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Artículo de método

El alimentador de ensayo capilar para analizar el consumo de alimentos en

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DOI:

10.3791/55024

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17 de marzo de 2017

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1Institute of Zoology, Albertus-Magnus University of Cologne, 2Department of Veterinary Biomedical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

En este artículo

Resumen

El ensayo CApillary FEeder (CAFE) es un método sencillo, económico y altamente fiable para investigar los mecanismos que subyacen a la ingesta de alimentos. Utilizado con el organismo modelo genético altamente versátil Drosophila melanogaster, proporciona un poderoso medio para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos reguladores de la ingesta de alimentos.

Resumen

Para la mayoría de los animales, la alimentación es un comportamiento esencial para asegurar la supervivencia, e influye en el desarrollo, la locomoción, la salud y la reproducción. Por lo tanto, la ingestión del tipo y la cantidad adecuados de alimentos tiene una gran influencia en la calidad de vida. La investigación sobre el comportamiento alimentario se centra en los procesos subyacentes que garantizan la alimentación real y desentraña el papel de los factores que regulan la homeostasis energética interna y las bases neuronales de la toma de decisiones. El organismo modelo Drosophila melanogaster, con su gran variedad de herramientas genéticamente trazables para el etiquetado y la manipulación de neuronas individuales, permite el mapeo de redes neuronales y la identificación de cascadas de señalización molecular involucradas en la regulación de la ingesta de alimentos. Este informe muestra el ensayo CApillary FEeder (CAFE) y muestra cómo medir la ingesta de alimentos en un grupo de moscas durante períodos de tiempo que van desde horas hasta días. Este ensayo fácil de usar consiste en capilares de vidrio llenos de alimento líquido al que las moscas pueden acceder y alimentarse libremente. El consumo de alimentos en el ensayo se determina con precisión utilizando herramientas de medición sencillas. En este trabajo se describe paso a paso el método desde la configuración hasta la ejecución exitosa del ensayo CAFE, y se proporcionan ejemplos prácticos para analizar la ingesta de alimento de un grupo de moscas en condiciones controladas. Se guía al lector a través de las posibles limitaciones del ensayo, y se evalúan las ventajas y desventajas del método en comparación con otros ensayos de alimentación en D. melanogaster.

Introducción

Comer es esencial; Sin embargo, la desregulación de la ingesta de alimentos que resulta en trastornos de la alimentación como la bulimia, la anorexia o la tendencia general a comer en exceso supone un coste para la sociedad y los individuos 1, 2, 3. El objetivo de la presente investigación es descubrir los mecanismos de regulación de la ingesta de alimentos y para proporcionar una estrategia para eludir la formación trastorno. Numerosos estudios utilizando organismos modelo de mamíferos han proporcionado nuevos conocimientos de los circuitos y el papel de los sistemas de señalización en los trastornos de 4, 5, 6 de comer. Sin embargo, nuestro conocimiento de las bases neuronales y moleculares que subyacen a estos trastornos se mantiene lejos de ser completa. En los últimos años, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema modelo valioso para desentrañar conocimientos mecánicos básicos en la regulación de metabolism 7, 8, 9. El ensayo capilar de alimentación (CAFE) de Drosophila melanogaster se estableció en el laboratorio de Seymour Benzer en 2007 inspirado en un trabajo anterior de Dethier en blowfly 10, 11. El ensayo CAFE hizo posible medir directamente la ingesta de alimentos en Drosophila melanogaster. En este sistema de análisis de comportamiento, las moscas se alimentan de alimento líquido proporcionado en capilares de vidrio graduadas colocadas dentro de un vial. El descenso del menisco capilar indica pérdida de solución de alimentación a través de la evaporación y consumo de alimentos. La determinación de la velocidad de evaporación por viales sin moscas permite la cuantificación precisa de la ingesta de alimentos.

