Artículo de método

Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra (

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DOI:

10.3791/55007

⸱

3 de noviembre de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

En este artículo

Resumen

Este método utiliza embriones de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva de células de cáncer vascular. células de cáncer fluorescentes se inyectan en el seno precardiaco o saco vitelino de embriones en desarrollo. células de cáncer de invasión vascular y la extravasación se evalúa a través de microscopía de fluorescencia de la región de la cola 24 a 96 horas más tarde.

Resumen

La invasión vascular y extravasación de las células cancerosas es un sello distintivo de la progresión metastásica. Los modelos in vitro tradicionales de la invasión de endotelios por células cancerosas suelen carecer de la dinámica de fluidos a la que las células invasoras están expuestas in vivo. Sin embargo, los sistemas in vivo, como los modelos de ratón, aunque son más relevantes desde el punto de vista fisiológico, requieren escalas de tiempo experimentales más largas y presentan desafíos únicos asociados con el monitoreo y el análisis de datos. Aquí describimos un ensayo de pez cebra que busca cerrar esta brecha técnica al permitir la evaluación rápida de la invasión vascular y extravasación de células cancerosas. El enfoque consiste en inyectar células cancerosas fluorescentes en el seno precardíaco de embriones transparentes de pez cebra de 2 días de edad, cuya vasculatura está marcada por un indicador fluorescente contrastante. Después de la inyección, las células cancerosas deben sobrevivir en circulación y posteriormente extravasarse de los vasos a los tejidos de la región caudal del embrión. Las células cancerosas extravasadas se identifican y puntúan de manera eficiente en embriones vivos a través de imágenes de fluorescencia en un punto de tiempo fijo. Esta técnica puede modificarse para estudiar la intravasación y/o la competencia entre una mezcla heterogénea de células cancerosas cambiando el lugar de inyección por el saco vitelino. Juntos, estos métodos pueden evaluar un comportamiento distintivo de las células cancerosas y ayudar a descubrir mecanismos indicativos de la progresión maligna al fenotipo metastásico.

Introducción

La enfermedad metastásica es la causa principal de mortalidad por cáncer y muchos mecanismos que permiten la difusión de células de cáncer aún no se han descubierto 1. A fin de que una célula de cáncer de metástasis con éxito, debe invadir primero a través del estroma que rodea a un tumor primario, introduzca (intravasate) en el sistema circulatorio, sobrevivir en tránsito, salida (extravasate) de la circulación, y, por último establecer una colonia viable en el sitio de órgano distante 2. Intravasación y extravasación son, pues, los pasos cruciales en la cascada metastásica, sin embargo, cada célula de cáncer no es inherentemente adeptos a interrumpir y migrar a través de uniones endoteliales 3. De hecho, hay una serie de presiones de selección únicos que rodean la invasión vascular de células de cáncer y el proceso puede ser influenciada además por una variedad de factores endógenos y exógenos 4. Por estas razones, las técnicas que prueban la conducta agresiva de cáncer en etapa avanzada a menudo se centran en vascular capacidad invasora como un medio para predecir la propagación metastásica.

Existen diversos sistemas de modelos para facilitar el estudio de la invasión vascular de células de cáncer in vitro. El más utilizado en ensayos in vitro incluyen ya sea sistemas Transwell para evaluar la migración de células de cáncer a través de una barrera endotelial 5 o la tecnología eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM) para controlar la interrupción en tiempo real de una monocapa endotelial intacta por las células cancerosas 6. Estos ensayos suelen carecer de la dinámica de fluidos y los factores estromales que de otra manera afectar a la unión de células de cáncer a una pared endotelial. Este problema es algo eludirse mediante redes vasculares perfusable que surgen a partir del cultivo de endotelio 3D con el apoyo a las células del estroma, y estos sistemas de microfluidos 3D ahora representan la vanguardia de las actuales opciones in vitro 7,8. Sin embargo, estos enfoques omiten el microambiente robusta de un sistema circulatorio funcionaly por lo tanto sólo en parte sustituto para los modelos in vivo.

