Abstract
Theta aktivitet genereres i septohippocampal systemet og kan registreres ved hjælp dybe intrahippocampal elektroder og implantable elektroencefalografi (EEG) radiotelemetri eller tether-system tilgange. Farmakologisk, hippocampal theta er heterogen (se dualistiske teori) og kan differentieres til type I og type II theta. Disse individuelle EEG undertyper er relateret til specifikke kognitive og adfærdsmæssige tilstande, såsom ophidselse, udforskning, indlæring og hukommelse, højere integrative funktioner osv neurodegenerative sygdomme som Alzheimers, strukturelle og funktionelle ændringer af septohippocampal systemet kan resultere i nedsat theta-aktivitet / svingninger. En standard kvantitativ analyse af hippocampus EEG indbefatter en Fast-Fourier-Transformation (FFT) -baseret frekvensanalyse. Men denne procedure ikke give oplysninger om theta-aktivitet i almindelighed og højt organiserede theta svingninger i særdeleshed. For at opnå detailed oplysninger om højt organiserede theta svingninger i hippocampus, har vi udviklet en ny analytisk tilgang. Denne fremgangsmåde giver mulighed for tids- og omkostningseffektiv kvantificering af varigheden af højt organiserede theta svingninger og deres frekvens karakteristika.
Introduction
Theta aktivitet i hjernen er relateret til forskellige kognitive og funktionelle tilstande, herunder ophidselse, opmærksomhed, frivillige bevægelser, udforskende adfærd, opmærksomhed adfærd, indlæring og hukommelse, somatosensoriske integration, og hurtige øjenbevægelser (REM) søvn 1, 2. Principielt kan theta-aktivitet som en rytmisk enhed genereres i forskellige cerebrale regioner og er stærkt organiseret og synkroniseret som theta svingninger. Nedenfor vil vi fokusere på analyse og kvantificering af theta-aktivitet / svingninger, der genereres i det septohippocampal system 3, 4. Inden skillevæggen, GABAerge, glutamaterge, og cholinerge neuroner projekt til hippocampus og bidrage til initiering og vedligeholdelse af theta oscillerende adfærd. Der er en løbende diskussion om, hvorvidt hippocampus theta svingninger indledes i septum, dvs. 5, 6, 7.
Uanset deres oprindelse, har hippocampus theta svingninger været i fokus for interessen for år, især i transgene musemodeller. Disse modeller giver mulighed for implantation af dybe EEG-elektroder og for registrering af hippocampus theta svingninger under særlige kognitive og adfærdsmæssige opgaver 8. Hippocampal theta svingninger er heterogene karakter. Baseret på den såkaldte dualistisk teori om theta svingninger, kan man skelne mellem atropin-sensitive type II theta og atropin-ufølsomme type I theta 9, 10, 11. Sidstnævnte kan typisk induceret af muscariniske M 1 / M
I øjeblikket er kommercielt tilgængelige analytisk software giver mulighed for hurtig FFT-baserede frekvens analyse, fx analyse af magt (P, mV 2)eller effektspektrum density (PSD, mV 2 / Hz). Power eller magt spektrum densitet (PSD) analyse af theta frekvensområdet giver kun et samlet overblik over sin aktivitet. For at få et detaljeret indblik i kognitiv og adfærd relateret theta-aktivitet, analyse af højt organiserede theta svingninger er imidlertid obligatorisk. Vurderingen af højt organiserede theta svingninger er af central betydning i forbindelse med neurodegenerative og neuropsykiatriske sygdomme. De fleste eksperimentelle undersøgelser sygdom udføres i transgene musemodeller bruger højt sofistikerede neurokirurgiske metoder til at registrere epidural overflade og dybe intracerebrale EEG. Disse teknikker omfatter både tether systemer 16 og radiotelemetrisk opsætninger 17, 18. Theta svingninger kan optages som spontane og adfærdsmæssige-relaterede theta svingninger under langsigtede optageforholdene. Derudover kan theta oscillationer være recorded efter farmakologisk induktion, men også som følge af eksponering af dyr til adfærdsmæssige eller kognitive opgaver eller sensoriske stimuli, såsom halen klemme.
