El uso de cristalografía de rayos X, Biofísica y Ensayos funcionales para determinar la célula T mecanismos que rigen el reconocimiento del receptor de antígenos del cáncer

Summary

Aquí, describimos los métodos que comúnmente empleamos en el laboratorio para determinar cómo la naturaleza de la interacción entre el receptor de células T y los antígenos tumorales, presentados por los antígenos leucocitarios humanos, gobierna la funcionalidad de las células T; estos métodos incluyen la producción de proteínas, la cristalografía de rayos X, la biofísica y los experimentos funcionales con células T.

Abstract

Se sabe que los linfocitos T (CTL) citotóxicos CD8+ humanos desempeñan un papel importante en el control de tumores. Para llevar a cabo esta función, el receptor de células T (TCR) expresado en la superficie celular debe reconocer funcionalmente los péptidos derivados de tumores (pHLA) restringidos por el antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, nosotros y otros hemos demostrado que la mayoría de los TCR se unen de manera subóptima a los antígenos tumorales. Descubrir los mecanismos moleculares que definen este escaso reconocimiento podría ayudar en el desarrollo de nuevas terapias dirigidas que eviten estas deficiencias. De hecho, las terapias actuales que carecen de esta comprensión molecular no han sido universalmente efectivas. Aquí, describimos los métodos que comúnmente empleamos en el laboratorio para determinar cómo la naturaleza de la interacción entre los TCR y el pHLA gobierna la funcionalidad de las células T. Estos métodos incluyen la generación de TCR solubles y pHLA y el uso de estos reactivos para la cristalografía de rayos X, el análisis biofísico y la tinción de células T específicas de antígeno con multímeros de pHLA. Utilizando estos enfoques y guiados por el análisis estructural, es posible modificar la interacción entre los TCR y el pHLA y luego probar cómo estas modificaciones afectan el reconocimiento de antígenos de células T. Estos hallazgos ya han ayudado a aclarar el mecanismo de reconocimiento de las células T de una serie de antígenos del cáncer y podrían dirigir el desarrollo de péptidos alterados y TCR modificados para nuevas terapias contra el cáncer.

Introduction

La cristalografía de rayos X ha sido, y seguirá siendo, una técnica extremadamente poderosa para entender la naturaleza de las interacciones ligando-receptor. Mediante la visualización de estas interacciones en detalle atómico, no sólo es posible divulgar los mecanismos moleculares que regulan muchos procesos biológicos, pero también es posible alterar directamente las interfaces de contacto de beneficio terapéutico. Junto con técnicas como la resonancia de plasmones superficiales y la calorimetría de titulación isotérmica (por nombrar sólo un par), tales modificaciones pueden ser analizados de vista biofísico para evaluar el impacto directo sobre la afinidad de unión, la cinética de interacción, y la termodinámica. Por último, mediante la realización de experimentos funcionales en los tipos de células relevantes, una imagen detallada del impacto molecular y funcional de las modificaciones a las interacciones receptor-ligando se puede extraer, proporcionando información sobre el mecanismo muy específico. En general, estos tipos de métodos proporcionan una imagen atómica resolución que permite al disuadir minación de cómo los sistemas biológicos trabajar, con las consiguientes repercusiones sobre los avances diagnósticos y terapéuticos.

Nuestro laboratorio utiliza rutinariamente estas técnicas para estudiar los receptores que median la inmunidad de células T humanas a los patógenos y cáncer, en la autoinmunidad, y durante el trasplante. Aquí, nos concentramos en la respuesta de células T CD8 ⁺ humano al cáncer, mediada por una interacción entre el receptor de células T (TCR) y los péptidos derivados del tumor restringido por el antígeno leucocitario humano (HLA) (pHLA). Esto es importante porque, aunque las células T CD8 ⁺ son capaces de dirigirse a las células cancerosas, nosotros y otros han demostrado previamente que los TCR contra el cáncer subóptima se unen a su pHLA afines ^{1, 2.} Por lo tanto, muchos laboratorios han intentado alterar o bien el TCR ^{3, 4, 5} o el ligando de péptido ^6,class = "xref"> ^{7, 8} con el fin de aumentar la inmunogenicidad y a mejores células de cáncer objetivo. Sin embargo, estos enfoques no siempre son eficaces y pueden tener efectos secundarios graves, incluyendo toxicidad fuera de objetivo ^{4, 9, 10.} La investigación adicional explorar los mecanismos moleculares que rigen el reconocimiento de las células T de los antígenos del cáncer será de vital importancia para superar estas deficiencias.

