Artículo de método

El cultivo de Caenorhabditis elegans En tres dimensiones en el Laboratorio

DOI:

10.3791/55048

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12 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

En este artículo

Resumen

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Se presenta un método sencillo de construir sistemas de cultivo de nematodos 3D llamados NGT-3D y NGB-3D. Éstos se pueden utilizar para estudiar la aptitud de los nematodos y los comportamientos en los hábitats que son más similares a los naturales Caenorhabditis elegans hábitats que las placas de cultivo estándar en 2D elegans C. laboratorio.

Resumen

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El uso de organismos modelo genéticos como Caenorhabditis elegans ha llevado a descubrimientos seminales en biología durante las últimas cinco décadas. La mayor parte de lo que sabemos sobre C. elegans se limita al cultivo en laboratorio de los nematodos, que puede no reflejar necesariamente los entornos en los que normalmente habitan en la naturaleza. El cultivo de C. elegans en un hábitat 3D que es más similar a la matriz 3D que los gusanos encuentran en frutas podridas y compost vegetativo en la naturaleza podría revelar nuevos fenotipos y comportamientos que no se observan en 2D. Además, los experimentos en 3D pueden abordar cómo los fenotipos que observamos en 2D son relevantes para el gusano en la naturaleza. Aquí, se presenta un nuevo método en el que C. elegans crece y se reproduce normalmente en tres dimensiones. El cultivo de C. elegans en el tubo de crecimiento de nematodos-3D (NGT-3D) puede permitirnos medir la aptitud reproductiva de las cepas de C. elegans o diferentes condiciones en un entorno 3D. También presentamos un método novedoso, denominado Nematodo Growth Bottle-3D (NGB-3D), para cultivar C. elegans en 3D para su análisis microscópico. Estos métodos permiten a los científicos estudiar la biología de C. elegans en condiciones que reflejan mejor los entornos que encuentran en la naturaleza. Estos pueden ayudarnos a comprender la relevancia evolutiva subyacente de la fisiología y el comportamiento de C. elegans que observamos en el laboratorio.

Introducción

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El estudio del nematodo Caenorhabditis elegans en el laboratorio ha llevado a descubrimientos seminales en el campo de la biología durante las últimas cinco décadas1. C. elegans fue el primer organismo multicelular en tener su genoma secuenciado en 19982, y ha sido invaluable para comprender las contribuciones de los genes individuales al desarrollo, la fisiología y el comportamiento de un organismo completo. Los científicos ahora están tratando de comprender mejor cómo estos genes pueden contribuir a la supervivencia y la aptitud reproductiva de los organismos en sus entornos naturales, haciendo preguntas sobre ecología y evolucióna nivel genético.

C. elegans una vez más puede proporcionar un excelente sistema para responder a estas preguntas. Sin embargo, se sabe poco sobre la biología de C. elegans en hábitats naturales de nematodos, y no existen métodos actuales para simular las condiciones naturales controladas de C. elegans en el laboratorio. En el laboratorio, C. elegans se cultiva en la superficie de placas de agar sembradas con la bacteria E. coli 6. En la naturaleza, sin embargo, C. elegans y los nematodos relacionados se pueden encontrar escasamente habitando en suelos de todo el mundo, pero se encuentran específicamente prosperando en frutas podridas y materia vegetal7,8. Estos entornos complejos tridimensionales (3D) son bastante diferentes de los entornos 2D simples a los que se exponen los gusanos en el laboratorio.

Para comenzar a responder preguntas sobre la biología de los nematodos en un entorno 3D más natural, hemos diseñado un hábitat 3D para el cultivo de nematodos en laboratorio al que llamamos Nematodos Growth Tube 3D o NGT-3D para abreviar9. El objetivo era diseñar un sistema de crecimiento en 3D que permitiera un crecimiento, desarrollo y fertilidad comparables a las placas estándar de los medios de crecimiento de nematodos (NGM)en 2D 10. Este sistema apoya el crecimiento de bacterias y nematodos durante todo su ciclo de vida en 3D, permite que los gusanos se muevan y se comporten libremente en tres dimensiones, y es fácil y económico de fabricar y emplear.