Tidligt tilgange til at karakterisere theta svingninger blev beskrevet af Csicsvari et al. 19. Forfatterne designet en semi-automatiseret værktøj til kortvarig theta analyse (15-50 min), som ikke er egnet til lang tid EEG optagelser. Vores metode, der er beskrevet her, giver mulighed for analysen af langsigtede EEG optagelse> 48 h 20. Csicsvari et al. 10 også henvist til theta-delta-forhold, men ingen tærskel til bestemmelse af højt organiserede theta svingninger tilbydes. Delta og theta range definitioner matcher vores frekvensområde definitioner. Da det ikke er udtrykkeligt nævnt, vi formoder, at en FFT-baserede metode anvendes af Csicsvari et al. at beregne magt theta-delta frekvensbånd. Det herigen klart adskiller sig fra vores metode, da vi beregner wavelet-baserede amplituder på et stort antal frekvens skalaer (frekvens trin Δ (f) = 0,05 Hz), hvilket resulterer i meget højere præcision. Varigheden af individuelt analyseret EEG epoke ligner vores definition.
Klausberger et al. 21 også gøre brug af theta-delta nøgletal til analyse af langsigtede EEG optagelser. Men der er tre store forskelle i forhold til vores tilgang: i) EEG epokevarighed er meget længere, dvs. mindst 6 s; ii) theta-delta-forholdet er sat til 4, hvilket er langt højere end vores tærskel, og er relateret til forskellige frekvens range definitioner; og iii) effekten definition vil sandsynligvis være baseret på en FFT tilgang, som mangler høj præcision, navnlig for de meget korte tidsvinduer (2 s, dvs., 5 cyklusser for svingninger med en frekvens på 2,5 Hz). I sådanne tilfælde en wavelet-baseret procedure er mere stærkt.En undersøgelse foretaget af Caplan et al. 22 udelukkende beregnet theta strøm, mens ignorere theta-delta effektforhold. Således Caplan nærmer 22 kan ikke differentiere mellem kognitive theta-rige processer ledsaget af en høj eller lav delta.
I det følgende protokol, vil vi præsentere vores analytiske wavelet-baserede tilgang til pålideligt analysere højt organiserede theta svingninger i hippocampus EEG optagelser fra mus. Da denne procedure fungerer automatisk, kan det anvendes på store datasæt og langsigtede EEG-målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den lokale og institutionelle Rådet om Animal Care (University of Bonn, BfArM, LANUV, Tyskland). Desuden blev alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med overlegen lovgivning, f.eks Europæiske Fællesskabers Rådets direktiv af 24. november 1986 (86/609 / EØF), eller individuel regional eller national lovgivning. blev gjort særlig indsats for at minimere antallet af anvendte dyr, såvel som deres lidelser.
1. stalde og EEG optageforholdene
- Hus mus i filter-top bure eller bruge individuelt ventilerede bure.
- Overfør mus fra dyret facilitet til ventilerede skabe i særlige lab værelser, der er passende for implanterede dyr og telemetriske optagelser.
- Udfør alle dyreforsøg, herunder EEG elektrode implantation og de efterfølgende optagelser, under standardiserede betingelser (22 ° C temperatur, 12 timer / 12 timer lys-mørke cyklus, 50-60% relativ luftfugtighed, støjdæmpning, etc.) 18.
- Forud for radiofrekvens senderen implantation, hus dyr i grupper på 3 - 4 i klare type II polycarbonat bure, med mad og vand ad libitum. Må ikke isolere enkelte mus, da dette kan forårsage stress og forstyrre efterfølgende eksperimenter og resultater.
- Brug ikke åbne boligforhold, men bruge ventilerede skabe i stedet under eksperimenter og optagelse.
2. radiotelemetrisk EEG elektrode Implantation og EEG optagelser
- Bedøve mus ved anvendelse injektion narkotika, f.eks ketaminehydrochloride / xylazinehydrochloride (100/10 mg / kg, intraperitonealt, ip) eller indånding narkotika, fx isofluran 17, 18.
- For isofluran narkose, skal du placere musen i en induktion cHamber med 4-5% isofluran og 0,8-1% oxygen eller carbogen (5% CO2 og 95% O2).