El más ampliamente utilizado en el modelo in vivo de la invasión vascular es el ratón, en el cual ensayos de metástasis experimentales se realizan comúnmente debido a que ocurren en escalas de tiempo relativamente cortos y generalmente son indicativas de la capacidad metastásica 9. Estos ensayos implican la inyección directa de células cancerosas en circulación y por lo tanto modelar las etapas finales de la metástasis, es decir, la extravasación de células cancerosas y colonización de órganos. Los ensayos de metástasis experimentales difieren según el lugar de la inyección de células de cáncer y en última instancia, los órganos analizados. En el primer tipo de ensayo, se inyectan células de cáncer en la vena caudal de los ratones y la siembra de células de cáncer en los pulmones se monitoriza 10,11. El segundo ensayo implica la realización de inyecciones intracardiacas para dirigir la siembra metastásica hacia el microambiente de la médula 12-14, sino también el cerebro 15. En la tercera ensayo, cáncer de cells se inyectan en el bazo con el fin de permitir la colonización del hígado 16 mientras que la cuarta ruta de entrega en la arteria carótida transporta las células cancerosas en el cerebro 17,18. Independientemente del método de entrega de células de cáncer, la colonización de órganos es el punto final experimental aceptado y se determina generalmente por medio de luminiscencia, histología, o técnicas basadas en PCR. A pesar de las ventajas fisiológicas de la realización de ensayos de metástasis experimentales dentro de un huésped murino, estos experimentos aún requieren semanas o meses para completar y analizar.

El modelo de pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un nuevo sistema para estudiar la progresión del cáncer 19,20, y permite la evaluación de la invasión vascular de células cancerosas dentro de un sistema circulatorio funcional sobre una escala de tiempo mucho más corto en comparación con los ratones 21-24. El método utiliza una cepa de pez cebra transparente que tiene su endotelios etiquetadas con un arrecife de coral verde fluoreportero proteína rescent dirigido por el promotor kdrl, el receptor de pez cebra para el factor de crecimiento endotelial vascular 25. En el ensayo, las células cancerosas se marcan con un marcador fluorescente rojo y se inyectan en el seno precardiaco de embriones de 2 días. En cualquier lugar entre 48 a 96 horas después de la inyección, las células cancerosas que han invadido fuera de la vasculatura y en la región caudal de embriones pueden ser marcados de manera eficiente en un microscopio de fluorescencia. Aquí aplicamos la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama humano comúnmente utilizados para demostrar grandes diferencias en su capacidad invasiva vascular. Además, se demuestra que el cambio de la zona de inyección al saco embrionario yema permite el estudio de las interacciones celulares heterogéneas, como las poblaciones celulares de cáncer pueden ser diferencialmente marcadas con colorantes fluorescentes y se inyectan en embriones de pez cebra que carecen de vasculatura fluorescente. En este último ensayo, las células cancerosas que han invadido la yema y intravasated en el vasculature se anotó en la región caudal de 24 a 48 horas después de la inyección. Debido a la eficacia y la comodidad de este modelo, el pez cebra se emplean cada vez más para probar rápidamente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas bajo un entorno fisiológico.

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Protocolo

Declaración de Ética: embriones de pez cebra fueron generados de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC. Estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown.

