada (TBS), pirofosfato de sodio 10 mM, 0,5% w / v de desoxicolato, 0,1% w / v de SDS, 10% de glicerol, y fluoruro de sodio 25 mM.
6. La prevención del contacto físico directo entre los objetivos y los equipos de respuesta Utilizando una membrana semipermeable de policarbonato (Protocolo 5)
- Preparar las células que responden BU.MPT arreglo al Protocolo 3, con una excepción; cultivar células en cultivo de tejidos de poliestireno estéril tratada agrupaciones de 12 pocillos.
- En los pozos seleccionados, colocar un sistema de soporte permeable que contiene una membrana de policarbonato de 0,4 micras para evitar la interacción física entre las células muertas y de respuesta. Incluir los pocillos de control sin una membrana en el mismo experimento.
- Aspirar el medio de cultivo B de los pozos experimentales de células respondedoras BU.MPT privadas de suero.
- Siga Protocolo 4 para la estimulación de las células que responden con células apoptóticas o necróticas, con las siguientes modificaciones:
- Por pocillo de la 1el grupo 2-bien, añadir 0,1 ml de una de las siguientes: medio de cultivo B (sin células); suspensión de células apoptóticas en ~ 5 x 10 6 células por ml en medio de cultivo B (Protocolo 1); o suspensión celular necrótica a ~ 5 x 10 6 células por ml en medio de cultivo B (Protocolo 2).
Nota: Como bien confluente de un grupo de 12 pocillos contiene ~ 0,5 x 10 6 células, la adición de 0,1 ml de células muertas en ~ 5 x 10 6 células por ml produce una relación de muertos-a-respondedor de células de ~ 1: 1. - A los pocillos que contienen el sistema de soporte permeable, añadir las células muertas en la parte superior de la membrana de policarbonato de 0,4 micras dentro del sistema de soporte permeable, por lo que no hay interacción física directa entre las células muertas y el respondedor.
- Por pocillo de la 1el grupo 2-bien, añadir 0,1 ml de una de las siguientes: medio de cultivo B (sin células); suspensión de células apoptóticas en ~ 5 x 10 6 células por ml en medio de cultivo B (Protocolo 1); o suspensión celular necrótica a ~ 5 x 10 6 células por ml en medio de cultivo B (Protocolo 2).
7. La inhibición de la fagocitosis con citocalasina D (Protocolo 6)
- Preparar las células que responden BU.MPT acuerdo con el Protocolo nº 3.
- Preparar el citoesqueleto inhibidor de la citocalasina D en DiMethil sulfóxido (DMSO) a 4 mg / ml (1,000 ×). Añadir platos para pre-marcados de células de respuesta BU.MPT ya sea 10 l de vehículo (DMSO) o 10 l de citocalasina D para lograr una concentración final de 4 mg / ml en 10 ml de medio de cultivo B.
Nota: A esta concentración de citocalasina D, la fagocitosis por las células BU.MPT y una línea celular de macrófagos fue inhibida por ≥90% 9,10. - Incubar durante 2 horas a 37 ºC en una atmósfera humidificada al 5% (v / v) CO 2 atmósfera.
- Siga Protocolo 4 para la estimulación de las células que responden con células apoptóticas o necróticas.
- En su caso, confirmar la inhibición de la fagocitosis de las células muertas mediante citometría de flujo usando una preparación por separado de las células muertas y de respuesta (o celdas reservadas para este fin), como se describió previamente 9,10.
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Resultados
En la Figura 1, se proporciona un esquema que representa las etapas de temporización y críticos implicados en la preparación de las células apoptóticas (Protocolo 1) y células necróticas (Protocolo 2) y la estimulación de las células que responden con suspensiones de células apoptóticas y necróticas (Protocolo 4).
En la Figura 2, proporcionamos resultados representativos que muestran el efecto...
