La cirugía de derivación, un cateterismo derecho, y Vascular Morfometría en un modelo de rata de flujo inducido por la hipertensión arterial pulmonar

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para crear un modelo de hipertensión arterial pulmonar (HAP) inducida por flujo en ratas y los procedimientos para analizar los principales criterios de valoración hemodinámicos e histológicos en este modelo.

Resumen

En este protocolo, la HAP se induce combinando una inyección de monocrotalina (MCT) de 60 mg/kg con un aumento del flujo sanguíneo pulmonar a través de una derivación aorto-cava (MCT+Flow). La derivación se crea insertando una aguja de 18-G desde la aorta abdominal hasta la vena cava adyacente. Se ha demostrado que el aumento del flujo pulmonar es un desencadenante esencial de una forma grave de HAP con distintas fases de progresión de la enfermedad, caracterizada por hipertrofia medial temprana seguida de lesiones neointimales y oclusión progresiva de los pequeños vasos pulmonares. Para medir la hemodinámica cardíaca y pulmonar derecha en este modelo, el cateterismo cardíaco derecho se realiza mediante la inserción de una cánula rígida que contiene un catéter flexible de punta esférica a través de la vena yugular derecha hasta el ventrículo derecho. A continuación, el catéter se introduce en las arterias pulmonares principales y más distales. La histopatología de la vasculatura pulmonar se evalúa cualitativamente, puntuando los vasos pre e intraacinares en función del grado de musculatura y la presencia de neoíntima, y cuantitativamente, midiendo el grosor de la pared, la relación pared-luz y la puntuación de oclusión.

Introducción

El objetivo de este método es para crear un modelo reproducible para la hipertensión arterial pulmonar grave, inducida por el flujo en ratas y para medir su principio hemodinámica y puntos finales histopatológicos.

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un síndrome clínico que abarca un aumento progresivo de la resistencia vascular pulmonar que lleva a insuficiencia ventricular derecha y la muerte. Dentro del espectro de la enfermedad de orden superior de las enfermedades hipertensivas pulmonar (HP), HAP es la forma más grave y uno que se queda sin una cura ^1. La arteriopatía subyacente en la HAP se caracteriza por una forma típica de la remodelación vascular que ocluye la luz del vaso. Muscularization de buques no muscularized normales y la hipertrofia de la capa de vasos medial son considerados como fenómenos iniciales de la enfermedad en la HAP, se observan también en otras formas de HP ^2, y se cree que son reversibles ^3. Como un HAPVANCES, la capa íntima comienza a remodelar, formando lesiones característicos de la neoíntima ^2. De tipo neointimal remodelación vascular pulmonar es exclusivo de HAP y en la actualidad es considerado como irreversible ^4.

Dado que los HAP es una enfermedad rara, los avances en su comprensión patobiológico y el desarrollo de nuevas terapias se han basado en gran medida en modelos animales. El modelo monocrotalin (MCT) en ratas es un modelo simple golpe solo que ha sido, y todavía es, utiliza con frecuencia. MCT es una toxina que causa daño a las arteriolas pulmonares y la inflamación regional ^5. 60 mg / kg MCT conduce a un aumento en la presión arterial pulmonar media (PAPm), resistencia vascular pulmonar (PVR) y la hipertrofia ventricular derecha (RVH) después de 3 - 4 semanas ^6. La histomorfología se caracteriza por hipertrofia de la media aislada y sin lesiones neoíntima ^5. El MCTpor lo tanto modelo de rata representa una forma moderada de PH, y no PAH, aunque se presenta comúnmente como el último.

En los niños con HAP asociada a una derivación congénita de izquierda a derecha (HAP-CPC), el aumento del flujo sanguíneo pulmonar es considerado como el desencadenante esencial para el desarrollo de lesiones de la neoíntima ^{7, 8, 9.} En ratas, el aumento de flujo sanguíneo pulmonar puede ser inducida por la creación de una derivación entre la aorta abdominal y la vena cava, una técnica descrita por primera vez en 1990 ^10. Alternativas para crear un aumento del flujo pulmonar son por neumonectomía unilateral o por subclavia para anastomosis de la arteria pulmonar ^11. desventajas conceptuales de estos modelos consisten en el potencial de crecimiento compensatorio del pulmón restante y activación de la vía de adaptación inducida por la neumonectomía, o de lesión iatrogénica de la vasculatura pulmonar debidapara la anastomosis de la arteria pulmonar, tanto confundiendo a los efectos del aumento del flujo sanguíneo pulmonar.

