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Artículo de método

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

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DOI:

10.3791/55060

⸱

23 de abril de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Aix-Marseille Université, CNRS, UMR 7325, CINaM, 2State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science of Jiangnan University

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.

Resumen

Actualmente existe un gran interés en la creación de matrices ordenadas de islas de proteínas adhesivas en un mar de superficie neutralizada para estudios biológicos celulares. En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que las células vivas responden, no sólo a la naturaleza bioquímica de las moléculas que se les presentan, sino también a la forma en que se presentan estas moléculas. La creación de proteínas micro-patrones tanto, es ahora estándar en muchos laboratorios de biología; nano-patrones son también más accesible. Sin embargo, en el contexto de interacciones célula-célula, hay una necesidad de patrón no sólo proteínas sino también bicapas lipídicas. Tal patrón de doble proteo-lipídica hasta ahora no ha sido fácil acceso. Ofrecemos una técnica fácil para crear proteínas nano-puntos apoyados sobre vidrio y proponer un método para rellenar el espacio entre puntos con una bicapa lipídica compatible (SLB). Desde foto-blanqueo de trazador lípidos fluorescentes incluyen en la SLB, se demuestra que la bicapa exhibe considerable en-plane fluidez. Funcionalización de los puntos de proteínas con grupos fluorescentes nos permite la imagen de ellos y demostrar que están ordenados en una red hexagonal regular. El tamaño típico de punto es de aproximadamente 800 nm y la separación demostrado aquí es de 2 micras. Se espera que estos sustratos para servir como plataformas útiles para la adhesión celular, la migración y estudios mecano-de detección.

Introducción

La adhesión celular se lleva a cabo a través de moléculas especializadas de adhesión celular (CAMs), las proteínas presentes en la membrana celular que son capaces de unirse a su contraparte en la matriz extracelular o en otra célula. En células adheridas, la mayoría de las moléculas de adhesión, incluyendo la integrina ubicua y cadherina, se encuentran en la forma de los grupos 1. La interacción de los linfocitos T (células T) con células presentadoras de antígeno (APCs) proporciona una ilustración particularmente notable de la importancia de grupos de receptores formados en la interfaz entre las dos células - menudo se llama una sinapsis inmunológica. Tras la formación de la primera contacto con los receptores de las células APC, T (TCR) en la superficie del encofrado de celdillas micras racimos escala T que sirven como señalización de las plataformas 2, 3, 4, y son finalmente centralizado para formar un clúster supramolecular central más grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recientemente, se demostró que en el lado de APC, los ligandos de la TCR también se agrupan 8.

En el contexto de la interacción de células T-APC, el despliegue de sistemas híbridos, en el que el APC es imitado por una superficie artificial funcionalizado con proteínas relevantes, se ha avanzado en gran medida nuestra comprensión de la interfaz sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . En este contexto, es muy relevante para diseñar APC superficies miméticas que capturan uno o más aspectos de la célula diana. Por ejemplo, si los ligandos se injertan en bicapas lipídicas compatibles, que pueden difundirse en el plano de la bicapa, imitar la situación en la superficie de APC y al mismo tiempo permitir la formación de lacSMAC 6, 7. Del mismo modo, los racimos en la APC se han imitado mediante la creación de islas de ligandos en un mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. Sin embargo, estas dos características hasta ahora no han sido combinados.

Aquí se describe una nueva técnica para crear nano-puntos de anti-CD3 (un anticuerpo que se dirige el complejo TCR), rodeada por una bicapa lipídica con lípidos que se difunden. La bicapa se deposita usando Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer técnica 7, 15, 16 y si se desea, podría ser funcionalizada con una proteína específica - por ejemplo, el ligando de la integrina de células T (llamado ICAM1). Además, el anti-CD3 puntos de proteínas COUld ser reemplazado con otro anticuerpo o CAM. Si bien hemos elegido las proteínas para uso futuro como plataforma para los estudios de adhesión de células T, la estrategia se detalla aquí se puede adaptar para cualquier proteína e incluso ADN.