El ensayo Café es uno de los diversos paradigmas de comportamiento utilizados para medir la alimentación en Drosophila melanogaster y los investigadores tienen que elegir el más adecuado para su específicapregunta. La decisión de utilizar un determinado ensayo deben considerar los siguientes puntos: la naturaleza de los alimentos proporcionados; la condición de alimentación; la medición de la ingesta o absorción de nutrientes y el consumo de alimentos investigación o de reacción a la alimentación.

El ensayo CAFE como se describe en este informe es ideal para después de la ingesta de alimentos de una fuente de alimento líquido bajo una condición de la alimentación en posición vertical. Como alternativa, la ingesta de alimentos se puede medir para un grupo mosca en una fuente de alimento de color en un vial o en una placa. Las moscas se mataron normalmente o anestesiados después de la alimentación y la cantidad de colorante ingerido se determina por espectrometría o inspección visual del abdomen manchado. Las moscas comienzan a excretar los alimentos ingeridos solamente 30 min después de la ingesta, por lo tanto, este enfoque es difícil de utilizar para el análisis de la alimentación ya continua comportamientos 12, 13.

En contraste moscas se mantienen intactos cuando colorante absorbibles con trazadores radioactivos se utilizan y su consumo de radioisótopo se anotó en un contador de centelleo de 14, 15. La absorción del radiofármaco por el sistema digestivo de la mosca hace posible la medición de la absorción de alimentos a largo plazo, pero podría llevar a una subestimación del consumo a causa de las moléculas no absorbidos y excretados trazadores. Otro enfoque para medir la respuesta a la alimentación en Drosophila melanogaster es la respuesta extensión proboscis (PER), que normalmente se produce por la ingesta de alimentos 16. Este método elegante mide la respuesta inicial a un estímulo comida, pero no registra la cantidad de ingesta. La ingesta de alimentos se ajusta dinámicamente durante la alimentación utilizando varias señales de retroalimentación post-digestivas que son críticos para la regulación de la alimentación 17, 18. Varios intentos se han hecho en los últimos años para la recolección de datos semi-automatizar en el ensayo PER 19, 20. El PER es detectado por una almohadilla eléctrica o una combinación de electrodos y contó a través del ordenador. Combinando el ensayo PER con la absorción de radioisótopos reveló que este ensayo está limitado por la baja sensibilidad a la detección de diferencias de alimentación cantidad 18. El ensayo manual de alimentación (MAFE) 21, en el que una mosca se alimenta manualmente con un capilar de vidrio, se ha desarrollado recientemente para determinar el consumo de alimento en una sola mosca inmovilizado. El ensayo MAFE elimina las interferencias de búsqueda de alimento y la alimentación de iniciación y tiene una resolución de tiempo de segundos, y la iniciación de POR y el consumo de alimentos puede ser controlada de forma independiente en el ensayo. Sin embargo, la forma en que la inmovilización de la mosca afecta ciertos aspectos de la conducta alimentaria (por ejemplo, la locomoción, la motivación) todavía tiene que ser investigado. Por sus excelentes exámenes comparativos de diferentes ensayos para medir el consumo de alimentos en Drosophila mílanogaster y para ayudar a los investigadores para encontrar el más adecuado, consulte los informes de Deshpande y Marx 13, 22.

El ensayo CAFE evita algunas de las desventajas de otros ensayos descritos anteriormente y combina la simplicidad de uso con la medición fiable de la ingesta de alimentos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo CAFE y que muestran una modificación sencilla configuración para reducir la evaporación. Los resultados representativos, incluyendo un ensayo de dos manjares (a corto y largo plazo) y la absorción de sacarosa de las moscas se demuestra. En la discusión comparamos nuestro método descrito con formas alternativas de realizar el ensayo CAFE, y poner de relieve las limitaciones potenciales.

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Protocolo

1. El Ensayo CAFE

NOTA: El ensayo consta de tres componentes: un vial experimental, una tapa específica y capilares micro. Una caja de plástico con tapa se utiliza para el transporte de los viales preparados y para controlar la humedad de manera más eficiente.