Cuando se crea una derivación aorto-cava y un aumento del flujo sanguíneo pulmonar es inducida como un segundo golpe en ratas MCT-tratada, se producen lesiones de la neoíntima característicos, y una forma grave de la HAP y la insuficiencia ventricular derecha asociada (FVR) se desarrollan entre 3 semanas después de que el aumento flujo ^12. La progresión hemodinámica de HAP en este modelo se puede evaluar in vivo mediante ecocardiografía y cateterismo cardíaco derecho. La histomorfología vascular, grosor de la pared del vaso, grado de oclusión de las arteriolas, y los parámetros para el fallo del ventrículo derecho forman los pilares de la caracterización ex vivo de la HAP.

Este método describe protocolos detallados para la cirugía de derivación aorto-cava (AC-shunt), el cateterismo derecho, y la evaluación cualitativa y cuantitativa de histomorfología vascular.

Protocolo

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Comité Central de Holanda para la Experimentación Animal y el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad del Centro Médico de Groningen (Países Bajos). Se utilizaron ratas Wistar y ambos Lewis con pesos entre 180 y 300 g.

1. Vivienda y aclimatación

1. Después de la llegada a la instalación central de los animales, las ratas de las casas en grupos de 5 por jaula. Durante un período de aclimatación de 7 días, las ratas acostumbrar a la manipulación humana, pero no realice ningún procedimiento experimental.

2. Preparación y la inyección de estéril Monocrotalin

1. Para 1 ml de 60 mg / mL monocrotalin (MCT) solución, pesar 60 mg de monocrotalin en un tubo de 2 ml. Añadir 700 l de 0,9% de NaCl. Añadir 200 l de HCl 1M. Calentar la solución en el tubo bajo agua del grifo corriente caliente y agitar él. Usar NaOH 6 N para llevar el pH hacia 7,0. Utilice una técnica estéril para la preparación de la PCM para su inyección en los roedores.
Inyectar 1 ml de solución estéril ml 60 mg / MCT por kg por vía subcutánea en el cuello (0,3 ml de 60 mg / ml para un MCT 300-g rata). NOTA: No prefiero usar volúmenes más pequeños debido a la mayor probabilidad de que la dosis inyectada, no será apropiado.