En el presente estudio, nos centramos en las respuestas contra células de melanoma autólogas de células T CD8 ⁺ específicas para un fragmento del antígeno de diferenciación de melanocitos glicoproteína 100 (gp100), gp100 _280-288, presentados por HLA-A * 0201 (el más comúnmente -expresada pHLA humano de clase I). Este antígeno ha sido un objetivo ampliamente estudiada para la inmunoterapia del melanoma y se ha desarrollado como un denominado péptido "heteroclitic" en el que una valina sustituye a la alaninaen la posición 9 de anclaje para mejorar la estabilidad pHLA ^11. Este enfoque se utilizó para mejorar la inducción de CTLs melanoma reactiva in vitro y se ha utilizado con éxito en ensayos clínicos ^12. Sin embargo, las modificaciones de los residuos de péptidos pueden tener efectos impredecibles sobre la especificidad de células T, demostrado por la pobre eficacia de la mayoría de los péptidos heterolitic en la clínica ^{6, 13.} De hecho, otra forma heteróclita de gp100 _280-288, en el que resto de péptido Glu3 sustituido por Ala, abrogó reconocimiento por parte de una población policlonal de gp100 _280-288 células T específicos de ^{14, 15.} Hemos demostrado previamente que incluso pequeños cambios en los residuos de péptido de anclaje pueden alterar sustancialmente el reconocimiento de las células T de manera impredecible ^{6, 16.} Por lo tanto, el estudio se centró en la construccióning una imagen más detallada de cómo las células T CD8 ⁺ reconocen gp100 y cómo las modificaciones de la interacción entre el TCR y pHLA podría afectar esta función.

Aquí, hemos generado formas muy puras, solubles de dos TCR específicas para gp100 _280-288 presentado por HLA-A * 0201 (A2-YLE), así como las formas naturales y alterados de pHLA. Estos reactivos se utilizaron para generar cristales de proteínas para resolver la estructura atómica ternaria de un TCR humano en complejo con la forma de heteroclitic A2-YLE, así como dos de los pHLAs mutantes en forma no ligada. A continuación, utiliza un enfoque de exploración de péptidos para demostrar el impacto de las sustituciones de péptidos de TCR mediante la realización de experimentos en profundidad biofísicos. Por último, hemos generado una línea de células T CD8 + genéticamente modificado, re-programado para expresar uno de los TCR-A2-YLE específica, con el fin de realizar experimentos funcionales para probar el impacto biológico de las diversas modificaciones de péptidos. Estos datos demuestran que incluso modificaciones al péptido residuos que se encuentran fuera del motivo de unión a TCR puede tener impredecibles efectos en cadena sobre los residuos peptídicos adyacentes que abroga la unión del TCR y el reconocimiento de las células T. Nuestros resultados representan el primer ejemplo de los mecanismos estructurales que subyacen en el reconocimiento de células T de esta importante diana terapéutica para el melanoma.

Protocol

1. Expresión de proteínas

1. Hacer construcciones génicas para la generación de TCR y pHLAs solubles, como se ha descrito en detalle previamente ^{17, 18.} Diseño de cada construcción con un 'BamH1 y un 3' 5 sitio EcoR1 de restricción para la inserción en el vector pGMT7.
2. Transformar coli Rosetta pLysS E. (DE3) con un vector de plásmido derivado de pGMT7 que contiene la secuencia que codifica la proteína de interés mediante la incubación de 1 l de 50 a 200 ng / l de plásmido con 5 l de E. coli durante 5 min a 4 ° C , 2 min a 42 ° C, y 5 min a 4 ° C, y la placa durante la noche a 37 ° C en una placa de agar LB suplementado con 50 mg / l de carbenicilina.
3. Recoger colonias individuales y crecer a 37 ° C y 220 rpm en 30 ml de medio TYP (16 g / L de triptona, 16 g / extracto de levadura L, y 5 g / L HK ₂ O ₄₎ suplementado con 100 carbenicilina mu M hasta que la suspensión alcanza una de ópticonsity (OD ₆₀₀₎ de entre 0,4 y 0,6.
4. Inducir la producción de proteína en un ml alícuota 5 mediante la introducción de 0,5 mM isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 h. Mantenga 20 l de suspensión con y sin inducción para electroforesis con dodecilsulfato sódico en gel de poliacrilamida análisis (SDS-PAGE) y teñir el gel.
5. Añadir cultivos iniciadores a 1 L de TYP suplementado con carbenicilina 100 mM y crecer células como se describe anteriormente en el paso 1.3 hasta que la suspensión alcanza un OD ₆₀₀ entre 0,4 y 0,6.
6. Inducir la expresión de la proteína durante 3 h con IPTG 0,5 mM. Centrifugar las células durante 20 min a 3.000 xg y se vierte el sobrenadante con cuidado.
7. Disolver el precipitado en 40 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 8,1; 10 mM de cloruro de magnesio, MgCl _2; NaCl 150 mM; y 10% de glicerol), se somete a ultrasonidos en hielo durante potencia 30 min a 60% utilizando intervalo de un 2 s , y se incuba a temperatura ambiente (RT) durante 30 min con 0,1 g / L de DNasa.
8. Se trata el SUSpensión que contiene las proteínas en forma de cuerpos de inclusión (IB) con 100 ml de tampón de lavado (0,5% de Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; NaCl 100 mM; y EDTA 10 mM).
9. Centrifugar la muestra durante 20 min a 4 ° C y 8.000 xg y se vierte el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender el precipitado en 100 ml de tampón de resuspensión (Tris 50 mM, pH 8,1; NaCl 100 mM; y 10 mM EDTA, pH 8,1), se centrifuga como antes a 8000 xg, y se vierte fuera el sobrenadante con cuidado.
10. Finalmente, disolver el precipitado en 10 ml de tampón de guanidina (6 M de guanidina; 50 mM de Tris, pH 8,1; EDTA 2 mM, pH 8,1, y NaCl 100 mM) y medir la concentración de proteínas a 280 nm usando un espectrofotómetro.