En el estudio actual, proporcionamos un método paso a paso para fabricar NGT-3D y evaluar el desarrollo y la fertilidad de los gusanos. Además de evaluar la aptitud de los gusanos en 3D, buscamos obtener imágenes, videos y evaluar el comportamiento y la fisiología de los gusanos en el cultivo en 3D. Así, además de NGT-3D, presentamos aquí un método alternativo llamado Nematodo Growth Bottle 3D o NGB-3D, para la obtención de imágenes microscópicas de C. elegans durante el cultivo en 3D. Esto será especialmente importante para el estudio de los comportamientos conocidos identificados en 2D, y la identificación de nuevos comportamientos exclusivos del cultivo en 3D.

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Protocolo

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1. Preparar soluciones para NGT-3D y 3D-NGB

  1. Preparar las siguientes soluciones estériles: 1 L de solución 0,1454 M de NaCl, 1 L de 1 M CaCl 2, 1 L de 1 M MgSO 4, Lisogenia Broth (LB), 1 L de 1 M KPO 4 tampón (108,3 g de KH 2 PO 4 y 35,6 g de K 2 HPO 4, y llenar H2O hasta 1 l). La producción de NGM el uso de estas soluciones se pueden encontrar en un protocolo anterior 10.
  2. soluciones autoclave a 121 ° C, 15 min.
  3. Preparar 50 ml de una solución estéril 5 mg / ml de colesterol. En un tubo cónico de 50 ml, mezclar 0,25 g de colesterol y 50 ml de 99,99% de etanol y se mezcla bien. No esterilizar en autoclave. Esterilizar la solución colesterol usando una jeringa de 50 ml con un filtro de jeringa de 0,45 micras. También se eliminará cualquier colesterol no disuelto.
  4. (Opcional) Preparar 10 ml de una 150 mM de 2'-desoxi-5-fluorouridina (FUdR) stock. En un tubo cónico de 15 ml, mezclar 0,3693 gde FUdR y 10 ml de agua destilada. Agitar bien.

2. Preparar Cultura de las bacterias para NGT-3D y 3D-NGB

  1. Inocular 10 ml de caldo LB con bacterias. Las bacterias habituales utilizados para la alimentación de C. elegans es E. coli cepa OP50.
  2. Cultura de la inoculación de bacterias a 37 ° C en una incubadora con agitación durante la noche.
  3. En la preparación para una dilución en serie, alícuotas 9 ml de la solución de NaCl en 15 ml tubos cónicos estériles. Por ejemplo, parte alícuota de 9 ml en un total de 7 tubos para hacer una dilución 10 -7 de la cepa OP50 E. coli.
  4. Usando una pipeta estéril 1,000 l, pipetear 1 ml de cultivo bacteriano o un cultivo bacteriano diluido en el nuevo tubo estéril con 9 ml de solución de NaCl y agitar bien la mezcla de 10 ml. Repita hasta que se alcanza la dilución bacteriana deseada.
    NOTA: La dilución bacteriana deseada depende del tipo y condición de bacterias, así como las condiciones experimentales exactas.Por ejemplo, un 10 -6 - dilución de la cepa de E. coli OP50 10 -8 era suficiente para producir a partir de 1 - 200 colonias por 6,5 ml tubo NGT-3D. Worms fiable desarrollan y se reproducen normalmente cuando el número de colonias era más de 60, que se produjo a una dilución de 10 -6-10 -7. Para NGB-3D, utilizar una dilución de 10 -8.