1. Organizar embriones para inyección y crear stock Soluciones

  1. Generar larvas de pez cebra requisito para evaluar la invasión vascular de células de cáncer.
    1. Establecer por pares o grupos en forma cruzada de acoplamiento con Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 peces.
      NOTA: Hemos generado Tg (kdrl: grcfp) Zn1; mitfa b692; b140 pez cebra ednrb1, mediante el cruce de Tg (kdrl: grcfp) Zn1 25, que expresan los arrecifes de la proteína verde fluorescente de coral en las células endoteliales, con una línea que carece de células pigmentarias, mitfa b692; ednrb1 b140, desarrollado en el Centro de recursos Internacional de pez cebra.
    2. Cohuevos llect, limpiar y retirar los embriones fertilizados o deformadas el próximo día 22.
    3. Incubar embriones en 28,5 ° C hasta el momento de la inyección con las células cancerosas, que se producen cuando los embriones de pez cebra son 2-días después de la fertilización (2 dpf).
  2. Hacer placas de inyección.
    1. Derretir 25 ml de agarosa al 1,5% en dH2O para cada plato.
    2. Verter 12 ml de la agarosa en un 100 mm x 15 mm placa de Petri y dejar que se endurezca.
    3. Vuelva a derretir y verter los agarosa restantes en la placa.
    4. Inmediatamente colocar un molde de vidrio de corte (3 mm x 7,2 cm de ancho x 7,5 cm de longitud) de manera que es en un ángulo de 30 grados a la agarosa y se coloca en el centro de la placa.
      NOTA: Esto creará una empinada pared de 60 ° y una rampa inclinada 30 °.
    5. Tape el molde de vidrio en su lugar y dejar que se endurezca la agarosa.
    6. Retire con cuidado el molde de vidrio y tenga cuidado de no romper la agarosa.
      NOTA: Los moldes se pueden almacenar en H2O destilada a 4 ° C.
  3. Equilibrar placa de inyección con agua de pescado (0,3 g / l de sal de mar).
    1. placa de enjuague dos veces con agua destilada.
    2. Equilibrar la placa mediante la adición de 10 ml de agua de pescado a la plancha y el lugar en un agitador durante 10 minutos.
    3. Equilibrar la placa una segunda vez con agua los peces.
  4. Dividir embriones de 2 días después de la fertilización (DPF) en grupos de inyección transfiriéndolos en platos de pescado que contienen agua 22.
  5. Preparar platos de recuperación para cada grupo para utilizar después de la inyección. Asegúrese de que el plato de recuperación contiene agua 10 ml de pescado, además de penicilina (25 mg / ml) y estreptomicina (50 mg / ml).
  6. Preparar la solución de tricaína 2x mediante la adición de 4 ml de tricaína tamponada de valores (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) a 50 ml de agua de pescado más penicilina y estreptomicina.
  7. Disolver agarosa 15 mg de bajo punto de fusión en 10 ml de solución de tricaína 2x para generar un medio anestésico de montaje que inmovilizará embriones vivos para IMAGingramo.
    NOTA: El montaje consiste en medio de agarosa al 1,5%.
  8. Tire las agujas de microinyección.
    1. Colocar tubos capilares de vidrio en un extractor de pipeta vertical. Tire pipetas largo cónicos utilizando actual mAmp 20 y un elemento de calentamiento de 2 espirales.

2. Las células de cáncer de etiquetado con colorante fluorescente lipofílico

  1. Mantener las células cancerosas en sus condiciones de cultivo recomendadas.
    NOTA: Estas líneas se mantuvieron en DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, y SK-BR-3. Estas líneas se mantuvieron en RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 y T-47D. Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la incubación.
  2. Generar una suspensión de una sola célula disociando un cultivo adherente de las células cancerosas.
    1. Lavar las células primero con PBS y después se trata con una solución de tripsina-EDTA 0,05%.
      NOTA: el tiempo de exposición tripsina dependerá de la línea celular.
    2. Neutralizar la solución de tripsina con SEmedios de cultivo celular después de que las células se desprenden contiene ron.
  3. Centrifugar la suspensión celular de tripsina-neutralizado durante 5 min a 200 xg, a continuación, volver a suspender el sedimento celular en medio de cultivo fresco para el recuento de células.
  4. Contar la suspensión de células usando un contador automatizado y preparar 1 millón de células en 200 l de medio de cultivo celular.
    1. Verificar la viabilidad celular con exclusión de tripan colorante azul antes de la inyección en embriones de pez cebra.
      NOTA: Sólo las poblaciones de células viables deben inyectarse en embriones de pez cebra, como la inyección de las células muertas no reflejarán la verdadera invasión vascular.
  5. Añadir 2 l de colorante lipófilo roja a la suspensión de células de cáncer para una dilución 1: 100, mezclar bien, y luego se incuba la mezcla a 37 ° C durante 20 min.
    NOTA: La concentración del colorante tiempo y el etiquetado puede necesitar ser optimizado para cada línea celular.
  6. Después de la incubación, añadir 1 ml de medio fresco al tubo y centrifugar durante 5 min a200 x g.
  7. Eliminar el colorante fluorescente residual de las células cancerosas.
    1. Aspirar el sobrenadante del sedimento celular, resuspender el precipitado en 1 ml de medio de cultivo fresco, y se centrifuga durante 5 min a 200 x g.
    2. Repetir la etapa de lavado una segunda vez: aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio fresco y centrifugar de nuevo durante 5 min a 200 x g.
    3. Repetir la etapa de lavado tercera vez: aspirar el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio fresco y centrifugar de nuevo durante 5 min a 200 x g.
  8. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular que contiene 1 millón de células de cáncer etiquetados en 500 l de medio fresco.
    NOTA: mM EDTA 0,5 se puede agregar a los medios de comunicación para evitar la aglutinación de células.