2. pHLA y TCR replegamiento

1. Para los repliega pHLA, la mezcla 30 mg de HLA-A2 (o HLA-A2 con una etiqueta de biotina) IBs, 30 mg de β2m IBs, y 4 mg de péptido durante 30 minutos a 37 ° C en un baño de agua en un volumen final de 6 ml de tampón de guanidina con ditiotreitol 10 mM(TDT).
2. Iniciar replegamiento de proteínas mediante la dilución de la mezcla anterior en 1 L de un tampón de HLA de replegamiento pre-enfriado (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM de L-arginina; EDTA 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; y cistamina 4 mM).
3. Dejar el HLA repliegue de agitar a 4 ° C durante 3 h y luego se transfiere en una kDa MWCO 12,4 (peso molecular de corte) del tubo de diálisis y se dializa dos veces durante 24 h contra 20 L de Tris 10 mM, pH 8,1.
4. Para los repliega TCR, la mezcla 30 mg de TCR de cadena α IBs y 30 mg de TCR de cadena β IBs durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua en 6 ml de tampón de guanidina suplementado con DTT 10 mM.
5. Iniciar replegamiento de proteínas mediante la dilución de la mezcla de TCR desnaturalizado en 1 L de un tampón de TCR replegamiento pre-enfriado (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea; EDTA 2 mM, pH 8,1; cisteamina 6 mM; y cistamina 4 mM) durante 3 marido.
6. Transferir el replegamiento en un tubo de diálisis 12,4 kDa MWCO y diálisis dos veces durante 24 h contra 20 L de Tris 10 mM, pH 8,1.
7. Filtrar tanto el TCR o pHLA refedad utilizando un filtro de membrana de 0,45 micras para las etapas de purificación.

3. La purificación por Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)

1. Cargar la preparación de replegamiento filtrada (ya sea pHLA o TCR) en un 7,9 ml, 50 columna de resina de intercambio de aniones micras pre-equilibró con 20 ml de Tris 10 mM, pH 8,1 en un sistema de cromatografía flexible e intuitiva.
2. Eluir la proteína en 5 ml / min con un gradiente de sal (NaCl 0 a 500 mM en Tris 10 mM, pH 8,1, más de 8 volúmenes de columna) y recoger las fracciones de 1 ml.
3. Analizar las fracciones correspondientes a la proteína de interés por SDS-PAGE, en común las fracciones que contienen la proteína de interés juntos, y concentrarlos a 500 l con 10-kDa MWCO 20 o 10 kDa MWCO 4 por centrifugación durante 20 min a 4.000 xg , descartando el flujo a través.
4. Cargar las preparaciones de proteínas concentradas en un bucle de 2 ml por inyección en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño de 24 ml pre-equilibrada con la aplicacióntampón ropriate elución: solución salina tamponada con fosfato (PBS), HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4; NaCl 150 mM; mM EDTA 3,4, y 0,005% de tensioactivo), o tampón de cristal (10 mM Tris, pH 8,1, y NaCl 10 mM ).
5. Eluir las proteínas a una velocidad de flujo de 0,5 mL / min durante 1 volúmenes de columna; recoger fracciones de 1 ml que contenían la proteína de interés verificado por SDS-PAGE.
   NOTA: Estos métodos se utilizaron para generar los TCR solubles PMEL17 TCR y gp100, así como todos los pHLAs utilizados en este estudio: HLA-A * 0201 con YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), o YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Superficie Plasmon Resonance (SPR) Análisis

1. Realizar análisis de unión en equilibrio, o análisis termodinámico utilizando un sistema de análisis de la interacción molecular, equipado con un chip sensor CM5 ^19.
2. Activar el chip CM5 por fsi- una mezcla 1: 1 de 100 mM de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 3- mM 1-etil-(3-dimetilpropil) -carboiimide 400 (EDC) durante 10 min a un caudal de 10 l / min y a 25 ° DO.
3. Cargar aproximadamente 5000 unidades de respuesta (RU) de estreptavidina (110 l de 200 g / ml en acetato 10 mM, pH 4,5) por unión covalente a la superficie del chip en todas las cuatro celdas de flujo y el uso de 100 l de clorhidrato de etanolamina 1 M para desactivar cualquier grupo reactivo restante.
4. Pareja de aproximadamente 500 a 600 RU de pHLA, en ~ 1 mM en tampón comercial (proporcionado por el fabricante), al chip sensor CM5 a una velocidad de flujo lenta de 10 l / min para asegurar una distribución uniforme sobre la superficie del chip.
5. Saturar la superficie del chip con biotina 1 mM en tampón comercial (proporcionado por el fabricante) durante 60 s.
6. Inyectar diez diluciones en serie de los TCR solubles más de las células de flujo correspondientes a una alta velocidad de flujo de 30 l / min a 25 ° C.
7. Calcular la constante de unión de equilibrio de(K _D (E)) valores usando un ajuste no lineal de la curva (y = (P1X) / (P2 + x)) ^20.
   NOTA: Las unidades de respuesta y =, x = concentración analista, P1 = r _max, P2 = _KD.
8. Realizar un análisis de la cinética suponiendo una relación 1: 1 de unión de Langmuir y ajustar los datos utilizando un algoritmo de ajuste mundial en el paquete de software ^2.
9. Realizar termodinámica experimentos mediante la repetición de este método a las siguientes temperaturas: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, y 30 ° C ^19.
10. Utilice los valores K _D determinados por SPR a diferentes temperaturas para calcular? G ° utilizando la ecuación termodinámica estándar (? G ° = -RTlnK _D) ^19.
    NOTA: R = constante de los gases, T = temperatura en K, ln = logaritmo natural.
11. Calcular los parámetros termodinámicos de acuerdo con la ecuación de Gibbs-Helmholtz (? G? H ° = - TΔS °) ^19.
12. Trazar las energías de enlace libres,? G ° (? G ° = -RTlnK _D), en contra de la temperatura (K) usando una regresión no lineal para adaptarse a la ecuación de tres parámetros (y =? H + ΔCp * (x-298) -x * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) ^19.
    NOTA: y = temperatura en K, x =? G °.