3. Hacer NGT-3D y 3D-NGB (200 ml)

  1. Después de la preparación del cultivo bacteriano, la mezcla 0,6 g de NaCl, 1 g de agar granulado, y 0,5 g de peptona en un matraz de 500 ml. Insertar una barra de agitación magnética en el matraz.
  2. Añadir 195 ml de agua destilada y cubrir la boca del matraz con papel de aluminio.
  3. Autoclave 121 ° C durante 15 min.
  4. Colocar el matraz en autoclave caliente sobre una placa de agitación, y se agita a una velocidad moderada durante al menos 2 horas. Se enfría el matraz a 40 ° C. Asegúrese de que se enfríe lo suficiente como para continuar de aquí a altas temperaturas puede dar lugar a pérdida de transparencia del agar acabado.Sin embargo, temperaturas más bajas pueden resultar en el endurecimiento prematuro de la agar.
    1. (Opcional) Para acelerar el proceso de enfriamiento, colocar el matraz en un baño de agua a 40 ° C 15 min antes de colocar sobre una placa de agitación.
  5. Cuando la temperatura de los medios de agar alcanza 40 ° C, añadir 200 l 1 M CaCl 2, 200 l de solución de colesterol 5 mg / ml, 200 l 1 M MgSO 4 y 5 ml 1 M KPO 4 tampón como la solución sigue agitar a concentraciones finales de 1 mM CaCl colesterol 2, 5 mg / ml, 1 mM MgSO 4, 1 mM KPO 4.
    1. (Opcional) Para el ensayo de vida útil NGT-3D añaden 80 l de FUdR 150 mM a una concentración final de 120 mM 12.
  6. Añadir 6 ml de los 10 ml de cultivo bacteriano diluido a partir del paso 2.4 en el matraz directamente.
    1. (Opcional) Para NGT-3D, retire 6 ml de medio de agar antes del paso 3.6 y mantenerlo caliente por separado. Este medio se utiliza para los libre de bacteriascapa superior.
  7. El uso de procedimientos estériles, prescindir de los medios de comunicación en una cámara de cultivo estéril. Asegúrese de que la cubierta de la cámara se cierra herméticamente.
    1. (Opcional) Para prevenir la formación de colonias de bacterias de la superficie superior de la agar, hacer una capa de libre de bacterias medios de agar de la etapa 3.6.1 en la parte superior antes de los medios de comunicación desde el paso 3.7 se endurece por completo. Esto creará una zona libre de bacterias en la parte superior de la NGT-3D.
    2. Para NGT-3D, verter 6,5 ml de medio a los 8 ml tubos de ensayo de plástico transparente para hacer una capa de agar bacterias, y dispensar cuidadosamente 200 l de los medios de comunicación libre de bacterias en la parte superior de los medios de comunicación semi-endurecido 3D para hacer una fina bacterias- capa libre en la parte superior.
    3. Para NGB-3D, verter 65 ml de medio a los 25 cm de botella de cultivo de células de plástico transparente 2. Esta cantidad debe llenar el cuerpo de la 25 cm botella de cultivo 2 celular.
  8. Deja cámaras verticalmente a temperatura ambiente durante una semana para permitir que las colonias bacterianas que crecena un tamaño considerable de al menos 1 mm de diámetro.
    1. (Opcional) Para el ensayo de vida útil en NGT-3D, cámaras de cubierta con papel de aluminio para evitar la degradación de la luz de FUdR.

4. Medir la aptitud de la población de gusanos en NGT-3D (Cría relativa Ensayo de tamaño)

  1. Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recogida y traslado en una placa de NGM sin bacterias. Permitir que el gusano se mueva libremente alrededor de unos pocos minutos para eliminar bacterias adheridas a su cuerpo.
  2. Repita el paso 4.1 y asegúrese de que el gusano está libre de bacterias. En general, dos repeticiones de 4.1 son suficientes.
  3. Con cuidado, coloque el gusano limpia en la superficie de los medios de comunicación en 3D con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
  4. Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, pero evitando el secado de los medios de agar.
  5. Incubar durante 96 horas a 20 ° C.
  6. Después de 4 días, cerrar las tapas firmemente y coloque lacámara de cultivo NGT-3D en un baño de agua a 88 ° para fundir el agar. El calor mata los gusanos pero sus cuerpos permanecen intactos.
    NOTA: El uso de tubos de 8 ml de NGT-3D, 20 - 30 min de incubación suele ser suficiente.
  7. Usando una pipeta de vidrio, transferir los medios fundidos en un 9 cm placa petri de plástico. No se recomiendan pipetas de plástico, como los gusanos pueden a menudo se adhieren a ellos.
  8. El uso de un microscopio de disección estéreo de transmisión, contar el número de gusanos en la L3, L4 y etapas adultas. No contar los gusanos que son L2 escenario y más joven, ya que las generaciones F1 y F2 se pueden confundir aquí. Por lo tanto, este ensayo es un ensayo de tamaño de la camada relativa en lugar de un total de ensayo tamaño de la camada.