La cirugía de derivación 3. aorta-vena cava

1. Anestesia.
   1. Llenar la cámara de inducción con isoflurano 5% / 100% de _O2 (caudal: 1 L / min) y colocar la rata en la cámara. Compruebe si hay una adecuada profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie trasero. Pesar la rata.
   2. Afeitarse y limpiar el abdomen sobre un área que es de aproximadamente 8 cm de largo y 3 cm de ancho. Coloque la rata en su espalda sobre una estera de calor (37 ° C) cubierto por una estera estéril.
   3. Coloque el hocico en una ventilación de la máscara / capucha con 2 - 3% de isoflurano / _O2 al 100% (flujo: 1 L / min). Comprobar la profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie trasero. Aplicar ungüento para los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
2. shunt SurGery.
   1. Frote la piel con cloruro-hexidine para la desinfección. Inyectar 0,01 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia postoperatoria.
   2. Utilizar instrumentos estériles para la cirugía. Hacer una incisión con una hoja de bisturí # 10 en el abdomen en la línea media, a partir de 1 cm por debajo del diafragma una se extiende hasta justo por encima de los genitales.
   3. Levante el intestino grueso con un hisopo de algodón, cubrir los intestinos en una gasa estéril y húmedo (0,9% NaCl), y colocarlos en el lado izquierdo del animal.
   4. Use hisopos de algodón para separar las membranas que unen la aorta abdominal y la vena cava inferior a los tejidos circundantes.
      NOTA: No diseccionar las membranas entre la aorta y la vena cava.
   5. El uso de pinzas en astilla, eliminar la grasa perivascular aorta justo por encima de la bifurcación, sólo en el lado derecho de la aorta y sólo en el sitio donde se insertará la aguja.
   6. Use hisopos de algodón para separar la aorta y la vena cava de 2 mm superior al lugar donde se insertará la aguja con el fin de crear espacio para una abrazadera Biemer.
   7. En esta área, colocar primero una ligadura floja (5-0 sutura) alrededor de la aorta. Crear tensión en la ligadura mediante la colocación de una pinza de Kocher en él, y luego colocar el Kocher superior a la incisión (Figura 1A). Coloque la abrazadera Biemer justo por encima de la ligadura (Figur e 1A).
   8. El uso de un hisopo de algodón, comprimir la vena cava lo más distante posible para obstruir el flujo (Figura 1A). Curva una aguja (18 G en este protocolo) en un ángulo de 45 grados, con el señalador orificio hacia el exterior (Figura 1A).
   9. En un ángulo de 90 grados, insertar la aguja en la aorta, justo por encima de la bifurcación, con el orificio de la aguja apuntando hacia la izquierda (Figura 1 A). Manipular la punta de la aguja hacia la izquierda y la inserta en la vena cava.
      NOTA: La punta de la aguja debe ser ahora visible en la vena cava (Figura 1B).
   10. Use un segundo hisopo de algodón para empujar la sangre que queda en la aorta de la zona de inserción para prevenir la trombosis. Se seca el área alrededor de la derivación con una gasa estéril para que el pegamento se adhiera adecuadamente.
   11. Tire toda la aguja de la aorta y aplicar inmediatamente una gota de pegamento de tejidos en el sitio de punción en la aorta. Asegúrese de no pegar el hisopo de algodón para el tejido. Desembridar la aorta.
   12. Verificar la derivación manualmente tirando y soltando la ligadura en la aorta proximal a la derivación. Aflojamiento debe de color y la parte distal de la vena cava a la derivación en rojo brillante y crear una turbulencia en el lugar de la derivación.
       NOTA: El apriete a su vez, la sangre en la vena cava de nuevo a rojo oscuro.
   13. Coloque los intestinos de nuevo en el animal. Cierre la capa muscular y la piel con suturas reabsorbibles 4-0. Ventilar el animal con 100% de O ₂ para recuperarse de la anestesia.
       NOTA: No deje un aniMal desatendida hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
3. La cirugía simulada.
   1. Realizar todos los procedimientos anteriores a excepción de la inserción de la aguja en la aorta.
4. El cuidado post-quirúrgico.
   1. Coloque la rata en una jaula individual y en una incubadora a 37 ° C hasta la mañana siguiente.
   2. Alrededor de las 6 h después de la cirugía, se inyectan 0,01 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia postoperatoria. Repetir la mañana siguiente si la rata muestra signos de malestar.
      NOTA: Los primeros 3 días después de la cirugía, las ratas tienden a comer y beber menos (esto es particularmente importante cuando pienso o agua potable se mezclan con las drogas). La mayoría de las ratas muestran un comportamiento normal de 3 días después de la cirugía. Si no es así, seguir de cerca. La pérdida de peso superior al 15% en 1 semana se considera anormal, y tales ratas debe ser sacrificado por la extracción del volumen de sangre circulante, mientras que bajo anestesia.

NOTA: En este protocolo, el animal es sacrificado por la extracción del volumen de sangre circulante, mientras que bajo anestesia.