5. calorimetría de titulación isotérmica (ITC)

1. Realizar CCI experimentos utilizando un calorímetro de titulación isotérmica. Inyectar 30 M pHLA en la célula calorímetro y la carga 210 M TCR soluble en la jeringa. Utilice las siguientes condiciones: tampón HEPES 20 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 150 mM.
2. Realizar 20 inyecciones de TCR, cada uno de un volumen de 2 l. Calcula? H y K _D utilizando el software de análisis.

6. La cristalización, Colección de datos de difracción, y el refinamiento del modelo

1. Realizar ensayos de cristalización utilizando un robot de cristalización.
2. Crecimiento de cristales de VAPo de difusión a 18 ° C a través de la técnica de la gota que se sienta en una placa de 96 pocillos con un depósito que contiene 60 l de tampón de cristalización (aguas madres) ^21.
3. Se concentra la pHLA soluble a aproximadamente 10 mg / ml (0,2 mM) en tampón de cristal por girando a 3.000 xg en un peso molecular de 10 kDa concentrador centrífugo de corte.
4. Para las estructuras co-complejo, mezclar el TCR y pHLA en una relación 1: 1 molar para obtener una solución de proteína a aproximadamente 10 mg / ml (0,1 mM).
5. Añadir 200 nL de pHLA solo, o el 1: 1 relación molar de mezcla de TCR y pHLA, a 200 nL de cada solución de reserva de la pantalla de cristalización usando un robot de cristalización y la puntuación para los cristales bajo un microscopio después de 24 h, 48 h, 72 h, y después una vez a la semana.
6. monocristales cosecha montándolos manualmente en crio-bucles bajo el microscopio y los crio-enfriar sumergiendo y su almacenamiento en nitrógeno líquido (100 K).
   NOTA: Los cristales de la carga tiene un poco de prácTice, y decidir que los cristales son lo suficientemente bueno para la recopilación de datos viene con la experiencia. Como regla general, cuanto más grande y más regular del cristal, mejor.
7. Recopilar datos en una corriente de gas nitrógeno a 100 K.
   NOTA: Estos datos se adquirió en el Diamond Light Source (DLS) instalación de sincrotrón nacional de ciencia en el Reino Unido.
8. Analizar los datos mediante la estimación de las intensidades de reflexión con xia2 utilizando tanto MOSFLM ²² y XDS paquetes de ^23, y luego escalar los datos con SCALA o sin rumbo ²⁴ y el paquete CCP4 ^25.
9. Resolver las estructuras con reemplazo molecular usando PHASER ^26.
10. Ajustar el modelo con FÚLICA ²⁷ y refinar el modelo con REFMAC5 ^28.
11. Preparar representaciones gráficas con PyMOL ^29.
12. Calcular los contactos utilizando el "contacto"programa en el paquete CCP4. Use un 4 Å de corte para de van der Waals contactos y un 3,4 Å de corte para los enlaces de hidrógeno y puentes de sal.
13. Calcular la superficie complementariedad con el programa "SC" en el paquete CCP4.
14. Calcular el ángulo de cruce del complejo TCR-pHLA, como se describe ^30.
    NOTA: Para este estudio, los datos de reflexión y coordenadas modelo final fueron depositados en la base de datos PDB (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V AP: 5EU6, A2-YLE AP: 5EU3, A2-YLE-3A AP: 5EU4, y A2 -YLE 5A-AP: 5EU5).

Results

El uso de los métodos descritos anteriormente, hemos generado TCR soluble (Tabla 1) y moléculas de pHLA para llevar a cabo un análisis en profundidad de reconocimiento molecular de gp100 _280-288 por las células T CD8 ^+. Un sistema de expresión de E. coli modificada se utilizó para generar insoluble IBs para cada cadena separada tanto del TCR (alfa y beta) y cadenas pHLAs (cadena α y β2m). Este método tiene la ventaja de ser relativamente barato y fácil de configurar y genera grandes rendimientos de proteína (100 a 500 mg / l de cultivo). Además, las proteínas insolubles son muy estables si se almacenan a -80 ° C. A continuación, utiliza una técnica de replegado y purificación bien establecida para generar proteínas funcionales, homogéneos, solubles. Este método es útil para generar proteínas para experimentos biofísicos, estructurales y celulares, así como reactivos que se pueden utilizar para el diagnóstico o terapéutica.