  1. Utilice una Drosophila melanogaster vial plástico de cultivo (opcional altura 8 cm, 3,3 cm de diámetro) como un tubo para el ensayo.
  2. Sellar el vial con una tapa de plexiglás fabricado que contiene una junta tórica (Figuras 1A, 1B). Cargar vuela tocando o con un soplete través de la abertura de la tapa central (0,9 cm de diámetro), que también permite la circulación de aire y de agua, y cerrar el agujero con un tapón de esponja. Seis aberturas cónicas de menor tamaño (0,4 cm de diámetro superior, de 0,3 cm de diámetro interno) rodean el orificio central y se ajustan a las puntas de pipeta 2 - volumen de 20 l para mantener los capilares en su lugar. (Véanse los gráficos complementarios para detalles técnicos de la tapa.)
    NOTA: El usode un tapón de esponja con aberturas para los capilares en lugar de la tapa a medida utilizado en nuestro manuscrito es posible. Nuestra tapa a medida permite una manipulación segura de los viales preparados minimizando el riesgo de capilares cayendo.
  3. Para presentar el alimento líquido, utilizar 5 Microcapilares mu L con 1 marca mu l. Coloque los capilares en las aberturas cónicas en la tapa cortando la parte superior de un 2 - l punta de pipeta 20 y la inserción de la punta en el orificio (Figura 1B, marcada con el borde rojo). Para evitar que las moscas se escape, sin cortar insertar un 2 - 20 l punta de la pipeta en la misma abertura.
  4. Para manejar con seguridad viales de múltiples preparados, colocarlos en una caja de plástico con una incrustación cuadriculada (Figura 2A).

2. Preparación de las moscas

  1. Mantener las moscas en la comida estándar a 25 ° C, 60% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad / 12 h 12 h.
  2. Para el control de las condiciones de cría, introducir 35 hembras vírgenes de unaD 15 hombres por cada grupo experimental en un vial de cultivo de plástico (altura 9,8 cm, 4,8 cm de diámetro) que contienen 50 ml vuelan alimentos. Permitir que las moscas pongan huevos durante los primeros 3 días, a continuación, transferir las moscas adultas a viales de alimentos frescos y dejar que ellos ponen sus huevos durante dos días más. Después de esto repetir la transferencia de nuevo. adulto descarte vuela después de 2 días más.
  3. Como la ingesta de alimentos depende del tamaño de la mosca, determinar el peso de un grupo de 100 moscas anestesiando de 2 a 3 días de edad, las moscas adultas usando una almohadilla mosca CO 2 y recogerlos en un tubo de plástico de 1,5 ml y midiendo con un estándar de escala de laboratorio. Determinar el peso en húmedo de al menos cuatro grupos de moscas independientes según el sexo (Tabla 1); utilizar el peso para calcular el consumo de alimentos l por mg mosca. Utilice el valor para determinar la cantidad de alimento que un solo mosca alimenta por experimento y ajustar el número de capilares llenos de alimentos en consecuencia para evitar el vaciado de los capilares por la alimentación.
    1. Para un 3 h de ensayo, el uso20 moscas y dos capilares llenos. Para un experimento a largo plazo (> 3 h y hasta 9 días), utilizar un grupo de ocho moscas con un suministro de cuatro capilares llenos (resultados fiables no se pueden obtener con menos de ocho moscas en las condiciones descritas).
  4. Moscas separados en grupos de 8 o 20 (moscas) después de la medición de peso bajo la exposición al CO 2. Transferir el grupo a un nuevo vial de alimentos (que contiene 15 ml de alimentos estándar) para permitir la recuperación de CO 2 sedación para 48 h antes del experimento. Utilice de 4 a 6 días de edad moscas para el ensayo CAFE.
  5. Como moscas de tipo salvaje no tiene hambre alimenta sólo de forma marginal 19, 21, pre-morir de hambre vuela por 3 h experimentos de alimentación. No se requiere ayuno cuando el consumo de alimento se controló a lo largo de varios días. Para el ayuno, la transferencia vuela 16 a 20 h antes del ensayo tocando suavemente en un vial que contiene sólo un diámetro de doblado de papel de filtro de 45 mm humedecido con ~ 0,5 ml ddH2 O (bidestilada agua), y se cierran con una tapa ensayo CAFE enchufado.