3. Inyectar células de cáncer en el seno antes de la circulación de embriones de pez cebra

  1. Adjuntar sistema de dispensación de microinyección a una fuente de aire a presión y girar en el the microinyección fuente de alimentación del sistema de dispensación.
    1. Presión de prueba presionando el pedal del pie. Un breve impulso de aire debe emitir desde el soporte de la aguja.
  2. Equilibrar las placas de inyección de dos veces con la solución 2x ​​tricaína.
    1. Para cada paso de equilibrado, añadir 20 ml de solución de tricaína 2x a la placa de inyección y el lugar en un agitador durante 10 min.
  3. Utilice pipeta de plástico para transferir un grupo de embriones a una pequeña placa que contiene la solución 2x ​​tricaína.
  4. Rellene la aguja de inyección microinyección con células de cáncer utilizando una punta de pipeta de carga de gel.
    1. Colocar la aguja en un recipiente de almacenamiento de electrodo con el extremo puntiagudo hacia abajo lo que las células se depositan cerca de la punta.
  5. Transferir 20 - 30 embriones anestesiados a una placa de inyección por la recogida de los embriones con un montón de 2x tricaína en una pipeta de plástico.
    1. Permitir que los embriones se asienten en la punta de la pipeta.
    2. CaballeroLy expulsar los embriones en la pila de la placa de inyección, la difusión de los embriones a lo largo de la longitud de la cubeta.
    3. Alinear los embriones con la cabeza hacia arriba y vientres que enfrenta la escarpada pared de la cubeta.
      NOTA: la solución Tricaína debe abarcar tanto la longitud y la superficie a través de agarosa plana, con embriones únicamente con domicilio en la artesa. Los embriones son ahora lista para la inyección.
  6. Inyectar 50 - 100 células cancerosas (2-5 nl) en el seno precardiaco de los embriones de pez cebra utilizando el sistema de microinyección de dispensación.
    1. Ponga la aguja en el soporte de aguja de un micromanipulador.
    2. Coloque la placa de inyección bajo el estereoscopio con la pared de 60 grados a la izquierda y se centran en la parte superior del embrión con 25 aumentos.
    3. Coloque el micromanipulador para que, cuando está extendido, la aguja perforará el embrión.
    4. Extender la aguja por el ojo hasta que está casi tocando el embrión.
    5. Mirando bajo el microscopio, alinear la aguja de manera tsombrero que perforará el embrión en una mayor extensión.
    6. Pierce el embrión a través del saco vitelino colocando la punta justo en, pero no en, el seno pre-cardíaca.
    7. Inyectar células presionando el pedal del pie. La fuerza de la inyección expulsa las células en el seno cardiaco. Retraer la aguja.
    8. Con la mano derecha, extender y retraer la aguja de inyección. Con la mano izquierda, hacer ajustes precisos en la posición próxima embrión.
    9. Devolver la aguja a la jarra de almacenamiento de electrodo mientras se configura para inyectar otra placa.
  7. La transferencia de los embriones al plato recuperación una vez que se inyecta toda la placa.
    1. Inclinar la placa de inyección a la piscina de los embriones en la parte inferior, el lavado de los embriones restantes fuera de la pila, y su recogida con la pipeta de plástico.
    2. Permitir que los embriones se asienten en la parte inferior de la pipeta.
    3. La transferencia de los embriones al plato de recuperación en un volumen mínimo de tricaína.
  8. Incubadorasplato de la recuperación del te a 28 ° C durante 1 hora.
    1. Separados embriones de pez cebra viables a partir de embriones muertos y otros desechos.
  9. Incubar plato a 33 ° C hasta que esté listo para la puntuación, normalmente de 24 - 96 horas.
    NOTA: Esta temperatura se determina como un compromiso entre 37 ° C, la temperatura ideal para las células cancerosas, y 28,5 ° C, la temperatura ideal para el pez cebra.