(Tabla 2). Este ensayo demostró que los residuos de péptido en la era de lo más importante para la unión del TCR. análisis de alta resolución de las afinidades de unión utilizando esta técnica son muy útiles para la determinación de los mecanismos biológicos que controlan las interacciones proteína-proteína, así como para el análisis de la afinidad de unión de moléculas terapéuticas.

A continuación, cristalizado un TCR soluble específico de melanoma (PMEL17 TCR) en complejo con un derivado de tumor pHLA modificado (A2-YLE-9V) para investigar el modo de unión a resolución atómica (Figuras 1 y 2 y en la Tabla 3). Estos experimentos proporcionan visualización directa de la interfaz de unión entre dos moléculas, providing información clave sobre los principios subyacentes a la interacción. Se realizó además un análisis termodinámico de la interacción utilizando tanto SPR y el CCI, revelando los aportes energéticos que permitieron (Figuras 3) de unión. Estos análisis fueron apoyadas además por una descripción de alta resolución de la huella de contacto entre las dos proteínas (Figura 4 y Tabla 4).

A continuación, resuelto las estructuras de moléculas de pHLA no ligados, presentando formas mutadas del péptido, revelando que un interruptor molecular podría explicar por qué algunas mutaciones abrogadas TCR de unión (Figuras 5).

En general, estas técnicas proporcionan nuevas datos que demuestran el mecanismo que explica cómo las células T reconocen un antígeno derivado de melanoma que es un objetivo importante para la terapéutica anti-cáncer. En términos más generales, estas técnicasse puede utilizar para investigar prácticamente cualquier interacción receptor-ligando, el descubrimiento de nuevos mecanismos biológicos que podrían ser objeto de nuevos avances terapéuticos.

Figura 1: Análisis gráfico de densidad. Los espectáculos columna izquierda omiten mapas en los que el modelo fue refinado en ausencia del péptido. la diferencia de densidad se contornea en el 3,0 sigma, contornos positivos se muestran en verde, y los contornos negativos son rojos. La columna de la derecha muestra el mapa observada en el 1,0 sigma (que se muestra como una malla gris alrededor de las representaciones del palillo de las cadenas de proteínas) después de refinamiento posterior utilizando restricciones de simetría no cristalográfica automáticos aplicados por REFMAC5. (A) El modelo para PMEL17 TCR-A2-YLE-9V con el TCR CDR3 bucles de color azul (cadena α) y naranja (cadena β) y el péptido en verde. (B) El modelo para A2-YLE conel péptido de color verde oscuro. (C) El modelo para A2-YLE-3A con el color naranja péptido (para A2-YLE-3A, había 2 moléculas en la unidad asimétrica, pero estos eran prácticamente idénticas en términos de mapas Omitir y densidad, por lo que sólo copiar 1 se muestra aquí). (D) El modelo para A2-YLE-5A con el péptido de color rosa. Reproducido con permiso de la referencia ^31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visión general de la PMEL17 TCR en el complejo con A2-YLE-9V. Representación (A) de la historieta del complejo TCR PMEL17-A2-YLE-9V. El TCR es de color negro; TCR bucles de CDR se muestran (rojo, CDR1α; verde oscuro, CDR2α; azul, CDR3α; amarillo, CDR1β; aqua, CDR2 ^6 ;; naranja, CDR3β); y el HLA-A * 0201 se representa en color gris. El péptido YLE-9V está representado por palos verdes. (B) de la superficie y se adhieren representaciones de residuos de la PMEL17 TCR bucles de CDR (codificado por colores como en A) que en contacto con la superficie A2-YLE (A2, gris; YLE-9V, palos verdes). La línea diagonal negro indica el ángulo de cruce de la TCR con respecto al eje largo del péptido YLEPGPVTV (46,15 °). (C) de contacto de la huella de TCR PMEL17 en la superficie A2-YLE-9V (A2, gris); púrpura y verde (superficial y palos) indican el HLA-A * 0201 y residuos de YLE, respectivamente, en contacto con los TCR gp100. De corte de 3,4 Å para los enlaces de hidrógeno y 4 Å de van der Waals contactos. Reproducido con permiso de Referencia 31. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis termodinámico de la PMEL17 interacción TCR-A2-YLE. (A) PMEL17 TCR de equilibrio de unión a respuestas a A2-YLE a los 5, 12, 18, 25, y 37 ° C a través de nueve a diez diluciones en serie de TCR. SPR datos en bruto y empotrados (suponiendo que 1: 1 de unión Langmuir) se muestran en el recuadro de cada curva y se usaron para calcular K _en K y _de valores usando un algoritmo global de ajuste (BIAevaluation 3.1). La tabla muestra la unión de equilibrio de (K _D (E)) y las constantes cinéticas de unión (K _D (K) = K _off / K _en) a cada temperatura. El equilibrio constante de unión (K _D, M) valores se calcularon utilizando un ajuste no lineal (y = (P1X) / (P2 + x)). (B) Los parámetros termodinámicos se calcularon según la ecuación de Gibbs-Helmholtz (? G? H ° = ° - TΔS °). Las energías de unión,? G ° (? G ° = -RTlnK _D), se representaron frente a la temperatura (K) usando una regresión no lineal para adaptarse a la ecuación de tres parámetros (y =? H ° + ΔCp ° * (x-298) -x *? S ° -x * ΔCp ° * ln (x / 298)). Entalpía (H °) y la entropía (TΔS °) a 298 K (25 ° C) se muestran en kcal / mol y se calcularon mediante una regresión no lineal de la temperatura (K) representan frente a la energía libre (? G °). Mediciones (C) isotérmica de titulación colorimétrica (ITC) para el PMEL17 interacción TCR-A2-YLE. Entalpía (H °) y la entropía (TΔS °) a 298 K (25 ° C) se muestran en kcal / mol. Reproducido con permiso de la referencia ^31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ong> Figura 4: El PMEL17 bucles CDR Focus on Péptido Residuos Pro4, Val7, y Thr8. (A) Representación esquemática de los contactos entre el péptido YLE-9V y los residuos de bucle PMEL17 CDR (código de colores como en la Figura 2A). Los números en la parte inferior del panel muestran los contactos totales entre el TCR y el péptido. (B) Los contactos entre la PMEL17 TCR y el péptido YLE-9V (palos verdes) que muestra el van der contactos Waals (negro líneas discontinuas) y enlaces de hidrógeno (líneas rojas de guiones) hechas por el TCR CDR3α (azul), CDR1β (amarillo) , CDR2β (aqua), y CDR3β (naranja) bucles. En el panel inferior es una vista cercana de los contactos entre YLE Pro4, Val7, y Thr8, respectivamente, y el bucle de residuos de CDR TCR (palos codificado con el color como en la figura 1A). De corte de 3,4 Å para los enlaces de hidrógeno y 4 Å de van der Waals contactos. Reproducido con permiso de la referencia ^31.rge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación conformacional de YLE, YLE-3A, y A2-YLE-5A péptidos presentados por HLA-A * 0201. (A) (YLE oscuros palos verdes) y YLE-3A (palitos de naranja) La alineación de péptido por la superposición de HLA-A * 0201 hélice α1 (gris de la historieta). residuos en caja indican la mutación de Glu3 en una alanina. Los recuadros muestran cómo la sustitución Glu3Ala causa un cambio en la posición (flecha negro) de Pro4 residuo vecino en la estructura A2-YLE-3A en comparación con la estructura A2-YLE. (B) YLE (oscuros palos verdes) y YLE-5A (palos de color rosa) La alineación de péptido por la superposición de HLA-A * 0201 hélice α1 (gris de la historieta). Los residuos en cajas indican la mutación de glicina 5 en una alanina. Reproducido con permiso de referencia ^{Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.}