- Placer en silicium ansigtsmaske på næsen / munden af dyret for at styre den ønskede dybde af anæstesi og undgå forsøgslederen udsættelse for isofluran ved anvendelse af et udsugningssystem.
- Brug injicerbare anæstetika, f.eks esketaminhydrochloride (100 mg / kg, ip) og xylazinehydrochloride (10 mg / kg, ip), hvis indånding anæstesi er ikke tilgængelig.
- Overvåg anæstesidybden ved at kontrollere hale knivspids refleks, fod knivspids refleks, og respiration sats. Bemærk, at kunstigt åndedræt via intubering i trachea er ikke nødvendig i mus.
- Implanter radiofrekvens senderen ind i en subkutan pose på ryggen af dyret.
- Fjerne kroppen hår fra hovedbunden og forbehandle barberede hovedbund med to desinfektionsmidler, dvs. 70% ethanol og en jod-baseret krat.
- Ved hjælp af en skalpel, gøren midtlinjeincision på hovedbunden fra panden til nucheal region.
- Startende fra nuchal indsnit, forberede en subkutan pose på den ene side af ryggen af dyret ved at udføre en stump dissektion anvendelse af kirurgiske saks eller en kirurgisk probe.
- Sæt senderen ind i det subkutane pose og deponere den overskydende længde af den fleksible transmitter fører ind i posen samt. Vær særlig opmærksom på at forhindre forurening af det kirurgiske sted og sender implantat. Korrekt isolere sterile fra ikke-sterile områder ved hjælp af gardiner.
- Placer den eksperimentelle dyr på stereotaktisk ramme, fx en elektronisk 3D stereotaktisk apparat. Fastgør kraniet ved en næse klemme og øre barer.
- Forbehandle kraniet med 0,3% H 2 O 2 for at fjerne yderligere væv fra kraniet og at belyse de kranielle suturer og vartegn craniometrics, bregma og lambda.
- Bor huller på koordinaterne for valg(Se trin 2.6) ved anvendelse af en high-speed neurokirurgisk bore i en trykfri tilstand ved maksimal hastighed.
BEMÆRK: trykfri boring undgår pludselige gennembrud af borehovedet og beskadigelse af cortex. For en kraniotomi, anbefales en neurokirurgisk højhastigheds-boremaskine. Vælg standard bore-head diameter på 0,3 - 0,5 mm, afhængigt af elektroden diameter. - omhyggeligt udvælge de elektrodetype, overvejer impedans, diameter, belægning, osv
BEMÆRK: parylen-belagt wolfram eller rustfrit stål elektroder er de mest almindelige. De elektrodetyper skal vælges i overensstemmelse med eksperimentelle krav. Som forebyggende manøvre, sterilisere elektrodespidserne før implantation anvendelse af 70% ethanol. Bemærk at elektroden belægningen ikke tillader varmesterilisering. - For intrahippocampal CA1 EEG optagelser, bore et hul stereotaxisk på følgende koordinater: bregma, -2 mm; mediolateral, 1,5 mm (højre hjernehalvdel); dorsoventral, 1,3 mm (udsigt til rentenedsættelsert region: Cornu ammonis (CA1) pyramideformet lag). For reference elektrode, bore et hul over den cerebellare cortex på følgende stereotaksiske koordinater: bregma, -6,2 mm, mediolateral, 0 mm; dorsoventral, 0 mm.
BEMÆRK: cerebellar elektrode fungerer som en pseudoreference elektrode, som lillehjernen er en temmelig tavs hjerne region. Stereotaktisk koordinater blev afledt fra en standard musehjerne atlas. - Forud for indsættelse af elektroderne, forkorte dem i den ønskede længde. Mekanisk klem ekstrakranialt del af elektroden til rustfrit stål helix af senderen.
BEMÆRK: Lodning bør undgås, da dette kan indføre væsentlig støj i systemet. - Fastgør elektroden til den lodrette arm af stereotaktisk instrument og indsæt elektroden ifølge de førnævnte stereotaksiske koordinater.
- Fastgør elektroderne hjælp glasionomercement og vente, indtil cementen er fuldt hærdet.