4. La extravasación de puntuación

  1. Anestesiar el lote de embriones que se anotó colocándolas en un plato con una solución tricaína.
  2. Coloque una larvas anestesiado en un portaobjetos de microscopía de la depresión en una gota de tricaína.
    1. larvas Orient lateralmente para la imagen óptima de la región caudal.
  3. Contar el número de células cancerosas que han invadido con éxito de la vasculatura, centrándose arriba y hacia abajo a través de la región de la cola de discernir claramente las células intactas.
    NOTA: Lo mejor es tener al menos dos individuos involucrados en tsu proceso, donde el individuo meter el pescado es ciego a la condición experimental que está siendo evaluada.
    1. Puntuación larvas en un microscopio de fluorescencia compuesto con la lente de objetivo de 10x. Utilice el objetivo 20x para cualquier llamada difíciles.

5. Los embriones de montaje en portaobjetos y Fluorescencia de Imagen Con posterioridad

  1. Derretir solución de agarosa / tricaína 1,5% y llevar a 37 ° C.
  2. Anestesiar el embrión para formar una imagen mediante la colocación en solución tricaína.
  3. Transferir el embrión en una gota de solución de tricaína a la superficie de formación de imágenes. utilizar opcionalmente un plato o un microscopio de diapositivas con fondo de vidrio.
  4. Usar una pipeta de vidrio para eliminar la solución tricaína exceso, reteniendo el embrión en la superficie de formación de imágenes.
  5. Superposición de una gota de solución de agarosa derretida sobre el embrión.
  6. Rápidamente, antes de que la agarosa se polimeriza, utilizar una herramienta delicada, como un cepillo de pestañas, para orientar el embrión lateralmente para la imagen, dando un cuidado especialpara asegurarse de que el embrión se aplana a lo largo de la superficie de formación de imágenes.
  7. Sumergir la gota de agarosa ahora polimerizado bajo tricaína solución.
  8. Se somete el embrión de pez cebra en vivo de imágenes microscópicas.

6. Modificación: La inyección de células cancerosas en el saco vitelino de embriones de pez cebra

  1. Preparar las placas de sistema de inyección y la microinyección de dispensación como se ha descrito anteriormente en la sección (3) de este protocolo.
  2. Etiquetar dos poblaciones de células en contraste con tintes fluorescentes como se ha descrito anteriormente en la sección (2) de este protocolo.
  3. Inyectar 5-10 nl de 2 x 10 ^ 7 células / ml en el saco vitelino. Mantener constante el volumen de inyección para inyectar el número de células idénticas (100 - 200 células cancerosas) de cada población celular
    NOTA: Se puede utilizar embriones de pez cebra transparentes que carecen de vasculatura fluorescente para este ensayo. entrada pasiva de las partículas en la vasculatura puede ser controlado para mediante la inyección de perlas fluorescentes (<10 micras) o, alterarde forma nativa, una línea celular que no intravsate.
  4. Recuperar los embriones inyectados como se ha descrito anteriormente en la sección (3) de este protocolo y luego la detección de inyecciones exitosas.
    1. Utilice un estereoscopio para defender y para transferir los embriones viables que fueron inyectados con éxito a un nuevo plato.
      NOTA: Todos los embriones deben tener una masa de tamaño consistente de células situadas en la yema. Los embriones se descartan si el tamaño de la masa difiere o si las células están situadas fuera de la yema.
    2. La transferencia de los embriones viables para un nuevo plato si las células cancerosas se ven claramente en el saco vitelino.
  5. Incubar plato a 33 ° C hasta que esté listo para la puntuación, por lo general de 24 - 48 h.
    NOTA: Esta temperatura se determina como un compromiso entre 37 ° C, la temperatura ideal para las células cancerosas, y 28,5 ° C, la temperatura ideal para el pez cebra.
  6. Para anotar intravasación, sigue las instrucciones descritas en el apartado (4) de este protocolo, pero en lugar de contar el número de ccélulas Ancer que han invadido con éxito en el sistema vascular de la región caudal.

