Un experimental y el Protocolo de elementos finitos para investigar el transporte de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular

Resumen

Proponemos un protocolo para investigar el transporte de moléculas cargadas y descargadas a través del cartílago articular con la ayuda de métodos numéricos y experimentales desarrollados recientemente.

Resumen

La osteoartritis (OA) es una enfermedad debilitante que está asociada con la degeneración del cartílago articular y el hueso subcondral. Degeneración del cartílago articular deteriora su función de soporte de carga sustancialmente como se experimenta tremenda degradación química, es decir, proteoglicanos y colágeno pérdida de fibrillas de interrupción. Una forma prometedora para investigar mecanismos de daño químico durante OA es exponer los especímenes de cartílago a un soluto externo y controlar la difusión de las moléculas. El grado de daño del cartílago (es decir, la concentración y la configuración de las macromoléculas esenciales) se asocia con la pérdida de energía de colisión de solutos externos mientras se mueve a través de cartílago articular crea diferentes características de difusión en comparación con el cartílago sano. En este estudio, se introduce un protocolo, que consta de varios pasos y se basa en desarrollado previamente experimental micro-C14px; "> omputed T omography (micro-CT) y la modelización de elementos finitos el transporte de moléculas yodadas cargadas y no cargadas se registra primero utilizando micro-CT, que es seguido por la aplicación de modelos de elementos finitos multifásicas para obtener coeficientes de difusión bifásica-soluto y. y fija densidades de carga a través de zonas de cartílago.

Introducción

Transporte molecular juega un papel vital en la homeostasis de juntas de articulación, la entrega de la terapéutica para el cartílago articular y el cartílago de formación de imágenes de contraste mejorado ^{1, 2, 3.} Factores tales como la integración del cartílago y integridad, la carga de soluto y tamaño, así como la osmolalidad y la concentración de baño en contacto con el cartílago puede influir en la velocidad de transporte ^{4, 5, 6.} El transporte de solutos, ya sea neutros o con carga, puede ser diferente entre las zonas de cartílago articular, debido a que cada zona se compone de diferentes concentraciones y orientaciones de las principales moléculas de la matriz extracelular, es decir, los proteoglicanos (PGs) y colágeno de tipo II ^{1, 7, 8, 9,}lass = "xref"> ^{10, 11.} Más importante aún, el transporte de solutos cargados puede ser dependiente de la concentración de proteoglicanos que comprenden cargas fijas negativas dentro de la matriz extracelular que aumenta a través de cartílago articular ^{8, 9} altamente. Esos parámetros densidad de carga particularmente fija (FCD), orientación de las fibrillas de colágeno y variación del contenido de agua a través de cartílago pueden sufrir alteraciones como osteoartritis (OA) progresa, significando con ello la importancia de estudiar la difusión a través del cartílago.

En el estudio actual, un protocolo basado en estudios experimentales y computacionales previamente establecidos ^{6, 8, 9} se propone investigar con precisión de difusión en diversas condiciones de contorno utilizando solutos neutros y cargados en un modelo finito baño de difusión. Tpropuso métodos están compuestos de formación de imágenes micro-tomografía computarizada (micro-CT) de una sistema incluyendo el cartílago y una finito baño de apoyo de avanzada modelos de elementos finitos multifásicas bifásica-soluto y. Estos modelos permiten la obtención de los coeficientes de difusión de las moléculas neutras y cargadas, así como DME a través de varias zonas de cartílago articular. El uso de estos modelos, se puede obtener una mejor comprensión del comportamiento de las moléculas neutras y cargadas de difusión que podrían ser utilizados para investigar las interacciones entre cartílago y superponiendo finita baño.

Protocolo

NOTA: El protocolo que aquí se presenta se adoptó a partir de los procedimientos experimentales y computacionales de los últimos trabajos de investigación ^{6, 8, 9.} El protocolo se ilustra en la Figura 1.

Los materiales de cadáveres fueron recogidos con el permiso de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Utrecht.