- Luk hovedbundenved hjælp af over-og-over suturer med ikke-absorberbar 5-0 eller 6-0 suturmateriale.
- For postoperativ smertelindring, administrere carprofen (5 mg / kg, subkutant, sc) en gang om dagen i 4 dage i træk efter implantation. Bemærk, at carprofen skal injiceres inden den indledende indsnit (trin 2.2.2).
- At dyrene kan komme sig i 10 - 14 dage efter implantation før optagelserne og / eller injektion eksperimenter i gang.
3. Spontane Optagelser af Theta Svingninger og Farmakologisk Induktion
- Aktiver radiofrekvens-senderen ved hjælp af magnetiske switch. Sende dyret med dets bur på receiveren plade. Udfør langsigtede hippocampus EEG optagelser i mindst 24-48 timer.
BEMÆRK: Analysen af EEG amplitude og EEG frekvens karakteristika af langsigtede optagelser giver detaljeret indblik i døgnrytmen afhængighed af theta svingninger og deres forbindelse med specifikke adfærdsmæssige ogkognitive forhold / opgaver. kombinere altid EEG optagelser med video overvågning af forsøgsdyr. - For farmakologisk induktion af theta svingninger, administrere en enkelt dosis af urethan (800 mg / kg ip) eller en enkelt dosis af et muskarinreceptoragonister, fx pilocarpin (10 mg / kg ip), arecolin (0,3 mg / kg ip) eller oxotremorin (0,03 mg / kg ip). Forbehandle mus med N-methylscopolamin (0,5 mg / kg ip) for at undgå perifere muskarine reaktioner. Frisk opløse alle lægemidler i 0,9% NaCl eller Ringer-opløsning.
BEMÆRK: Højere doser af muskarinreceptoragonister kan resultere i anfald induktion hos forsøgsdyr. Mener også, at de doser, der gives her repræsenterer vartegn, der kræver dosis-effektstudier før i musen linje under efterforskning. Bemærk, at urethan er et mutagen og kræftfremkaldende stof, der kræver passende forholdsregler i opbevaring og håndtering. - Injicer atropin (50 mg / kg, ip) til at differentiere atropin-sensitive type IIfra atropin-ufølsomme type I theta svingninger.
BEMÆRK: atropin dosering er igen arts- og stamme-afhængige og kræver vurdering forud dosis-effekt. Det optimale tidspunkt for atropin injektion afhænger farmakodynamik muskarinreceptoragonister. Til identifikation af type II theta, er atropin injektion anbefales 1 time efter urethan administration. - Prøv at undgå den efterfølgende anvendelse af en række lægemidler, som systemisk lægemiddel administration ændrer globale transkriptionelle og translationelle mønstre, som påvirker efterfølgende EEG optagelser. Bemærk, at kortvarig theta svingninger også kan induceres ved sensoriske stimuli, såsom bag- eller pote-klemme.
- Uddrag / eksport repræsentant EEG datasæt af præ-fase (baseline) og efter injektion fase fra den samlede EEG optagelsen som ASCI eller TXT-filer, overvejer farmakokinetikken af narkotika anvendt, og de krav, som den enkelte forsøgsprotokollen.
Fire.Validering af EEG Placering af elektroder
- Afliv dyr ved at placere dem i en inkubation kammer og indføre 100% kuldioxid. Brug et fyld på 10-30% af kammerets volumen pr min med carbondioxid tilsat til den eksisterende luft i rugekammeret; dette vil resultere i hurtig bevidstløshed med minimal stress for dyrene.
- Fjern musen fra kammeret, når åndedrættet ophører, og en falmet øjenfarve vedvarer i 2-3 min.
- Skær stål elektroder rustfri og eksplanterer den radiofrekvens senderen. Halshugge musen ved hjælp af saks eller en guillotine og fjern hjernen fra neurocranium ved forsigtig manipulation med kirurgiske saks og pincet.
- Fix hjernerne i 4% paraformaldehyd i phosphatpuffer saltvand (PBS) (pH 7,4) natten over. For kryobeskyttelse, overføre hjerner til 30% glucose og opbevare dem ved 4 ° C indtil videre forarbejdning.