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Resultados

Aquí hemos probado la capacidad invasiva vascular de líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados en un modelo de embrión de pez cebra (Figura 1). Se emplearon criterios rigurosos en la extravasación de puntuación para estas diferentes líneas celulares, donde los acontecimientos positivos sólo si se contaron las células cancerosas habían extravasado claramente, este ser hecho principalmente para limitar los positivos falsos que podrían derivarse de anotar los...

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Discusión

Esta técnica utiliza el modelo de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas (véase la Figura 1). A continuación se aplicó la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama con el fin de proporcionar una línea de base sobre la que otros investigadores pueden construir sus propios estudios (véase la Tabla 1. Las figuras 2 - 3). La observación de que MDA-MB-231 células fácilmente invadieron en la región cau...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Agradecemos a Peter Johnson del Centro de Microscopía de la Universidad de Georgetown por su ayuda con la obtención de imágenes de los embriones de pez cebra. El Recurso Compartido de Microscopía e Imágenes y el Recurso Compartido del Pez Cebra cuentan con el apoyo parcial de la subvención P30-CA051008 de los NIH/NCI. Este trabajo también contó con el apoyo de los CA71508 (AW) y CA177466 (AW) de los NIH/NCI.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina-EDTALife Technologies25300-054
Platos de 100 mmCorning Incorporated3160-100
5 3/4" Pipetas Desechables para Pastur, Vidrio de borosilicatoMarca Fisher13-678-20B
Plato de 60 mmCorning Incorporated3160-60
Agarosa, Baja FusiónFisherBP165-25
Agarosa, Grado MolecularBiolineBIO-41026
Vidrio Capilar, Estándar, 1.2 mm x 0.68 mm, 4"A-M Systems, Inc627000
David Kopf 700C Extractor de pipetas verticalHofstra Group3600
DMEMLife Technologies11995-065
Tarro de almacenamiento de electrodos, 1.0 mmWorld Precision Instruments, IncE210
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína, MS-222)FlukaA5040
Cepillo de pestañasTed Pella, Inc113
Suero fetal bovino, inactivado por calorOmega ScientificFB-12
Fisherbrand Pipetas de transferenciaThermoFisher Scientific13-711-7M
Puntasde pipeta de carga de gelFisher Brand02-707-181
Platos con fondo de vidrio (12,0 mm)ThermoFisher Scientific150680
Portaobjetos de depresión de vidrioVWR470005-634
Instant Ocean Salt, Sal MarinaPentairIS50
Bombillas de goma de látex, 2 ml, paquete de 72confocal Heathrow Scientific
SP8 Leica
MicromanipuladorNarishige
Eclipse E600Nikon
PBSLife Technologies10010-023
Penicilina-G PotasioFisher BiotechBP914-100
Placas de Petri, 100 mm x 15 mmMarca Fisher 
Picospritzer IIGeneral Valve Corporation
RPMI 1640 Medium Life Technologies11875-093
Sulfato de estreptomicinaFisher BiotechBP910-50
Vybrant DiIThermoFisher ScientificV22885
VybrantDiO ThermoFisher ScientificV22886
Pez cebra Georgetown Zebrafish Shared Resources
se mantuvieron en DMEM + 10% FBS, con la expectativa de células BT-474 y HCC18-6, que se mantuvieron en RPMI + 10% FBS.
Microscopio HS20622B FB0875713Las líneas celulares de

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