Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas

Irena Roci; Hector Gallart-Ayala; Jeramie Watrous; Mohit Jain; Craig E. Wheelock; Roland Nilsson

doi:10.3791/55011

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Artículo de método

Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas

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DOI:

10.3791/55011

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4 de febrero de 2017

Irena Roci¹^,² , Hector Gallart-Ayala³ , Jeramie Watrous⁴ , Mohit Jain⁴ , Craig E. Wheelock³ , Roland Nilsson¹^,²

¹Department of Medicine, Unit of Computational Medicine, Karolinska Institutet, ²Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, ³Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Division of Physiological Chemistry 2, Karolinska Institutet, ⁴Department of Medicine, University of California San Diego

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un método para estudiar el metabolismo celular en comunidades complejas de múltiples tipos de células, utilizando una combinación de rastreo de isótopos estables, clasificación de células para aislar tipos específicos de células y espectrometría de masas.

Resumen

Los tipos de células de mamíferos exhiben un metabolismo especializado, y existe amplia evidencia de que varios tipos de células coexistentes participan en la cooperación metabólica. Además, incluso los cultivos de un solo tipo de célula pueden contener células en distintos estados metabólicos, como células en reposo o cíclicas. Los métodos para medir las actividades metabólicas de estas subpoblaciones son herramientas valiosas para comprender el metabolismo celular. Las poblaciones celulares complejas se separan más comúnmente utilizando un clasificador de células, y las subpoblaciones aisladas por este método se pueden analizar mediante métodos metabolómicos. Sin embargo, un problema con este enfoque es que el procedimiento de clasificación celular somete a las células a tensiones que pueden distorsionar su metabolismo.

Para superar estos problemas, razonamos que las distribuciones de isótopos masivos (MID) de los metabolitos de las células cultivadas con nutrientes marcados con isótopos estables probablemente sean más estables que las concentraciones absolutas de metabolitos, porque los MID se forman en escalas de tiempo más largas y deberían verse menos afectados por la exposición a corto plazo a las condiciones de clasificación celular. En este trabajo describimos un método basado en este principio, que combina la clasificación celular con la cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS). El procedimiento consiste en analizar tres tipos de muestras: (1) extractos de metabolitos obtenidos directamente de la población compleja; (2) extractos de células "clasificadas simuladamente" que pasan a través del instrumento clasificador de células sin compuerta ninguna población específica; y (3) extractos de las poblaciones realmente clasificadas. Las celdas clasificadas simuladas se comparan con la extracción directa para verificar que las MID no se alteran por el propio procedimiento de clasificación de celdas, antes de analizar las poblaciones clasificadas reales. Mostramos ejemplos de resultados de células HeLa ordenadas según la fase del ciclo celular, que revelan cambios en el metabolismo de los nucleótidos.

Introducción

Los organismos superiores contienen comunidades complejas de distintos tipos de células que colaboran para llevar a cabo las funciones más complejas. Por ejemplo, los tumores contienen no sólo las células cancerosas, pero también fibroblastos, células que constituyen los vasos sanguíneos, y la célula inmune a menudo infiltra ^1; sangre contiene una mezcla compleja de los subtipos de células inmunes ² docenas; e incluso líneas de células cultivadas pueden consistir en múltiples subpoblaciones, como el luminal y subtipos basales de las células de cáncer de mama ^3. Por otra parte, los tipos de célula....