5. Imagen y comportamiento de estos animales en el Registro NGB-3D

  1. Escoja un gusano de L4 etapa usando un alambre de platino recoger y eliminar las bacterias adheridas a la superficie mediante la transferencia a una placa de NGM sin bacterias y permitiendo que se mueva libremente durante unos minutos.
  2. Repita el paso 5.1 para asegurarse de que el worm está libre de bacterias.
  3. Colocar con cuidado el gusano limpio en el centro de la superficie de agar de la NGB-3D cerca del cuello de la botella con un pico alambre de platino. El gusano, finalmente, debe entrar en el agar agar en la matriz 3D.
  4. Cierre la tapa sin apretar que permite un poco de aire para entrar en el tubo, al tiempo que evita el secado de los medios de agar.
  5. Imagen o grabar el gusano bajo un microscopio de disección estéreo de transmisión. Ajuste el enfoque como el gusano se mueve a través de la matriz 3D.

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Resultados

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La construcción de NGT-3D es un protocolo simple y directo que resulta en un tubo de ensayo de agar-llena de pequeñas colonias bacterianas espaciados en todo el agar (Figura 1A). Los gusanos pueden moverse libremente a través de la matriz de agar, la búsqueda y el consumo de las colonias bacterianas. Para confirmar si C. elegans pueden reproducirse y crecer normalmente en NGT-3D, se comparó la fertilidad y el desarrollo de las larvas en 3D con placas estándar 2D...

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Discusión

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El cultivo de laboratorio de C. elegans usando las placas de medio de crecimiento de nematodos clásicos fue crucial para los cientos de descubrimientos importantes que la investigación en C. elegans ha proporcionado. A continuación, presentamos nuevos métodos para cultivar C. elegans en un entorno que refleja con mayor precisión sus hábitats naturales tridimensionales. Aunque otros métodos se han utilizado para observar C. elegans en 3D 13, este es el primer protocolo que p...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por un investigador de Nueva Concesión [2014R1A1A1005553] de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) para JIL; y la Universidad de Yonsei líder futuro desafío de Grant [2015-22-0133] para JIL

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caldo LB, Miller (Luria-Bertani)Difco224620
Cloruro de sodioDAEJUNG7548-440058.44 MW
Agar, GranuladoDifco214530
PeptonaBacto211677
Cloruro de calcio, dihidratadoBio BasicCD00502*H2O; 147.02 MW
ColesterolBio BásicoCD0122386.67 MW
Alcohol etílicoB& JRP090-199,99%; 46,07 MW
Sulfato de magnesio, anhidroBio BasicMN1988120,37 MW
Fosfato de potasio, monobásico, anhidroBio BasicPB0445136,09 MW
2'-Desoxi-5-fluorouridinaTokio Industria QuímicaD2235246,19 MW
Fosfato de potasio, dibásico, anhidroBio BasicPB0447174,18 MW
Tubos de ensayo multiusosStockwell ScientificST.8570Cierres
de tubos de ensayo deStockwell ScientificST.8575
Matraz de cultivo celularSPL Lifescience7012525 cm2
Research Microscopio estereoscópicoNikonSMZ18
Cabezal de cámara en color de alta definiciónNikonDS-Fi2
Unidad de control basada en PCNikonDS-U3
NIS-Elements Investigación básica, software de imagen de microscopioNikonMQS32000
8 ml

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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