El uso de Ex Vivo Imaging entero de órganos y de tejidos Histología cuantitativa para determinar la bio-distribución de las moléculas marcadas con fluorescencia

Resumen

Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método rápido para determinar las concentraciones relativas de los compuestos marcados con fluorescencia dentro de y entre los tejidos o los grupos de tratamiento. Por el contrario, la histología de fluorescencia cuantitativa, mientras que más mano de obra, permite la cuantificación de los niveles tisulares absolutos de moléculas marcadas.

Resumen

Etiquetado fluorescente es un proceso bien establecido para examinar el destino de moléculas marcadas bajo una variedad de condiciones experimentales tanto in vitro como in vivo. Las sondas fluorescentes son particularmente útiles en la determinación de la bio-distribución de las moléculas grandes administrados, donde es probable que afecten a la cinética o bio-distribución del compuesto de la adición de un marcador fluorescente de molécula pequeña. Existe una variedad de métodos para examinar bio-distribución que varían de manera significativa en la cantidad de esfuerzo necesario y si las mediciones resultantes son totalmente cuantitativa, pero el uso de múltiples métodos en combinación puede proporcionar un sistema rápido y eficaz para el análisis de los bio-distribuciones.

Ex vivo de imágenes de todo el órgano es un método que se puede utilizar para comparar rápidamente las concentraciones relativas de las moléculas fluorescentes dentro de los tejidos y entre múltiples tipos de tejidos o grupos de tratamiento. El uso de un plat de imágenesformulario diseñado para animales vivos o de imágenes de todo el órgano, fluorescencia dentro de los tejidos intactos se puede determinar sin más trámite, ahorrando tiempo y mano de obra al tiempo que proporciona una imagen precisa de la bio-distribución general. Este proceso es ideal en los experimentos que tratan de determinar la especificidad de tejido de un compuesto o para la comparación de múltiples compuestos diferentes. la histología del tejido cuantitativa por otro lado requiere una amplia procesamiento adicional de los tejidos con el fin de crear una medida cuantitativa de los compuestos marcados. Para evaluar con precisión la biodistribución, todos los tejidos de interés deben ser cortadas, escanean y se analizaron en relación con las curvas de calibración con el fin de hacer comparaciones entre los tejidos o grupos. histología del tejido cuantitativa es el estándar de oro para determinar las concentraciones de compuestos absolutos dentro de los tejidos.

A continuación, describimos cómo ambos métodos se pueden utilizar juntos de manera eficaz para evaluar la capacidad de los diferentes métodos de administración de unand modificaciones compuestos de objetivo y administrar moléculas marcadas con fluorescencia para el sistema nervioso central ^1.

Introducción

etiquetado fluorescente es un método fácilmente utilizado y efectivo para determinar la biodistribución de los compuestos, utilizando una gama de equipos que es común a muchos laboratorios. Los fluoróforos están ampliamente disponibles, relativamente barato, y vienen en una variedad de longitudes de onda, de manera que múltiples moléculas de etiquetado se pueden utilizar simultáneamente sin interferencias. La mayoría de los fluoróforos tienen una gama de químicas para la conjugación con diferentes grupos reactivos en los compuestos de interés, y el proceso de conjugación es generalmente sencillo para la mayoría de tipos de sitios reactivos. Además, el equipo necesari....

Protocolo

NOTA: Todo el uso de animales en este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Mississippi Medical Center.

1. Tratamiento de Animales y Tejidos

1. Administración y Sacrificio
   1. Anestesiar los animales utilizando 3% de isoflurano durante 5 minutos y comprobar la profundidad de la anestesia mediante la observación de la ausencia del reflejo toe-pinch. Aplique un ungüento veterinaria para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
   2. Pesar el animal y pipetear una dosis de 50 mg / kg de marcado con rodamina, ya sea ELP, SynB1-ELP, o Tat-ELP ....

Resultados

Los datos siguientes describen la entrega de tres compuestos: un vector de suministro de fármacos conocidos como ELP y dos versiones de ELP modificado con péptidos que penetran en la célula (SynB1-ELP y Tat-ELP) ^9. Los tres compuestos se marcaron con tetrametilrodamina-5-maleimida y se entregan a través de dos vías de administración (IN y IV). El objetivo de estos experimentos era determinar qué compuesto y vía de administración resultaría en la mejor penetración en el sistema nervioso central (CNS) ^3.

Discusión

Si bien ex vivo de imágenes de todo el órgano es generalmente inmediata, la adhesión a algunos conceptos y técnicas básicas puede mejorar la precisión de las mediciones de la biodistribución. longitudes de onda corta de experiencia luz un alto grado de dispersión y absorción en la mayoría de los tejidos, lo que impacta significativamente la utilidad de los fluoróforos de longitud de onda corta. Estos fluoróforos tienen aplicación en estudios de tejidos profundos limitado, pero se han utilizado con eficacia en e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
la maleimida (p. ej., tetrametilrodamina-5-maleimida, AlexaFluor 633-C5-maleimida)	Thermo Fisher	T6027, A20342	Colorantes fluorescentes reactivos con tiol para el marcaje de proteínas
Tampón de fosfato	Sword 1002243569		PBS de solución salina para enjuague
Corte óptimo Compuesto de temperatura	Tissue-Tek	4585	utilizado para la congelación y el montaje
Equipo
IVIS Spectrum	Perkin Elmer		Para ex vivo imágenes de órganos enteros
Cryomicrotome	Thermo		Para crioseccionamiento
Escáner de portaobjetos de fluorescencia	Perkin Elmer		Para portaobjetos Escaneo

Fluoróforos derivados de