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Discusión
Proporcionamos aquí un protocolo para la caracterización de los eventos de señalización intracelular inducidos en las células viables después de su exposición a células que experimentan apoptosis, u otras formas de muerte celular. El protocolo hace hincapié en los múltiples mecanismos por los que la exposición a las células apoptóticas pueden modular vías de señalización intracelular en las células que responden viables. Estos mecanismos incluyen: la interacción (a través de moléculas puente o determinantes de superfici...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado, en su totalidad o en parte, por fondos institucionales del Dr. José A. Arruda y la Sección de Nefrología de la Universidad de Illinois en Chicago (a J. S. L.); y fondos del Departamento de Medicina de la Universidad McGill y el Instituto de Investigación del Centro de Salud de la Universidad McGill (a J. R.)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| cultivo celular fuerte | |||
| , 1x con [4,5 g/L] de glucosa, ʟ-glutamina y piruvato de sodio | Mediatech (Manassas, VA) | 10-013-CV | |
| HyClone Fetal Clone II, suero fetal bovino | GE Healthcare (Logan, UT) | SH30066.03 | añadir un 10% (v/v) al medio de cultivo A |
| Penicilina-Estreptomicina-Glutamina, 100x | Life Technologies (Grand Island, NY) | 10378-016 | añadir 100 unidades/mL a los medios de cultivo A y B |
| γ-Interferón, recombinante de ratón, de Escherichia coli | Calbiochem, Millipore (Billerica, MA) | 407303 | añadir 10 unidades/mL al medio de cultivo A |
| Placas tratadas con poliestireno Falcon, no pirogénicas | Corning (Durham, NC) | 353003 | estériles, Tubos |
| centrífugos de poliestireno Falcon | Corning (Durham, NC) | 352095 | estéril, 15 mL |
| de tripsina-EDTA, 0.05%, Gibco | Fisher (Waltham, MA) | 25300062 | estéril, 100 mL |
| Name | Company | Catalog | Comments |
| químicos e inhibidores | |||
| Staurosporina, de Streptomyces sp. | Sigma (St. Louis, MO) | S4400 | uso en [1 μ g/mL] durante 3 h para inducir la apoptosis |
| Factor de crecimiento epidérmico (EGF), [1 mg/mL] | Millipore (Billerica, MA) | EA140 | uso a 50 nM para estimular las células respondedoras |
| UltraPure, 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies (Grand Island, NY) | 15575-038 | use 5 mM para separar las células adherentes |
| Solución de azul de tripano, 0.4% | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 91691049 | para la tinción de células muertas |
| Solución de paraformaldehído, 4% en DPBS | Affymetrix (Santa Clara, CA) | 19943 | uso de 0,4% (v/v) en 1x DPBS para la fijación |
| Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14040133 | solución salina |
| tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, Ca2+- y Mg2+ libre, 1x, Gibco | Life Technologies (Grand Island, NY) | 14190367 | solución madre |
| Citocalasina D, 4 mM en dimetilsulfóxido (DMSO), de Zygosporium mansonii | Sigma (St. Louis, MO) | C8273 | uso en [4 μ g/mL] para inhibir la fagocitosis |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma (St. Louis, MO) | D2650 | solvente para citocalasina D |
| [header] | |||
| Cell lysis buffer ingredients | |||
| Tris-buffered saline (TBS), 10x, pH 7.4 | BioRad (Hercules, CA) | 1706435 | para tampón de lisis celular |
| Pirofosfato | de sodioSigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 221368 | 10 mM para tampón de lisis celular |
| Desoxicolato de sodio | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D6750 | 0,5% p/v para tampón |
| de lisis celular Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | L3771 | 0,1 % p/v para tampón de lisis celular |
| Glicerol | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | G5516 | 10% para tampón de lisis celular |
| Fluoruro de sodio | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 450022 | 25 mM para tampón de lisis celular |
| Mini tableta de cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA completa | Roche Diagnostics (Indianápolis, IN) | 4693159001 | para tampón de lisis celular, 1 tableta por 10 mL de tampón |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T8787 | 10% para tampón de lisis celular |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 11DTT00005 | 1 mM para tampón de lisis celular |
| Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 4800263 | 1 mM para tampón de lisis celular |
| Ortovandato de sodio | MP Biomedicals (Santa Ana, CA) | 2159664 | 10 mM para tampón |
| de lisis celularNombre | Compañía | Catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Sorvall T6000B centrífuga | Du Pont (Wilmington, DE) | T6000B | |
| Fisher Tissuemat, baño de agua | Fisher (Waltham, MA) | ||
| Desmembrador sónico (sonicador), modelo 100 | Fisher (Waltham, MA) | ||
| MisceláneaCámara de recuento de | |||
| células, Neubauer | Hawksley (Lancing, Sussex, Reino Unido) | AC2000 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II | Millipore (Billerica, MA) | CBA059 | para la tinción de PI y anexina V para determinar el estadio de apoptosis |
| Tubos de microcnrífugo Eppendorf, 1,5 mL | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T9661 | |
| Soporte permeable Transwell, 0,4 μ m membrana de policarbonato | Corning (Corning, NY) | 3413 | estéril, poliestireno, cultivo de tejidos tratado |
| Nombre | Empresa | Catálogo | Comentarios |
| >Anticuerpos | |||
| Fosfoglucógeno sintasa quinasa-3&alfa;/β (GSK-3α/β) (Ser21/9), anticuerpo policlonal | Tecnología de señalización celular | 9331 | anticuerpo policlonal de conejo |
| Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) antocuerpo monoclonal ( (14C10) ) | Tecnología de señalización celular | 2118 | Anticuerpo monoclonal de conejo |
Referencias
- Galluzzi, L., et al. Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015. Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).
- Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective. Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a008748(2013).
- Reddy, S. M., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Immunol. 169, 702-713 (2002).
- Cvetanovic, M., Ucker, D. S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 172, 880-889 (2004).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity. J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).
- Cvetanovic, M., et al. Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity. J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).
- Birge, R. B., Ucker, D. S. Innate apoptotic immunity: the calming touch of death. Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).
- Patel, V. A., et al. Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses. J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).
- Patel, V. A., et al. Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis. J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).
- Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 390, 350-351 (1997).
- Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF. J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).
- Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion. J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).
- Ariel, A., et al. Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression. Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).
- Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes. Nature. 447, 869-874 (2007).
- Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response. Cell. 131, 1124-1136 (2007).
- Li, F., et al. Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration. Sci. Signal. 3, ra13(2010).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).
- Patel, V. A., et al. Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores. J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).
- Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes. Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2, ra51(2009).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nature Med. 13, 54-61 (2007).
- Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).
- Sinha, D., et al. Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).
- Wakasugi, K., Schimmel, P. Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase. Science. 284, 147-151 (1999).
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