3. Preparación de alimentos líquidos

  1. Preparar a (% 10, w / v) 3 M solución de sacarosa rellenando 102,6 g de sacarosa (C 12 H 22 O 11) a 100 ml de ddH 2 O. Pipetear 3 l, 33 l, 333 l, 3,3 ml y 6,6 ml de la solución madre en un tubo de plástico 15 mL; Añadir 2 ml de colorante alimentario (para el rojo: La cochinilla [E124]; para el azul: índigo carmín [E132]) y rellenar hasta 10 ml con ddH 2 O. Las concentraciones resultantes son 0,001, 0,01, 0,1, 1, y 2 M de sacarosa .
    NOTA: El colorante alimenticio permite visualizar el menisco más fácilmente. Sin embargo, el tinte podría tener un impacto en la ingesta de alimentos. Para evitar un sesgo debido al colorante dispensar el colorante alimenticio o aleatorio el uso de colorantes a las muestras de alimentos durante el experimento y grupos.
  2. Para la prueba de alcohol pipeta de preferencia de 333 l de sacarosa al 3 M solución madre en un tubo de plástico de 15 ml.Añadir 1,5 ml (2,3 ml) de 100% EtOH (etanol) y se añade ddH 2 O hasta 10 ml para dar como resultado 15% (0,25 mM) y un 23% (0,39 mM) soluciones de trabajo.
  3. Mantener las soluciones madre a -20 ° C y soluciones de trabajo a 4 ° C; utilizar el plazo de 1 semana.
  4. Llenar hasta 10 capilares, al mismo tiempo con una solución de comida de color, por la fuerza capilar. Inserte los extremos de los capilares en la solución de sacarosa (que sostiene los capilares en un ángulo de 45 ° a la solución). Pare si el líquido llega a la parte superior (5 l) marca del capilar y eliminar el exceso de solución en el exterior y el interior con papel de seda.