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Protocolo

1. limpieza de vidrio Cover-toboganes y cámaras de observación

  1. Organizar el vidrio de cubierta-se desliza sobre una bandeja de múltiples de cremallera realizado en un material inerte como politetrafluoroetileno (PTFE).
  2. Sumergir la bandeja con toboganes y la cámara de observación en una solución de tensioactivo (cualquier producto recomendado para la limpieza de cubetas de cuarzo es adecuado).
  3. El uso de un baño ultrasónico, ultra-sonicado en la solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
  4. Enjuagar 5 veces con agua ultrapura (18,2 MΩ.cm, 0,059 S / cm).
  5. Ultra-sonicado en solución de tensioactivo durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
  6. Enjuague 10 veces con agua ultrapura.
  7. Repetir los pasos 1.5 y 1.6 dos veces.
  8. Tienda en agua a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C) durante hasta una semana.

2. La fabricación de proteínas Nano-puntos

  1. La deposición de perlas
    1. Deposit la suspensión de perlas de sílice (2% v / v, 70 l) gota a gota en una cubierta de corredera (24 x 24 mm, espesor de 170 micras) mantenidos a una inclinación de 15 grados.
    2. Deje que la suspensión se extendió durante aproximadamente 1 min, mientras que dar la vuelta al vidrio de 90 ° cada 15 s.
    3. Permitir que el líquido se evapore en condiciones ambientales.
    4. Almacenar en un vidrio limpio o cámara de PTFE en condiciones ambientales durante hasta 2 días.
  2. La deposición de aluminio
    1. Colocar los portaobjetos (preparado en la sección 2.1) dentro de una frecuencia de radio magnetrón (RF) equipo de pulverización catódica 8, sobre una mesa que gira a una distancia de aproximadamente 105 mm a partir de una aleación de aluminio (99%): silicio (1%) de destino.
    2. Bomba abajo de la cámara de deposición a 2,6 x 10 -4 Pa utilizando una bomba turbo-molecular. Este paso es importante para la eliminación de posibles impurezas gaseosas.
    3. Introducir pura atmósfera de argón (5 N, 99,999%) con un flujo de 10 sccm a una presión de 0,8 Pa (6,6 mTorr).
      NOTA: El flujo de argón entrante está controlado por un controlador de flujo másico y la presión del proceso se monitoriza utilizando un medidor de presión. El flujo de gas argón es continua y es controlado por un equilibrio entre la entrada y las válvulas de abertura de salida.
    4. Encender el generador de potencia de RF.
      NOTA: En este caso, se utilizó un rango típico de 400-600 W de potencia de radiofrecuencia a 13,56 MHz de frecuencia. El generador de RF se utiliza con una red de adaptación en un modo de acoplamiento de plasma capacitivo. La potencia reflejada se supervisa y se reduce al mínimo el uso de la adaptación de la red.
