Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas

Summary

Este artículo describe un método para estudiar el metabolismo celular en comunidades complejas de múltiples tipos de células, utilizando una combinación de rastreo de isótopos estables, clasificación de células para aislar tipos específicos de células y espectrometría de masas.

Abstract

Los tipos de células de mamíferos exhiben un metabolismo especializado, y existe amplia evidencia de que varios tipos de células coexistentes participan en la cooperación metabólica. Además, incluso los cultivos de un solo tipo de célula pueden contener células en distintos estados metabólicos, como células en reposo o cíclicas. Los métodos para medir las actividades metabólicas de estas subpoblaciones son herramientas valiosas para comprender el metabolismo celular. Las poblaciones celulares complejas se separan más comúnmente utilizando un clasificador de células, y las subpoblaciones aisladas por este método se pueden analizar mediante métodos metabolómicos. Sin embargo, un problema con este enfoque es que el procedimiento de clasificación celular somete a las células a tensiones que pueden distorsionar su metabolismo.

Para superar estos problemas, razonamos que las distribuciones de isótopos masivos (MID) de los metabolitos de las células cultivadas con nutrientes marcados con isótopos estables probablemente sean más estables que las concentraciones absolutas de metabolitos, porque los MID se forman en escalas de tiempo más largas y deberían verse menos afectados por la exposición a corto plazo a las condiciones de clasificación celular. En este trabajo describimos un método basado en este principio, que combina la clasificación celular con la cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (LC-HRMS). El procedimiento consiste en analizar tres tipos de muestras: (1) extractos de metabolitos obtenidos directamente de la población compleja; (2) extractos de células "clasificadas simuladamente" que pasan a través del instrumento clasificador de células sin compuerta ninguna población específica; y (3) extractos de las poblaciones realmente clasificadas. Las celdas clasificadas simuladas se comparan con la extracción directa para verificar que las MID no se alteran por el propio procedimiento de clasificación de celdas, antes de analizar las poblaciones clasificadas reales. Mostramos ejemplos de resultados de células HeLa ordenadas según la fase del ciclo celular, que revelan cambios en el metabolismo de los nucleótidos.

Introduction

Los organismos superiores contienen comunidades complejas de distintos tipos de células que colaboran para llevar a cabo las funciones más complejas. Por ejemplo, los tumores contienen no sólo las células cancerosas, pero también fibroblastos, células que constituyen los vasos sanguíneos, y la célula inmune a menudo infiltra ^1; sangre contiene una mezcla compleja de los subtipos de células inmunes ² docenas; e incluso líneas de células cultivadas pueden consistir en múltiples subpoblaciones, como el luminal y subtipos basales de las células de cáncer de mama ^3. Por otra parte, los tipos de célula....

Protocol

1. Extracción de metabolitos

1. Extracción del plato
   1. células de cultivo en una placa de 6 pocillos por triplicado en la etiqueta de isótopos estables medios de cultivo + suplementos dializados (suero u otros suplementos de crecimiento) hasta que las células se convierten en el 75% de confluencia.
      NOTA: Aquí células HeLa cultivo durante 48 h en RPMI que contiene 40% de U ¹³ C-glucosa y 70% de U ¹³ C, ¹⁵ N2-glutamina y 5% de FBS dializado (Suero Bovino Fetal). FBS dializado se utiliza para deshacerse de los pequeños metabolitos de peso molecular que puedan contaminar los medios de etiquetado. Se re....

Results

A modo de ejemplo, aquí se describe un experimento que investiga el metabolismo de las células HeLa ordenados según la fase del ciclo celular. Para etiquetar una amplia gama de metabolitos centrales de ambos carbonos y nitrógenos, cultivamos las células durante 48 h utilizando U- ¹³ C-glucosa y U- ¹³ C, ¹⁵ N-glutamina como trazadores. Para obtener MIDs ricos para el experimento de validación, que aquí elegimos una mezcla de 40% de U ¹³ C-glucos.......

Discussion

Nuestro método se basa en el principio de que los MID de metabolitos celulares reflejan la "historia" de las actividades metabólicas de una célula. Esto hace que sea posible para investigar las actividades metabólicas en subpoblación de células, ya que se produjeron en el complejo comunidad de células, antes del procedimiento de clasificación de células. Por el contrario, áreas de los picos de metabolitos difieren notablemente entre los extractos de células clasificadas y extracción directa de la placa de cult.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H6648
INFLUX (Clasificador inFlux v7)	BD Biosciences
U-13C-Glucosa	Isótopos de Cambridge	40762-22-9 / GLC-018
U-13C,15N2-Glutamina	Isótopos de Cambridge	CNLM-1275-H-0.1
Metanol (JT Baker), grado HPLC	VWR	BAKR8402.2500
Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0.1 y micro; m	Millipore	UFC30VV00
Ultimate 3.000 UHPLC	Thermo Fisher scientific
Q-Exactive Orbitrap Espectrómetro de masas	Thermo Fisher scientific
Merk-Sequant ZIC HILIC columna (150 mm x 4,6  mm, 5 y micro; m)	Merck KGaA	1.50444.0001
Merk-Sequant ZIC HILIC columna de protección (20 mm x 2,1 mm)	Merck KGaA
Acetonitrilo Optima LC-MS, vidrio ámbar	Fisher Scientific	A955-212
Milli-Q agua	Millipore		Producido con un sistema de gradiente Milli-Q
Myrsyra 99.5% Optima (ácido fórmico)	Fisher Scientific	11423423
X100 Vial de rosca 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, ámbar, 100 unidades	Thermo Fisher scientific	10560053
X100 Cerradura Skruv Vitt Empaquetadura de PTFE 8-425 (Tapones de rosca)	Thermo Fisher scientific	12458636
ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Modo Cal Mix	Sigma-Aldrich	MSCAL5	Kit de calibración
SNAKESKIN 10K MWCO	Thermo Fisher scientific	88245
Mathematica v.10	Wolfram Research