1. La muestra y Bath Preparación

1. Taladrar tapones osteocondrales cilíndricos (diámetro de 8,5 mm) de cóndilos femorales equino de cadáver utilizando broca a medida (Figura 1) durante la pulverización tamponada con fosfato fría Saline (PBS) para evitar el sobrecalentamiento y el subsiguiente daño del cartílago.
2. De termocontracción los tapones osteocondrales con un plástico contracción de la manga para reducir al mínimo la difusión lateral de la bañera superposición.
   1. Montar el tapón osteocondral de cartílago en el the superior inicialmente dentro del manguito de contracción plástica y seguir soplando aire caliente a la misma. Agregar los trozos de algodón húmedo en la superficie del cartílago para evitar daños relacionados con el calor.
3. Preparar finitos-baños de (por ejemplo, 650 ml, 420 mM, el ioxaglato de peso molecular (MW) = 1.269 Da, carga = -1) solutos cargados y neutral (650! L, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) por separado.
4. Cargar las finitos-baños preparados en la superficie del cartílago usando una jeringa y colocar un tapón de corcho en la muestra envuelta para evitar la evaporación durante los experimentos a temperatura ambiente (Figura 2A). Para estudiar el transporte de solutos neutra, colocar el baño de iodixanol y estudiar el lugar el transporte de solutos cargados negativamente baño ioxaglato sobre la superficie del cartílago.

2. Imágenes y Procesamiento de Imágenes

1. Colocar las muestras envueltos aislados con el tapón de corcho en un soporte hecho a medida unido a la platina motorizada de un micro-CT. lugar tque muestra de manera que la superficie de cartílago cubierto con una solución de agente de contraste se enfrenta hacia arriba.
2. Escanear con el micro-CT (tamaño de vóxel de 40 × 40 × 40 m ^3, tiempo de exploración de 2 min, voltaje del tubo de 90 kV y la corriente del tubo de 180 μA) un campo de visión que consta de cartílago, la placa subcondral, y finita baño en varios puntos de tiempo hasta el estado de equilibrio (48 h) se alcanza (Figura 2A). El estado de equilibrio se alcanza cuando los valores de concentración no cambian con el tiempo.
3. Registrar las imágenes en 3D en diferentes puntos de tiempo sobre la base de la imagen inicial para facilitar el posicionamiento de la región de interés (ROI) utilizando el software del fabricante (por ejemplo, analizar).
4. Convertir el 3D reconstruido imágenes de micro-CT en 2D Tagged Image File Format (TIFF) pila antes de procesarlos utilizando el software del fabricante.
5. Globalmente segmento (ImageJ> Ajustar> Umbral) el cartílago del hueso subcondral y más dementira baño en el software.
6. Obtener el valor medio gris del cartílago en diferentes puntos temporales (ImageJ> Análisis> Medida) usando la máscara de cartílago generado en el paso anterior.
7. Dada la concentración del baño inicial y la concentración inicial de agente de contraste en el cartílago, utilizar una curva de calibración lineal para convertir los valores de gris promedio de la concentración real de solutos. Los datos anteriores apoyan el hecho de que los valores de gris mantienen una relación lineal con la concentración de agentes de contraste.
8. Trazar las concentraciones de soluto en comparación con los puntos de tiempo de experimentación.

3. Modelización Computacional

NOTA: La difusión en este problema se supone que tendrá lugar en 1D (a lo largo del eje z), que cumple con la condición de contorno experimental. Por lo tanto, la geometría se podría crear de forma arbitraria.