    5. Después se estabiliza el plasma, por pulverización catódica durante 2 minutos manteniendo el obturador cerrado para eliminar posibles impurezas de la superficie del objetivo.
    6. Abra el obturador y permitir la pulverización catódica para continuar durante 60 min para depositar aluminio sobre el portaobjetos de vidrio hasta un espesor de 200 nm.
    7. Cortar el flujo de argón, cerrar la válvula de compuerta para aislar la bomba turbomolecular de la cámara de deposición y ventilar la cámara con limpio nitrogen para obtener la presión ambiente. Recuperar los portaobjetos de aluminio recubiertos. Almacenar durante un máximo de un mes en una caja de vidrio o PTFE limpio y herméticamente cerrado en condiciones ambientales.
  3. deposición de vapor de organosilano
    1. Sumergir el portaobjetos recubierto de aluminio preparado en la etapa 2.2.6 en agua ultrapura a temperatura ambiente y ultra-sonicado durante 30 s en un baño ultrasónico (50 W, 50/60 Hz, entre 20 y 30 ° C).
    2. Depósito de 0,5 ml de (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) en la parte inferior de un desecador.
      PRECAUCIÓN: APTES es un organosilano, que se evapora fácilmente y es tóxico. APTES deberán ser manejados solamente bajo una campana de flujo y con guantes.
    3. Poner los portaobjetos de vidrio (preparado en 2.3.1) en una cuadrícula de cerámica y el lugar en el interior del desecador.
    4. Conectar el desecador a una bomba de membrana y correr a la máxima potencia durante 30 min para generar un vacío bajo.
    5. Cierre la válvula del desecador y apagar la bomba.
    6. Calentar el desecadora aproximadamente 50 ° C durante 1 h.
    7. Abrir el desecador y recoger las diapositivas.
    8. Transferencia a otro desecador limpio para almacenamiento de hasta 48 h a temperatura ambiente (20 a 30 ° C).
  4. La deposición de la primera capa de proteína - albúmina de suero bovino marcado con biotina (BSA-biotina)
    1. Coloque una de las diapositivas preparadas en el apartado 2.3 sobre un soporte de PTFE.
    2. Depósito de 1 ml de 25 mg / ml de BSA-biotina disuelto en tampón fosfato salino (PBS). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (20 a 30 ° C).
    3. Enjuague 10 veces con PBS. Almacenar la muestra para un máximo de 24 horas a 4 ° C lejos de la fuente de luz.
  5. La eliminación de máscara de aluminio
    1. Incubar los portaobjetos en una solución de NaOH en PBS (preparado por adición gota a gota de NaOH 1 M a aproximadamente 100 ml de PBS para obtener pH≈12) durante la noche a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
      PRECAUCIÓN. NaOH es corrosivo y debe ser manejado usando guantes.
    2. Enjuague10 veces en agua ultrapura.