1. Sacrificio 1 día después de la cirugía (MF8) para las primeras respuestas celulares y funcionales a un aumento del flujo sanguíneo pulmonar (por ejemplo, el gen de la regulación o de factores de transcripción temprana).
2. Sacrificio de 1 semana después de la cirugía (MF14) para un fenotipo vascular HAP en estadio temprano (hipertrofia de la media de la neoíntima sin lesiones).
3. Sacrificar a 2 semanas después de la cirugía (MF21) para un fenotipo vascular HAP en estadio avanzado (marcada hipertrofia de la media y la formación neointimal) con elevación leve de la RVP y la PAP media.
4. Sacrificar a 3 semanas después de la cirugía (MF28) para un fenotipo vascular HAP en etapa terminal (marcado oclusión neointimal) y elevación fuerte en la RVP y la PAP media. Los signos clínicos de insuficiencia ventricular derecha son comunes en esta etapa.
5. Sacrificio a día 28 (MF-FVR) Para la insuficiencia ventricular derecha HAP asociada (FVR), clínicamente definida como la disnea, letargo grave, y la pérdida de peso (<10% en 1 semana). Terminar ratas cuando está presente una de estas señales. Con frecuencia, las ratas desarrollan estos síntomas entre los días 28 y 35 y, si se deja sin vigilancia, mueren de forma espontánea durante este intervalo de tiempo.

5. La cateterización cardiaca derecha

1. Anestesia.
   1. Llenar la cámara de inducción con isoflurano 5% / 100% de _O2 (caudal: 1 L / min) y colocar la rata en la caja. Compruebe si hay una adecuada profundidad de la anestesia mediante la realización de una pizca dedo del pie trasero. Pesar la rata.
   2. Afeitado y limpiar el cuello en el lado derecho-ventral de la rata y, para el protocolo de la ecocardiografía, el tórax y el abdomen superior.
   3. Coloque la rata en su espalda sobre una estera de calor (37 ° C) y coloque el hocico en una ventilación de la máscara / capucha con 2 - 3% de isoflurano / _O2 al 100% (flujo: 1 L / min). El hocico debe ser enfrentado hacia el investigador.
2. protocolo de Ecocardiografía.
   1. Realizar la ecocardiografía de acuerdo con el protocolo descrito por Brittain et al. en JoVe ^13.
3. protocolo de cateterismo.
   NOTA: Este protocolo utiliza una cánula rígida con una punta preformada inclinó 20 grados para guiar el catéter de silicio 15-cm con una bola de 2 mm de la punta. Una aguja de 20 G con su orificio ligeramente doblada hacia el interior se utiliza para insertar la cánula en la vena yugular derecha (ver la lista de materiales). Ratas en cualquier fase de la progresión y control PAH pueden ser utilizados en este protocolo.
   1. Desinfectar el cuello con cloruro-hexidine. Se practica una incisión de 1,5 cm con una hoja de bisturí # 10 en el lado derecho ventraldel cuello, desde la clavícula hasta el hueso mandibular.
   2. Difundir el tejido usando tijeras. Con unas pinzas, tire suavemente el tejido aparte hasta que aparezca la vena yugular. Diseccionar las membranas que rodean el uso de fórceps vena yugular en astilla.
   3. Ponga la tensión en la vena yugular mediante la colocación de una ligadura floja (5-0 sutura) alrededor del vaso. Aumentar la tensión y la cinta de la ligadura en la máscara de ventilación (Figura 2A).
   4. Aguas abajo del sitio de inserción, coloque una ligadura floja alrededor del recipiente para apretar después de la cánula está en situ con el fin de evitar las fugas y la pérdida de presión.
   5. El uso de las asas de un fórceps, doblar ligeramente la punta de una aguja 20-G con el orificio en el interior para llevar a cabo la cánula con el catéter.
   6. Introducir la punta de la aguja 20-G en la vena y colocar rápidamente la cánula que contiene el catéter dentro del vaso. Retirar la aguja, y luego cierre la ligaduraque se preparó en el paso 5.3.4.
   7. Llevar a cabo la cánula que contiene el catéter en la vena yugular. La punta de la cánula se encuentra en una curva de 20 grados (véase la etapa 5.3.5). Maniobra de la cánula debajo de la clavícula y avanzar un poco para entrar en la aurícula derecha (Figura 2C).
   8. Para entrar en el ventrículo derecho, apunte la punta de la cánula hacia la izquierda, hacia el corazón (Figura 2D). En el monitor de cabecera, una curva de presión del VD debería aparecer, haciendo coincidir la figura 2D.
   9. Cuando la curva de presión del VD es constante, anote la presión ventricular derecha sistólica y diastólica 1 (sRVP1 / dRVP1).
   10. Manipular la punta de la cánula hacia la izquierda y hacia arriba. Avanzar el catéter dentro de la cánula (Figura 2E).
   11. Avanzar el catéter en la arteria pulmonar principal (PA). No hay resistencia se debe sentir cuando se pasa de la válvula pulmonar.
       NOTA: Cuando el catéter entra en la arteria pulmonar principal, el diastolic presión aumentará. En el monitor de cabecera, una curva de presión de la AP debería aparecer, haciendo coincidir la figura 2E.
   12. Cuando la curva de presión de la AP es constante, anote la presión sistólica, diastólica y media presión de la AP 1 (sPAP1, dPAP1, mPAP1).
   13. seguir avanzando en el catéter dentro de la cánula hasta que la bola en la punta del catéter queda atrapado en una arteria pulmonar. Observar la evolución de la presión en la caída de monitor de cabecera y que coincida con la curva de la presión de enclavamiento en la Figura 2F.
   14. Cuando la curva de presión de enclavamiento es constante, anote la presión sistólica, diastólica y la presión de enclavamiento significar.
   15. Tire hacia atrás del catéter lentamente y, posteriormente, medir y anotar los valores de sPAP2, dPAP2, mPAP2, sRVP2, y dRVP2, como se muestra en el monitor de cabecera.
   16. Cuando en el RV, ligeramente tirar de la cánula y el catéter para medir la presión auricular derecha (RAP) significa. La curva debe coincidir con la curva de RAP en la figura 2A.
       NOTE: En este protocolo, las ratas son sacrificados después de que el protocolo de cateterismo por la extracción del volumen de sangre circulante, mientras que bajo anestesia.