4. Montaje y realización de las pruebas capilares Feeder

  1. Si no es necesario el ayuno, la transferencia de las moscas experimentales para el ensayo pulsando o soplete. Asegúrese de incluir tres viales de control sin moscas para cuantificar la evaporación.
  2. Retirar con cuidado una punta de pipeta (2 - volumen de 20 l) que se está cerrando una de las cierren y externags, e insertar un capilar de vidrio, el extremo inferior de lleno en primer lugar. Fije el capilar mediante la colocación de la punta de pipeta de nuevo al lado del capilar. Si hay varias soluciones de alimentos están siendo probados, repetir este procedimiento en consecuencia.
  3. Coloque el capilar termina en el interior de todos los viales en el mismo nivel para evitar el sesgo que podría ocurrir si las fuentes de alimentos se encuentran en diferentes alturas (3 - 4 cm de la tapa); mantener una distancia al papel de filtro para evitar que el capilar se fugue al tocar accidentalmente el papel de filtro o de diferentes viscosidades de las fuentes de alimentos.
  4. Etiquetar el extremo superior del líquido de color usando un rotulador (marca de inicio). Para asegurar que los diferentes capilares se pueden identificar, etiquetar de forma individual mediante un código de colores o rayas.
  5. Colocar varios ensayos CAFE preparadas dentro de una caja de plástico con incrustaciones cuadriculada y transferir la caja (Figura 2 A) a una posición segura en condiciones de laboratorio o en una con temperatura, clim luz y humedad controladascomió la cámara (parámetros: 25 ° C, 60% de humedad relativa, 12 h / 12 h ciclo de luz-oscuridad) durante el período experimental (por ejemplo, 3 horas o días).
  6. Como parte inferior de papel de filtro se seca si el ensayo se realiza durante varios días, aplicar agua fresca cada 24 h a través del tapón de esponja (100 l) para mantener constante la humedad en el interior del ensayo. Utilice cuatro viales separados (8 cm de altura, 3.3 cm de diámetro) con 30 ml de ddH2O como dispositivos de humedad y colocarlos al lado de los ensayos de café en la caja de plástico. Use una cubierta para la caja de plástico para crear un ambiente de humedad controlada durante el experimento (Figura 2A).
    NOTA: la variabilidad más amplio se produce en condiciones de laboratorio; Sin embargo, es factible realizar el ensayo CAFE a temperatura ambiente (por ejemplo., en un salón de clases). El uso de un dispositivo de humidificación (papel de filtro, con o sin un tapón de esponja mojada, frascos de agua y cubierta de llenado de la caja de plástico) es muy aconsejable para disminuir la evaporación ( Figura 2B).
  7. Reemplazar los capilares llenos con los recién para los experimentos a largo plazo cada 24 h. Tome nota de moscas muertas antes de cada intervalo de 24 horas y utilizar el número de moscas vivas para calcular el consumo per mosca para el período siguiente. Desechar los antiguos capilares después de medir la disminución del menisco (véase 5.1).
    NOTA: Durante un experimento de 3 h que casi no vimos ninguna moscas muertas. Durante un estudio de 4 días que normalmente encontramos 1 - 3 moscas muertas.
  8. Al final del ensayo o antes de cambiar el capilar, marcar el menisco inferior del capilar (extremo) marca con un rotulador mientras que el ensayo de café está todavía en la posición vertical. Descartar los datos en caso extremo marca no está por debajo de la marca inicial (marca de inicio). No quite la tapa, ya que esto podría cambiar el menisco.
  9. Retirar con cuidado los capilares a partir del ensayo y almacenarlos para la recolección de datos. Compruebe si el líquido en el interior del capilar alcanza el extremo inferior si no Discard los datos, ya que la comida no era accesible a las moscas. Recoger todos los capilares por vial como un grupo. Inserte las puntas de pipeta sin cortar en todas las aberturas para evitar que las moscas escapen. Desmantelar la instalación y lavar los frascos, tapas y tapones de esponja en un baño de jabón y secar durante la noche a temperatura ambiente para su uso posterior.
    NOTA: Las moscas pueden ser analizados después del ensayo. Confirmar la absorción de los alimentos por el ojo o con un microscopio de disección.
  10. Repetir los experimentos con los mismos genotipos en al menos tres días diferentes.

5. Recolección de datos y análisis

  1. Medir la distancia entre el comienzo y el final marca de marca en el capilar utilizando un calibrador o una regla. Para transferir datos directamente a una hoja de cálculo, utilice un puerto USB (Universal Serial Bus) calibrador digital (Figura 1E) conectado. Desechar los capilares después de la medición.
  2. Cuenta para el tamaño de capilar para calcular la absorción de alimentos o evaporación. Por ejemplo, considere un casquilloIllary que es de 73 mm de largo y contiene 5 l de solución de alimentación. Una disminución 14,6 mm en el menisco refleja la absorción de 1 l solución. Calcular la absorción de los alimentos utilizando la siguiente fórmula:
    la absorción de los alimentos (l) = distancia medida (mm) / 14,6 mm
  3. Para excluir el efecto de la evaporación en la ingesta de alimentos, calcula haciendo la media de evaporación en los viales de control de tres (como mínimo) y sin moscas. Restar este valor medio a partir del valor obtenido para el consumo de alimentos por las moscas.
  4. Utilice la siguiente fórmula para determinar el consumo total por mosca:
    El consumo de alimentos (l) = (alimentos captación de [l] - la pérdida por evaporación [l]) / número total de moscas en el vial. Para los experimentos a largo plazo utilizan el número de moscas vivas antes del inicio del intervalo de 24 h.
  5. Para dar cuenta de las diferencias en el tamaño del cuerpo, como por ejemplo entre las moscas macho y hembra, normalizar el consumo de alimentos con el peso corporal (l alimentos / mg mosca).
  6. Utilice el software estadístico para el análisis de datos. por normaaliado de datos distribuidas, T-pruebas el uso de los estudiantes para determinar las diferencias entre los dos grupos de moscas, y el uso de ANOVA (análisis de varianza) con pruebas post hoc de Tukey Cramer durante más de dos grupos. En una situación de elección, analizar las diferencias de elección al azar utilizando una prueba de los signos de una muestra no paramétrico.