3. Deposición de Apoyado bicapa lipídica (SLB)

  1. La limpieza de la artesa de Langmuir
    1. Eliminar el agua en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir usando una bomba.
    2. Limpiar con una toalla desechable no tejido sin pelusa humedecido en cloroformo.
      PRECAUCIÓN. El cloroformo es tóxico y debe ser manipulada en un área bien ventilada, con una máscara (o bajo una campana de flujo) y con los guantes apropiados.
    3. Limpio 4 veces con agua ultrapura tibia (40 a 50 ° C).
    4. Limpias al menos 6 veces con agua ultrapura frío.
  2. La deposición de la primera capa de lípidos
    1. Colocar bandejas de PTFE en el recinto de PTFE de la artesa de Langmuir y luego llenarlo con agua ultrapura.
    2. Utilice el software de control del aparato de Langmuir para ajustar la presión medida a 0 mN / m.
    3. Usar una jeringa de vidrio impermeable a los gases / metal para depositar 30 l de una solución de lípidos 1 mg / mL (1, 2-dioleoil sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) en cloroformo) en la superficie del agua. El cloroformo se evapora y las moléculas lipídicas forman espontáneamente una monocapa.
    4. Utilice el software de control para comprimir la monocapa lipídica mediante el cierre de la barrera de PTFE hasta la presión deseada (27 mN / m para DOPC) se alcanza.
    5. Utilice el software de control para sumergir el portaobjetos de vidrio preparado en la sección 2.5.2 en el recinto PTFE mediante una abrazadera motorizado.
    6. Mantenga la corredera, en la abrazadera, perpendicular a la interfaz aire-agua. Utilice el software de control para aumentar lentamente (15 mm / min) a través de la interfaz, mientras que el mantenimiento de una presión constante a 27 mN / m.
    7. Colocar en un ambiente seco, ya sea para uso inmediato o para el almacenamiento de hasta 24 h a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
  3. La deposición de la segunda capa lipídica
    1. Mantener la presión de la superficie en la cubeta de Langmuir en el valor deseado de 27 mN / m. Comprimir usando elsoftware de control del aparato de Langmuir y / o añadir una pequeña cantidad de lípido para alcanzar la presión deseada.
    2. Colocar los portaobjetos de vidrio que llevan la monocapa lipídica, preparada en la sección 3.2.6, horizontalmente en la superficie del agua. Asegúrese de que cada corredera está flotando por encima de una bandeja de PTFE.
    3. Empuje los portaobjetos de vidrio hacia abajo, una diapositiva a la vez, en su bandeja de PTFE correspondiente usando PTFE o de metal pinzas de tal manera que se sumergen en el agua. Evite inclinar las diapositivas mientras empuja.
    4. Utilizar PTFE o de metal pinzas para transferir las bandejas que contienen PTFE las diapositivas en un cristalizador lleno de agua ultrapura asegurándose de que las diapositivas no se exponen al aire.
    5. Utilice PTFE o de metal pinzas para transferir, durante el trabajo bajo el agua, un portaobjetos de vidrio recubiertos con bicapa en una cámara de observación.
      NOTA: La cámara de observación se coloca bajo el agua en el interior del cristalizador. La cámara de observación se hace y se compone de un anillo de PTFE con una una junta de goma de encargocarcasas de acero D, que se pueden montar bajo el agua para hacer una cámara estanca al agua, cuya superficie inferior está hecho de la placa de vidrio previamente revestida con la bicapa lipídica.
    6. Cerrar la cámara sin dejar de trabajar bajo el agua y asegurar que aproximadamente 1 ml de agua queda atrapada dentro de la cámara.
    7. Tomar la cámara ensamblada fuera del agua. Asegúrese de que está libre apretado de agua y las fugas.
    8. Reemplazar las 1 ml de agua ultrapura presente en la cámara de observación con PBS mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces. Asegúrese de que la cámara nunca es desprovisto de líquido.
  4. SLB etapa de bloqueo
    1. Introducir 100 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en la cámara de observación que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.3.6 y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
    2. Enjuague la bicapa mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS 10 veces. La bicapa puede ser mantenido 24 horas a 4 ° C.

4. La funcionalización con ligandos

  1. Añadir fluorescente o neutravidina no fluorescente (NAV, una versión desglicosilada de la avidina no cargado a pH 7) a 2 mg / ml en la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2 durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° DO).
  2. Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces.
  3. Añadir biotinilado anti-CD3 a 2 mg / ml a la cámara que contiene el portaobjetos preparado en el apartado 3.4.2. Para doble funcionalización del SLB y los puntos, añadir Fc-ICAM-1 His-tag en 5 mg / ml (aquí, la bicapa está hecho de DOPC + 1% de lípidos de ácido nitrilotriacético (NTA)). Dejar durante 30 min a temperatura ambiente (entre 20 y 30 ° C).
  4. Enjuague mediante la adición y la eliminación de 500 l de PBS 10 veces
  5. Sustituir el PBS con medio celular (PBS + BSA al 0,1%) mediante la adición y la eliminación de 500 l de medio celular 10 veces.
  6. Deja 200 l de medio celular en el chambeR con la diapositiva.
  7. Coloque la cámara durante 10 min a 37 ° C antes de añadir las células.

5. deposición de células (véase la referencia 7 para más detalles)

  1. depositar cuidadosamente 400! l de la suspensión celular en la cámara. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C.
  2. Fijar la célula con 2% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min a 37 ° C. Sustituir el PFA con PBS mediante la eliminación y la adición de 500 l de PBS repetido.

