Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad para sondar la estructura y fisiología de las células nerviosas individuales en cultivo es crucial para el estudio de la neurobiología, y permite la flexibilidad en la manipulación genética y química de las células individuales o redes definidas. Tal facilidad de manipulación es más sencilla en el sistema de cultivo reducido en comparación con el tejido cerebral intacta. Aunque existen muchos métodos para el aislamiento y crecimiento de estas neuronas primarias, cada uno tiene sus propias limitaciones. Este protocolo describe un método para el cultivo de baja densidad y de roedores de alta pureza neuronas del hipocampo embrionarias en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales. Esta 'cultura sándwich' permite el crecimiento exclusiva a largo plazo de una población de neuronas permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son de edad suficiente o nivel de madurez, los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales. Las neuronas grown por este método normalmente sobrevivir durante varias semanas y desarrollar amplias pérgolas, conexiones sinápticas, y propiedades de la red.
Introducción
El cerebro está organizado en intrincadas redes de neuronas. La contribución de las neuronas individuales a la actividad de red y la función cerebral puede ser estudiada por la alteración selectiva de su composición molecular y perturbación de sus propiedades fisiológicas. La manipulación genética y química de las neuronas individuales es posiblemente más fácil en neuronas cultivadas que en el tejido del cerebro intacto, sin el estorbo de la heterogeneidad y complejidad celular de este último. Las neuronas en cultivo desarrollan axonal bien definido y cenadores dendríticas y forman extensas conexiones sinápticas entre sí.
Mientras que la ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos y protocolos que utilizan animales de laboratorio fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Manitoba y se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales.
1. Preparación de instrumentos, tampones y soluciones
- Esterilizar en autoclave todos los equipos de la disección, pipetas Pasteur de vidrio, puntas de pipeta, aparato de filtro, y agua desionizada.
- Preparar un 20% (w / v; 1,1 M) solución madre de glucosa en agua desionizada y se filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de piruvato de sodio 100 mM en agua desionizada y....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
En este método "sandwich" de cultivo de células de nervio primario, las neuronas del hipocampo (Figura 3) crecen en una cama de células gliales (Figura 1) separadas por perlas de parafina (Figura 2). Esto asegura que las neuronas crezcan selectivamente en cubreobjetos de vidrio con la contaminación de células glial mínima, pero reciben soporte trófico adecuada de la glía que crecen en la placa de cultivo tisular. Típicamente, l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Mientras que el método "sandwich" de las neuronas que el cultivo haya sido bien descrito en otras partes 2, 11, hay varios pasos a lo largo del protocolo que son muy difíciles de describir en texto por sí solo, que puede conducir a la frustración para los investigadores que desean adoptarlo.
El método se puede dividir en tres grandes flujos de trabajo: cultura glial, preparación cubreobjetos y cultivo de neuronas y de mante.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por CIHR RP-142209 a TJS.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instrumentos de disección | |||
| Micro tijeras de disección | Roboz | RS-5910 | |
| Micro tijeras de disección | Roboz | RS-5650 | |
| Micro tijeras de disección | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Pinzas | 4Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Pinzas (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Preparación de tejidos | |||
| Tripsina (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Portafiltros Swinnex, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Se utiliza como filtro de células. Ensamble primero con filtro y autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| Hemocitómetro | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grado 105 Pañuelo de limpieza de lentes | GE Healthcare | 2105-841 | Utilizado como filtro de células. Montaje primero en portafiltros y autoclave |
| Pipetas Pasteur de vidrio con filtro de algodón | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Solución salina equilibrada de Hank's sin calcio, magnesio y rojo fenol (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Pipetas Pasteur de vidrio | VWR | 14672-380 | |
| Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino (Dnasa) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Quemador bunsen de butano | Wall-Lenk Mfg. Co. | modelo 65 | |
| Eppendorf | 5810R | ||
| Name | Company | >Número de catálogo | Comentarios |
| Cultivo de tejidos | |||
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Placa de Petri (100 mm) | Placa | Fisher FB0875712 | |
| (60 mm) | Suero de | ||
| Gibco | 16050-122 | Se puede usar en lugar de BGS, pero cada lote debe probarse debido a la variación entre lotes. Se recomienda la inactivación por calor del suero. | |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Piruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Medio esencial mínimo (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Medio neurobasal | Gibco | 21-103-049 | |
| L-glutamina (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| Suplemento GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Se puede utilizar en lugar de L-glutamina en el medio NBG |
| Plato de cultivo (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Matraces de cultivo (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Citarabina (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Suero de crecimiento bovino (BGS) | HyClone | SH3054103 | Se recomienda la inactivación por calor antes de su uso. |
| B27 Suplemento (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Viales criogénicos | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-fosfonopentanoico ácido (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| >Coverslip Preparación | |||
| sodio decahidratado (bórax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Hidrobromuro de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Cera de parafina | Fisher | 22-900-700 | |
| Horno de convección por gravedad | VWR | 89511-404 | Se utiliza para el método alternativo de limpieza de cubreobjetos discutido en el protocolo |
| Baño ultrasónico (sonicador) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Anachemia | ácido nítrico | 62786-460 | |
| Gradillas de tinción de cerámica | Thomas Scientific | 8542E40 | Se utiliza para el método alternativo de limpieza de cubreobjetos discutido en el protocolo |
| Cubreobjetos | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | El fabricante es muy importante, ya que las neuronas no se adhieren bien al vidrio de menor calidad |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Nombre | Company | >Número de catálogo | >Comentarios |
| >Miscelánea | |||
| Filtros de jeringa estériles | VWR | 28145-477 | Se utiliza con la jeringa BD para Jeringa de esterilización por filtro |
| BD | 302832 | Se utiliza con filtros de jeringa estériles VWR para la esterilización por volutado | |
| Microscopio invertido | Fisher | Scientific | |
| Tubos de centrífuga estéril cónicos de 15 mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Tubos de centrífuga estériles cónicos de 50 ml | ThermoScientific | 339652 | |
Referencias
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