TCR	CDR1α	CDR2α	CDR3α	CDR1β	CDR1β	CDR1β
PMEL17	DSAIYN	IQSSQRE	CAVLSSGGSNYKLTFG	SGHTA	FQGTGA	CASSFIGGTDTQYFG
gp100	TSINN	IRSNERE	CATDGDTPLVFG	LNHDA	SQIVND	CASSIGGPYEQYFG
	KALYS	LLKGGEQ	CGTETNTGNQFYFG	SGHDY	FNNNVP	CASSLGRYNEQFFG
296	DSASNY	IRSNVGE	CAASTSGGTSYGKLTFG	MNHEY	SMNVEV	CASSLGSSYEQYFG

Tabla 1: Alineación de TCR CDR3 Regiones de PMEL17, gp100, MPD, y 296 TCR-gp100 específica. Reproducido con permiso de la referencia ^31.

secuencia peptídica	péptido	PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 afinidad KD	gp100 TCR trav17 TRBV19 Affinidad KD
YLEPGPVTA	YLE	7,6 ± 2 M	26,5 ± 2,3 M
YLEPGPVT V	YLE-9V	6.3 ± 1.2 M	21.9 ± 2.4 M
Un LEPGPVTA	YLE-1A	15,9 ± 4,1 M	60,6 ± 5,4 M
YL Un PGPVTA	YLE-3A	sin vinculante	sin vinculante
YLE Un GPVTA	YLE-4A	19.7 ± 1.3 M	144,1 ± 7,8 M
Un YLEP PVTA	YLE-5A	> 1 mM	> 1 mM
Un YLEPG VTA	YLE-6A	11,4 ± 2,7 M	954,9 ± 97,8 M
Un YLEPGP TA	YLE-7A	31.1 ± 4 M	102,0 ± 9,2 M
YLEPGPV A A	YLE-8A	38,1 ± 7,4 M	121,0 ± 7,5 M

Tabla 2: Análisis de afinidad _(KD) de PMEL17 TCR y TCR gp100 a gp100 _280-288 variantes de péptidos. Reproducido con permiso de la referencia ^31.

