Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.
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Artículo de método
Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos
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Resumen
Resumen
El trasplante de islotes ha demostrado clínicamente ser eficaz en el tratamiento de la diabetes tipo 1. Sin embargo, la actual estrategia de trasplante intrahepático puede incurrir en reacciones agudas de sangre entera y resultar en inseminación de islotes pobres. En este trabajo se presenta un protocolo robusto para el trasplante de islotes en el sitio de trasplante extrahepático -la almohadilla de grasa epididimal (EFP) - en un modelo de ratón diabético. Se describe un protocolo para aislar y purificar islotes con altos rendimientos de ratones C57BL / 6J, así como un método de trasplante realizado mediante la siembra de islotes sobre un andamio decelularizado (DCS) y su implantación en el sitio EFP en ratones C57BL / 6J singénicos rendidos diabéticos Por la estreptozotocina. El injerto DCS que contenía 500 islotes invirtió la condición hiperglucémica en 10 días, mientras que los islotes libres sin DCS requirieron al menos 30 días. La normoglucemia se mantuvo hasta 3 meses hasta que se explantó el injerto. En conclusión, DCS mejoró el injerto de islotes en tEl sitio extrahepático de la EFP, que podría ser fácilmente recuperado y podría proporcionar una plataforma reproducible y útil para investigar los materiales del andamio, así como otros parámetros de trasplante requeridos para un inseminación exitosa de islotes.
Introducción
La diabetes mellitus tipo 1 (T1D) es un trastorno endocrino autoinmune en el que las células de los islotes son ablacionadas por el sistema inmunitario, haciendo que los pacientes dependan de la inyección de insulina exógena durante toda su vida. El protocolo de Edmonton representa un hito en los estudios clínicos del trasplante de islotes; Los islotes fueron infundidos a través de la vena porta y trasplantados en el sitio intrahepático [ 1] . Sin embargo, dos obstáculos principales-fuentes inadecuadas de islotes donantes y insectos de islotes pobres-impiden el gran éxito del trasplante de islotes 2 . Por lo general, lo....
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Protocolo
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pekín (IACUC, IACUC no COE-LuoY-1).
1. Aislamiento de islotes
- Preparación de reactivos y equipos.
- Reconstituir colagenasa P en polvo (2 U / mg) en HBSS para hacer una solución de 5 mg / mL y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las bacterias. Preparar soluciones alícuotas de 0,6 ml de colagenasa P en tubos cónicos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.
NOTA: Durante el uso, cada alícuota se diluye con HBSS para dar soluciones de trabajo de 6 ml con concentraciones finale....
- Reconstituir colagenasa P en polvo (2 U / mg) en HBSS para hacer una solución de 5 mg / mL y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las bacterias. Preparar soluciones alícuotas de 0,6 ml de colagenasa P en tubos cónicos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.
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Resultados
Nuestro método de sujeción, realizado con una pinza hemostática microscópica, es sencillo y ahorra tiempo en comparación con la técnica de ligadura de sutura. Se tomó aproximadamente 4 h para aislar y purificar alrededor de 1.200 islotes de 6 ratones. Los islotes recién aislados tenían típicamente una periferia rugosa bajo un microscopio óptico ( Figura 3A ). Una vez que los islotes se recuperaron del proceso de aislamiento, parecían brillantes y apretados y.......
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Discusión
La perfusión del páncreas y el tiempo de digestión son dos parámetros clave que afectan el rendimiento y la calidad de los islotes. Moskalewski informó por primera vez el uso de una mezcla de colagenasa cruda para digerir el páncreas de conejillo de indias picada [ 11] . Lacy et al. Informó la inyección de enzimas en el sistema de conductos para perfundir el páncreas, lo que aumentó considerablemente el rendimiento de islotes [ 12] . La per.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Wei Zhang de Guanhao Biotech por proporcionar los andamios decelularizados. Damos las gracias a Xiao-hong Peng por las discusiones útiles. Esta investigación fue apoyada financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Proyecto No.31322021).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tijera de disección | Ningbo | ||
| Ningbo Medical | |||
| Malla de alambre de 0,5 mm de diámetro | Ningbo Medical | ||
| 70 μ filtro de células m | Falcon | 352350 | |
| pinza hemostática para arterias | Ningbo Medical | ||
| Pinza hemostática microscópica | Ningbo Medical | ||
| Pinzas hemostáticas | Ningbo Medical | ||
| Absorbible 6-0 Suturas PGLA | JINHUAN | Con aguja | |
| Pinza para heridas | Ningbo | ||
| Medical Hisopo de algodón | Ningbo | ||
| Gauze | Ningbo | ||
| Medical | |||
| Jeringa de 10 ml | JINGHUAN | ||
| Jeringa de 1 mL | JINGHUAN | ||
| aguja intravenosa 27G | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Tubo Eppendorf | Axygen | ||
| 15mL tubo cónico | Corning | 430791 | |
| 50mL tubo cónico | Corning | 430829 | |
| 35mm No tratado Periplatos | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μ m filtro | Pall | PN4612 | |
| 10 mL pipeta serológica | Corning | 4488 | |
| Llenadora de pipetas S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipeta (2-20μ L) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Microscopio de disección | Olympus | SZ61 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5810R | |
| Hank' s solución salina equilibrada | Gibco | C14175500CP | |
| Colagenasa P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucosa | Gibco | A24940-01 | |
| Medidor de glucosa | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Estreptozotocina | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Hidrato de cloral | J& K | C0073 | |
| Citrato de sodio | Sigma | 71497 | |
| Ácido cítrico | Sigma | C2404 | |
| Yodóforos | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 semanas de edad | VitalRiver | Pekín, China | |
| Andamio descelularizado | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
Referencias
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
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Reimpresiones y permisos