6. Evaluación de la morfología y morfometría

NOTA: En este protocolo, el animal es sacrificado por la extracción del volumen de sangre circulante, mientras que bajo anestesia. Ratas en cualquier fase de la progresión y control PAH pueden ser utilizados en este protocolo.

1. Después del sacrificio, sacar a los pulmones mediante la reducción de la tráquea de unos 5 mm por encima de la bifurcación bronquial y los vasos que conectan los pulmones al corazón. Ponga los pulmones en solución salina fría. Diseccionar el pulmón izquierdo. Cortar el bronquio principal izquierdo en la bifurcación.
2. Llene una jeringa de 50 ml con paraformaldehído al 4%, colocar un tubo con una cánula de la jeringa, y colgar la jeringa cerca de un metro por encima de la mesa de trabajo. Montar la cánula en el bronquio principal izquierdo para llenar los pulmones de forma pasiva con paraformaldehído.Paraformaldehído manejar con precaución.
3. Incubar el pulmón izquierdo en paraformaldehído durante 48 h.
4. Deshidratar el pulmón izquierdo incubándola consecutivamente en 70% de etanol (1 h), 80% de etanol (1 h), 90% de etanol (1 h), 100% de etanol (3 h), xilol (2 h), y la parafina ( 2 h).
5. Incrustar el pulmón izquierdo en parafina, con el hilio del pulmón frente a la casete.
6. Manchar las secciones de pulmón, de 4 micras incluidos en parafina utilizando una tinción de Verhoeff o Elastica-van Gieson, según las instrucciones del fabricante ^29. Asegúrese de que la láminas elásticas son bien diferenciado (como en la figura 3). Analiza las secciones teñidas con un aumento de 40X.
7. Divida el pulmón en 4 cuadrantes. En cada cuadrante, encontrar 10 buques con un diámetro exterior <50 micras (intra-acinares) y 10 buques con un diámetro exterior> 50 micras (pre-acinares). Tome una fotografía (2 x 40 cuadros por pulmón). Acercar al azar hasta 20 aumentos y fotografiar todos los buquesen este campo de visión para minimizar el sesgo de selección.
8. Excluir vasos que tienen una relación de más largo / más corto de diámetro> 2, una forma circular incompleta, o un colapso de más de un cuarto de la pared del vaso.
   NOTA: Un ejemplo de un recipiente de excluidos se muestra en la Figura 3b Haga que cada imagen en el mismo aumento (40X) e incluyen una barra de escala.
9. ImageJ abierta y la primera imagen. Dibujar una línea recta en la barra de escala en la imagen para establecer la escala a través de "Analyse" y "escala establecida." Por "distancia conocida," utilizar el valor de la barra de escala de la imagen. Utilice micrómetros (micras) como la unidad de longitud. Establecer la escala a lo global.
10. El uso de "selecciones a mano alzada" dibujar una línea en el borde interior del área luminal (Figura 3), y el uso de "medir" (Ctrl m) para medir esta área. A continuación, dibuje una línea alrededor del exterior elastic lámina (Figura 3) para medir el área total del vaso.
11. Calcular el luminal y el diámetro exterior ( ) utilizando .
12. Calcular el espesor de pared usando .
13. Se calcula la relación pared / luz usando .
14. Se calcula la puntuación de la oclusión utilizando .
15. Puntuación del buque en muscularization (no, muscularization parcial o total) (Figura 3B).
    NOTA: Los buques con una lámina elástica doble para más de la mitad de la circunferencia se definen como totalmente muscularized. Los buques con una lámina elástica doble menos de la mitad de la circunferencia se definen como parte muscularized.
16. Puntuación del buque en la presencia de un NeoiNtima (sí o no) (Figura 3C).
    NOTA: Embarcaciones sin una lámina elástica interna claramente definida combinado con oclusión (a menudo excéntrica) luminal se definen como lesiones de la neoíntima.