parámetros	PMEL17 TCR-A2-YLE-9V	A2-YLE	A2-YLE-3A	A2-YLE-5A
AP código </ Strong>	5EU6	5EU3	5EU4	5EU5
estadísticas del conjunto de datos
grupo espacial	P1	P1 21 1	P1	P1 21 1
parámetros de la celda unidad (A)	a = 45,52, b = 54,41, c = 112.12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, 72,6 ° g =	a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 °	a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, 63,8 ° g =	a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 °
fuente de radiación	DIAMOND I03	DIAMOND I03	DIAMOND I02	DIAMOND I02
Longitud de onda (Å)	0.9763	0.9999	0.9763	0.9763
Measurango de resolución roja (A)	51.87 - 2.02	45.25 - 1,97	43.39 - 2.12	43.42 - 1,54
Shell Resolución exterior (A)	02.07 a 02.02	2,02-1,97	02.18 a 02.12	1.58 - 154
reflexión observó	128.191 (8.955)	99.442 (7.056)	99.386 (7.463)	244.577 (17.745)
reflexiones únicas	64.983 (4.785)	30.103 (2.249)	49.667 (3.636)	67.308 (4.962)
Exhaustividad (%)	97,7 (96,7)	98,5 (99,3)	97,4 (96,7)	99,6 (99,9)
Multiplicidad	2,0 (1,9)	3,3 (3,1)	2,0 (2,1)	3,6 (3,6)
I / Sigma (I)	5,5 (1,9)	7,2 (1,9)	6,7 (20.3)	13 (2.3)
RPIM (%)	5.7 (39.8)	8.8 (44.7)	8.7 (41.6)	4.5 (35.4)
Combinación de R (%)	7.8 (39.6)	9.8 (50.2)	8.7 (41.6)	5.0 (53.2)
estadísticas de refinamiento
Resolución (Å)	2.02	1.97	2.12	1.54
No hay reflexiones usados	61688	28557	47153	63875
No se reflejo en conjunto Rlibre	3294	1526	2514	3406
R cri (sin límite) (%)	18.1	19.7	17.2	17.0
R gratis	22.2	25.5	21.1	20.1
Desviación cuadrática media de la geometría ideales
longitudes de enlace (A)	0,018 (0,019) *	0,019 (0,019) *	0,021 (0,019) *	0,018 (0,019) *
ángulos de enlace (°)	1.964 (1.939) *	1.961 (1.926) *	2.067 (1.927) *	1.914 (1.936) *
En general coordinar error (Å)	0,122	0,153	0,147	.055
Estadísticas Ramachandran
más favorecida	791 (96%)	371 (98%)	749 (99%)	384 (98%)
Permitido	32 (4%)	6 (2%)	10 (1%)	5 (1%)
Los valores atípicos	2 (0%)	3 (1%)	1 (0%)	2 (0%)

Tabla 3: Reducción de datos y el refinamiento de Estadística (reemplazo molecular). Reproducido con permiso de la referencia ^31. Los valores entre paréntesis corresponden a la concha más alta resolución.

^OH

HLA / péptido residuo	residuos de TCR	Nº vdW (≤4Å)	Nº H-bonos (≤3.4Å)
Gly62	αGly98	3
	αSer99	1
Arg65	αSer99	2
O Arg65	αAsn100 Nδ2	2	1
Arg65 NH1	βAsp58 Oδ2		1
	βSer59	8
Lys66	αGly98	1
	αSer99	4
	αAsn100	4
Ala69	αAsn100	2
	βAla56	2
Gln72 Nε2	O βGln51	3	1
	βGly54	7
	βAla55	1
Thr73	βGln51	1
Val76	βGln51	3
	βGly52	2
Lys146	βPhe97	3
	βIle98	3
Ala150	βIle98	1
	βAsp102	3
Val152	βIle98	1
Glu154	αTyr32	1
N Gln155	αTyr32 OH	4	1
Gln155 Oε1	N βThr101	10	1
O αGly97	1	1
	αGly98	1
	αSer96	1
Glu3	αTyr101	1
Pro4	αSer96	1
	αSer99	1
	αAsn100	4
O Pro4	N αTyr101	14	1
Gly5	αTyr101	3
	βGly100	2
Val7	βIle98	7
	βGly99	2
	βGly100	2
Thr8	βThr31	5
	βGln51	1
	βPhe97	1
N Thr8	O βIle98	6	1

Tyr1

Tabla 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V Contacto mesa. Reproducido con permiso de la referencia ^31.

Discussion

Los protocolos descritos aquí proporcionan un marco para la disección molecular y celular de las respuestas de células T en el contexto de cualquier enfermedad humana. Aunque el cáncer fue el principal foco de este estudio, hemos utilizado enfoques muy similares a investigar las respuestas de células T a los virus ^{32, 33, 34, 35, 36, 37} y durante la autoinmunidad ^{38, 39, 40.} Además, hemos utilizado estas técnicas más ampliamente para comprender los principios moleculares que rigen el reconocimiento de las células T antígeno ^{2, 19, 41, 42.} De hecho, la naturaleza impredecible de modificaciones al péptido residuos, incluso aquellosfuera de la de los residuos de contacto TCR, el reconocimiento de los efectos de las células T tiene implicaciones importantes para el diseño de péptidos heteróclitos. Estos descubrimientos han contribuido directamente al desarrollo de nuevas terapias de células T, incluyendo vacunas de péptidos ^{6, 43} y los TCR de alta afinidad artificiales ^{3, 4, 5, 20, 44,} así como de diagnóstico mejorado ^{45, 46, 47.}

Los pasos críticos en el protocolo
La generación de una proteína altamente puro, funcional es esencial para todos los métodos descritos en el presente documento.