6. Observación

  1. Proteo-lipídica Nano-patrón y fluidez SLB
    1. Utilice un microscopio de fluorescencia a la imagen del patrón de proteínas en el modo de epi-fluorescencia utilizando longitud de onda apropiada de iluminación (639 nm) y cubos de filtro (por ejemplo, aquí, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688).
      NOTA: La intensidad de la señal se puede cuantificar para estimar la cantidad de proteína dentro y fuera del punto. Utilice una longitud de onda apropiada de iluminación (330 nm) y fcubo ILTER a la imagen de la bicapa (BP 365/12, FT 395, LP 397), que aparece brillante con agujeros oscuros.
    2. Utilice fotoblanqueo continua (CPB) técnica 13, 15 para medir la constante de difusión de los lípidos de trazador en la bicapa. Esta observación se hace preferiblemente justo después de la deposición SLB.
      NOTA: Para cuantificar la constante de difusión, se miden dos parámetros durante el proceso de CPB: el tiempo de blanqueo específica del colorante (tensa) y la longitud de decaimiento del perfil fluorescente del halo formado alrededor del área blanqueada (TAUD). El primero se obtiene mediante el trazado de la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia en el centro del campo iluminado durante el proceso de CPB. El segundo se obtiene representando el perfil de intensidad en el borde de la zona iluminada (promediado sobre 12 líneas y 5 imágenes después de que se alcanza el estado estacionario). Las curvas se ajustaron a obtener tensa y TAUD. La constante de difusión viene dada por tauD 2 / tensa (D = figure-protocol-1 ).

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Resultados

Las imágenes de fluorescencia se analizaron para medir el espaciamiento y tamaño de los puntos. Se encontró espaciamiento Típica ser 1900 ± 80 nm y dot-tamaño típico fue de 600 ± 100 nm (Figura 1g). La separación es fijado por el tamaño de las perlas usadas para la máscara. El tamaño de punto se establece por el cordón de tamaño, así como condiciones de deposición. El SLB se deposita únicamente alrededor de los puntos de proteínas y no en ellos (Figura 2),

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Discusión

Los pasos críticos en el protocolo descrito anteriormente se relacionan con la formación de la proteína nano-puntos o la parte posterior de llenado del espacio alrededor de los puntos por una bicapa de lípidos compatible. El primer paso crítico con respecto a la proteína de nano-puntos es la preparación de la perla-máscara. La limpieza de la cubierta de corredera es crítica. Los portaobjetos necesitan ser limpiados o bien con una solución de detergente que se recomienda para la limpieza de cubetas de cuarzo, o con plasm...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Laurent Limozin, Pierre Dillard y Astrid Wahl para continuar un debate fructífero sobre aplicaciones celulares. Agradecemos también a Frederic Bedu desde las instalaciones de sala limpia PLANETE por su ayuda con las observaciones de SEM. Este trabajo fue financiado en parte por el Consejo Europeo de Investigación a través de la subvención Nº 307104 FP / 2007-2013 / CEI.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cubreobjetos de vidrioAssistent, Karl Hecht KG 
tensioactivo alcalino
UltrasonidoThermoFisher
DeseccatorLabbox
Shott
NeutravidineThermo Fischer Scientifique84607
PBS Sigma-aldrichP3813
Agua MQ ELGA, Veolia Francia
Perlas de síliceCorpuscular Inc147114-10
APTESSigma-aldrichA3648
BSA-BiotinaSigma-aldrichA8549
DOPCAvanti Lípidos Polares850375C
Dansyl-PEAvanti Lípidos Polares810330C
CloroformoSigma-aldrich650471
Jeringa hermética al gas Dominique Dustcher , Francia74453
Balanza de películaNIMAMicroscopio medio
Zeiss, AlemaniaSistema
Blanco de aluminio Kurt J. Lesker Compagny, EE. UU
Sistema de pulverización catódica de magnetrón de radiofrecuencia; me Herramienta SMC 600 modificada por ALCATEL , Francia
Cámara de observación Concentrado de casero (Hellmanex)Hella Analytics 9-307-011-4-507 Crystallizer TIRF-III.

Referencias

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