Resultados

Los resultados representativos se presentan en la Figura 4. Los resultados presentados muestran características de MCT + FLOW en ratas Lewis en los siguientes grupos: control (n = 3), mf8 (n = 5), MF14 (n = 5), MF28 (n = 5), y MF-RVF ( n = 10). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el ANOVA de una vía con corrección de Bonferroni.

60 mg / kg MCT y aumentó la ventaja del flujo sanguíneo pulmonar a ...

Discusión

Este método describe el procedimiento quirúrgico de una derivación aorto-cava en ratas pre-tratados con MCT para crear PAH inducida por el flujo y las técnicas para evaluar el principio hemodinámica y puntos finales histopatológicos que caracterizan PAH y este modelo.

Los pasos críticos dentro del Protocolo y solución de problemas

La cirugía y posterior a la cirugía. Durante la cirugía de derivación aorto-cava, el paso más crítico es la disección de la aorta y la ve...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Shunt Surgery
Guantes
Duratears Ungüento oftálmico	Alcon	10380
Cloruro-Hexidina
Bastoncillos
Pegamento histoacrílico para tejidos	B. Braun Medical 1050052
Silkam 5-0 suturas negras no reabsorbibles	B. Braun Medical	F1134027
Safil 4-0 suturas violeta reabsorbible	B. Braun Medical
18 G aguja	Luer	NN1838R BD	punta doblada en 45 grados orificio hacia el exterior
Gasas 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
Temgesic Buprenorfina	RB Pharmaceuticals	5429	subcutánea inyección
Cloruro de sodio 0.9%
Máscara de ventilación Hoja
Abrazadera Biemer 18 mm, apertura de 5 mm	AgnTho	64-562
Estera
Kocher Clamp
			afeitar
Microscopio	Leica
RightHeart Catheterization
Guantes			quirúrgicos estériles
Pomada para los ojos	Duratears
Cloruro-Hexidina
Bastoncillos de
Gasas 10 x 10 cm	Paul Hartmann	407825
Silkam 5-0 suturas negras no reabsorbibles	B. Braun Medical	F1134027
Aguja 20 G	Luer		Punta ligeramente doblada hacia el interior
Cánula 20 G	Luer		para introducir catéter, punta preformada en 20 grados
Catéter Silastic 15 cm de largo			Bola de 0,5 mm a 2 mm de la punta
Transductor de presión	Ailtech
Monitor de cabecera Cardiocap/5	Datex-Ohmeda
Afeitadora
10 mL Jeringa
Cloruro de sodio 0.9%			para lavado
Morfología vascular
50 mL Jeringa
4% Formaldehído
Kit de tinción Verhoef	Sigma-Aldrich	HT254	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US
Escáner digital de portaobjetos	Hamamatsu	C9600
ImageJ
Elastic (Tinción de tejido conectivo)	Abcam	ab150667	http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(sitio web).pdf