Modificaciones y solución de problemas
Las dificultades en la generación de proteína altamente pura a menudo se refieren a la expresión de muypuro al, insoluble IBs desde el sistema de expresión de E. coli. Por lo general, la modificación del protocolo de expresión (por ejemplo, induciendo a diferentes densidades ópticas, el uso de diferentes cepas de E. coli, o el uso de diferentes formaciones de medios de comunicación) resuelve estos problemas.

Las limitaciones de la técnica
Estas técnicas utilizan moléculas de proteínas solubles (TCR y pHLA) que se expresan normalmente en la superficie celular. Por lo tanto, es importante asegurarse de que los resultados estructurales / biofísicas son consistentes con los enfoques celulares para confirmar importancia biológica.

Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos
A través del uso de la cristalografía de rayos X y biofísica justificados a través del análisis funcional, nosotros y otros han demostrado que los TCR específicos para epítopos de cáncer se caracterizan generalmente por afinidades de unión de baja ^48. Esta baja afinidad TCR puede ayudar a explicar por qué las células T are no naturalmente eficaz en la limpieza cáncer. estructuras atómicas de alta resolución de complejos entre los TCR contra el cáncer y los antígenos tumorales afines están empezando a revelar las bases moleculares de esta afinidad débil. Por otra parte, estos estudios son útiles para determinar los mecanismos que subyacen a las intervenciones terapéuticas destinadas a superar este problema, la siembra de las mejoras futuras ^16. En este estudio, hemos examinado la primera estructura de un αβTCR de origen natural en un complejo con gp100 HLA-A * 0201-Restringido epítopo melanoma. La estructura, en combinación con un examen biofísico en profundidad, reveló el modo de unión global de la interacción. También hemos descubierto un interruptor inesperado molecular, que se produjo en una forma mutada del péptido, que abrogó unión TCR (evaluada usando resonancia de plasmón de superficie) y el reconocimiento de las células T CD8 ⁺ (experimentos funcionales). Sólo fue posible demostrar que este nuevo mecanismo de PRESENTACIÓN antígeno HLAsobre el uso de los métodos de alta resolución descritos.

Las aplicaciones futuras o direcciones después de dominar esta técnica
En general, nuestros resultados demuestran el poder de la cristalografía de rayos X y los métodos biofísicos cuando se combina con análisis funcionales robustos. El uso de estos enfoques, es posible diseccionar los mecanismos moleculares precisos que gobiernan el reconocimiento de antígenos de células T. De hecho, también es posible usar este enfoque para resolver la estructura de TCR no ligado, lo que demuestra cómo los cambios conformacionales pueden jugar un papel durante la discriminación antígeno ^{49, 50, 51.} Una mejor comprensión de la naturaleza altamente compleja y dinámica que sustenta la interacción TCR-pHLA también tiene implicaciones obvias para el diseño de la terapia. Ser capaz de "ver" directamente las moléculas que están siendo dirigidas terapéuticamente, así como el efecto que tienen sobre modificaciones recognitio antígenon, mejorará claramente el desarrollo de estos medicamentos en el futuro. En este estudio, mostramos que incluso cambios en un único residuo de péptido que no está fuertemente comprometidos por un TCR pueden transmitir de forma impredecible cambios estructurales de otros residuos en el péptido HLA-atado, que, a su vez, altera drásticamente el reconocimiento de células T. Una comprensión más completa de los mecanismos moleculares empleados durante el reconocimiento de antígenos de células T será enormemente beneficiosa en el diseño de futuras terapias para una amplia gama de enfermedades humanas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
S.O.C. media	Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubadora	de
	Sigma
IPTG	Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain	Centrífuga Generon
Legend RT	Sorvall
Tris	Cloruro
	Arcos
NaCl	Glicerol de Fisher
	Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070	de Bandelín
	Fisher
Triton	Sigma-Aldrich
EDTA	Guanidina Fisher
	Fisher
NanoDrop ND1000	Termo
péptidos Peptide	Investigación
ditiotreitol	Sigma-Aldrich
L-arginina	Cisteamina SAFC
	cistamina de Fisher
	Tubo
	Sigma-Aldrich
urea	Sigma-Aldrich
Metricel 0,45 μ m filtro de membrana	Pall POROS
10/100 HQ	Biosistemas
Ä Sistema FPLC puro KTA	GE Healthcare Ciencias de la Vida 10
kDa MWCO Vivaspin 20	Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4	Columna Sartorius
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences
fosfato salino	Tampón Oxoid
BIAcore HBS	GE Healthcare Life Sciences Kit de
biotinilación	Avidity
BIAcore T200	GE Healthcare Life Sciences
estreptavidina	Sigma-Aldrich
Microcal Vicepresidente de ITC	GE Healthcare Ciencias de la Vida Hepes
	Robot de cristalización Sigma-Aldrich
Gryphon	Art Robbins Instruments
Intelli-plate	Art Robbins Instruments
Cribas de cristalización y reactivos	Dimensiones
75 cm2 ms;	Greiner Bio-One
0.22 μ m filtros	Miller-GP,
Ultra-Clear	Beckman Coulter
Optima L-100 XP con rotor SW28	Beckman Coulter
CD8 microperlas	Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads	Invitrogen
	Miltenyi Biotec
CK medio, PHA	Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb
dasatinib	Axon
MIP-1 y beta; y TNF&alfa; ELISA	R& D Sistemas
51Cr	PerkinElmer
1450 Contador Microbeta	PerkinElmer