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Resultados

Las moscas del genotipo w 1118 se utilizan para demostrar cómo se realiza el ensayo. Los w 1118 mutantes se utilizan comúnmente para generar líneas transgénicas y para controlar los antecedentes genéticos de transgenes marcado con el gen blanco. Normalmente, para los experimentos de comportamiento, todas las líneas transgénicas se retrocruzaron durante cinco generaciones a la misma w 1118 de valores, que se utiliza como...

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Discusión

El informe describe el ensayo de café en una manera paso a paso, centrándose en la configuración técnica y su desempeño exitoso en el laboratorio. Debido a su simplicidad, este ensayo también se podría utilizar educativamente como un experimento de la escuela. Los ejemplos muestran que el ensayo permite la investigación de la detección de alimentos, la preferencia y el consumo en Drosophila melanogaster durante períodos de tiempo cortos y más largos (horas o días). El ensayo CAFE se ha utilizado ampliamente en ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros pasados y presentes del laboratorio Scholz por su discusión y a Helga Döring por su excelente soporte técnico. Agradecemos especialmente a los miembros del taller Biocenter de la Universidad de Colonia por su apoyo y creatividad. El trabajo cuenta con el apoyo de SFB 1340, SysMedAlc y DAAD-Siemens.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Viales (cría)Greiner Bio-One960177
www.greinerbioone.com Vials (ensayo CAFE)Greiner Bio-One217101www.greinerbioone.com
Taller de ensayo Lid-CAFE––
Caja de plástico, pared bajaPlastime353
www.plastime.it Tapa para la caja de plásticoTaller––
CapilaresBLAUBRAND REF 7087 07 www.brand.de
Puntas de pipetaGreiner Bio-One771290www.greinerbioone.com
Círculos de papel de filtroWhatman10 311 804www.sigmaaldrich.com
D(+)-SacarosaAppliChem57-50-1www.applichem.com
Etanol absolutoVWR Chemicals20.821.330www.vwr.com
Colorante alimentario (rojo, E124)Backfun10027www.backfun.de
Colorante alimentario (azul, E133)Backfun10030www.backfun.de
Solución de jabón (CVK 8)CVH103220www.cvh.de
Calibrador digitalGARANT412.616www.hoffmann-group.com
Viales (cría)Altura 9,8 cm, diámetro 4,8 cm 
Viales (ensayo CAFE)Altura 8 cm, diámetro 3,3 cm
EnsayoProducido en taller universitario, dibujo técnico suministrado
Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Caja de plástico, paredUna incrustación de rejilla de plástico fue hecha a medida para 8 x 10 posiciones de viales 
Tapa para la cajaDimensiones (37 x 29 x 18 cm)
Capilaresnorma DIN ISO 7550,  Guía IVD 98/79 EG, extremos pulidos
PuntasLas pipetas para el círculo exterior se cortan de acuerdo con la tapa
Los círculos de papel de filtro de45 mm de diámetro funcionan bien si se pliegan para los viales utilizados
D(+)-SacarosaNo es dañino
AbsolutoLíquido y vapor altamente inflamables
Colorante alimentario (rojo, E124)No indicado
Colorante alimentario (azul, E133)No indicado
Solución jabonosa (CVK 8)Jabón de olor neutro
Calibrador
Alimento(para 20 L)
Agar160 g
Levadura299,33 g
Harina de1.200 g
Melaza1,6 L
Ácido57,3 mL
Nipagin 30%160 mL
Lid-CAFE baja de plástico de pipeta de etanol digital estándar para moscas de cerveza maíz propiónico

Referencias

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