1. Construir modelos cartílago multizona basados ​​finito-Bath: 1) el cartílago que consiste en zona superficial (20% del espesor total del cartílago), zona media (50% del espesor total del cartílago) y zona profunda (30% del espesor total del cartílago) ¹² y 2) finita baño en Febio ^{13, 14} (Figura 2B).
2. Asignar las propiedades mecánicas y físicas de las diferentes zonas del cartílago y baño en Febio. el módulo de Young (10 MPa) se supone que es lo suficientemente alta para resistir la presión osmótica ejercida por el baño de suprayacente y por lo tanto proteger el cartílago de deformaciones excesivas.
   1. Utilice una permeabilidad hidráulica de 10 ^-3 mm ⁴ / Ns y la relación de Poisson de 0. Uso coeficiente de soluto difusión real del baño en las simulaciones ^{8, 9.}
3. Generar malla (elementos 8-nodo trilineal hexaedros) y refinarlo cerca de los límites (Figura 2B)class = "xref"> ^{8, 9.}
4. modelo bifásico-soluto
   1. Aplicar concentración inicial de soluto en el baño y eficaz de presión correspondiente a la misma. Mira la descripción de presión efectiva en ^{9, 15.}
   2. Ejecutar el modelo en modo transitorio para obtener la concentración de soluto frente a curvas de tiempo de acuerdo con los coeficientes de difusión prescritos en diferentes zonas del cartílago.
5. modelo multifásico
   NOTA: La fluctuación eléctrica entre el baño y el tejido se puede evitar mediante la adición de dos monovalentes contra-iones tanto para el baño y el tejido.
   1. Para los modelos de estado estacionario: utilizar las mismas presiones de fluido eficaces y las concentraciones en el cartílago y baño suprayacente al tiempo que aumenta FCD a su valor deseado.
   2. Para los modelos transitorios: crear un finito baño bien agitada, manteniendo el coeficiente de difusión de solutos en el baño suficientemente alta. inyectar elsoluto desde la interfaz de aire del baño en el baño para alcanzar su valor de concentración deseado.
   3. Transient: eliminar la condición de contorno concentración de soluto prescrito en el paso anterior y revertir el coeficiente de difusión de la finita baño a su coeficiente de difusión real.
   4. Ejecutar el modelo para obtener soluto curvas de concentración-tiempo basado en DME aplicadas y los coeficientes de difusión en diferentes zonas del cartílago.
6. Interfaz Febio-MATLAB
   1. Desarrollar un código MATLAB para realizar automáticamente la simulación en Febio y la trama curvas de concentración-tiempo (interfaz Febio-MATLAB) ^{8, 9.}
   2. Cambiar los coeficientes de difusión y los DME en las zonas de cartílago utilizando la interfaz Febio-MATLAB. Ejecutar modelos en Febio y extraer curvas de soluto de concentración-tiempo ^{8, 9.}
   3. Comparar el soluto obtenido las curvas de concentración-tiempo con el experimentaldatos y obtener conjuntos de coeficientes de difusión y los DME en diferentes zonas del cartílago basado en la raíz error cuadrático medio mínimo (RMSE) ^{8, 9.}

Figura 1: Configuración Experimental. A) procedimiento de extracción de la muestra usando una broca de taladro a medida. B) procedimiento de imágenes micro-CT para supervisar el proceso de difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Representación esquemática.A) Diseño experimental. B) modelo computacional multizona que consiste en el baño finita, las zonas superficiales, medias y profundas de cartílago y de malla asociado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Los resultados representativos que aquí se adoptan a partir de los trabajos de investigación anteriores ^{6, 8, 9, 16.}

En la OA, el cartílago articular sufre cambios significativos más importante la pérdida de la mordaza, y fibrillas de colágeno daño ^17,

Discusión

Nosotros presentamos un protocolo experimental combinado con un procedimiento de modelado de elementos finitos para estudiar la difusión de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular. De acuerdo con nuestros estudios recientes, los modelos propuestos podrían describir con precisión el transporte de ambos neutral (bifásica-soluto) y solutos (multifásicos) cargados negativamente a través de diferentes zonas de cartílago articular ^{8, 9.} Se cree ampl...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Agente de contraste con carga negativa
Visipaque	GE Healthcare	12570511	Nuetral
Agente de contraste PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Life technologies	10010023	Medio
micro-CT	Perkin Elmer		Monitoreo de difusión
Osmómetro de punto de congelación	Avanzado instrumentos		Solución de medición de osmolalidad