BEMÆRK: Paraformaldehyd betragtes som farligt i 2012 OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200). Tag de nødvendige forholdsregler: Brug personlige værnemidler, sikre passende ventilation, og undgå støvdannelse. Desuden fjerne antændelseskilder og træffe forebyggende foranstaltninger mod statisk elektricitet. Paraformaldehyd bør ikke frigives til miljøet. - Monter den udpakkede hjerne på væv indehaver af en kryostat ved hjælp af et klæbemiddel på og skær hjernerne i 40 - 75 um koronale skiver. Monter skiverne på objektglas og plette dem med Nissl blå ved hjælp standard histologisk procedure; denne procedure vil visualisere grenen kanal, der afspejler den tidligere elektrode position. Bemærk at det også er muligt at skære koronale skiver fra det native hjernen under anvendelse af en vibroslicer
- Indarbejd kun de dyr, der opfylder korrekte EEG kriterier elektrode placering; for CA1-regionen, bør spidsen af den dybe elektrode være lokaliseret inde i CA1 pyramideformede lag.
- Optag CA1 intrahippocampal EEG med en passende samplingfrekvens uden a priori filter cut-off.
BEMÆRK: samplingfrekvens, som er transmitter-specifik, bestemmer den øvre frekvens grænse for EEG-analyse. - Behandle de registrerede data med en analyse software. Program tid-frekvens analyser og beregninger med skræddersyede procedurer for tilstrækkelig kontrol af analysemetoder (figur 5) 20.
- Skær indspillede EEG i sektioner med en længde på 1 time hver. Brug hurtige computerprocessorer, da beregningstid er høj. Derudover gør brug af software, der kan parallelize computing på flere kerner 20.
6. EEG Dataanalyse
- Analyser data segmenter ved hjælp af en kompleks Morlet wavelet at beregne både frekvensen og amplituden af svingninger.
BEMÆRK: Denne wavelet (f.eks Ψ (x) = (π b)(- 1/2) exp (2 i π c x) exp (-x 2 / b), hvor b er den båndbredde parameter, c centerfrekvensen, og jeg den imaginære enhed) er ofte blevet anvendt i litteraturen til at studere EEG data, da det garanterer optimal opløsning i både frekvens og tid 23, 24. - Brug en båndbredde parameter og center frekvens indstilling, der især vægte frekvensen beslutning til skelne frekvensen forskelle på 0,1-Hz-niveau, mens du stadig ikke forsømme en tilstrækkelig tidsopløsning.
BEMÆRK: Neuronal processer i gamma-båndet er kortvarig 25, og dette kan også være tilfældet for theta rytmer. Således skal den analytiske tilgang anser for passende tidsmæssig opløsning. - Analyser EEG data i frekvensområdet på 0,2 - 12 Hz, med en trin-størrelse på 0,1 Hz, herunder således den typiske delta,ta, og alpha frekvensområder.
- Opsæt en automatiseret, komplekst analytisk redskab for udarbejdelsen af theta frekvens arkitektur, der kan erstatte en standard visuel inspektion af theta svingninger; denne procedure kaldes theta påvisningsmetoden (TDM).
- Beregn forholdet mellem det maksimale amplitude i theta frekvensområde (3,5-8,5 Hz), og den maksimale amplitude i den øvre delta frekvensområde (2-3,4 Hz) for tidsvinduer på 2,5 s hver.
BEMÆRK: Værdien af denne kvotienten tjener som et middel til at afgøre, om en theta svingning indtraf. Definitionen af theta frekvensområdet kan variere afhængigt af den funktionelle tilstand og neuroanatomiske kredsløb / system, der skal analyseres. - Klassificere et segment som en "theta oscillerende epoke,", hvis den beregnede forhold under dette segment er over 1,5.
BEMÆRK: Dette garanterer, at den maksimale theta amplitude er mindst 50% højere end amplituden i det øvre delta-båndet under den tilknyttede 2.5-s EEGsegment. Bemærk, at forholdet kan have behov for tilpasning, afhængigt af linjen og / eller art anvendes. Et interval på 2,5 s udgør en minimal varighed for et theta svingning, forhindrer falsk-positive påvisninger af visse støjende epoker, og ligger inden for intervallet definitioner af andre publikationer 19, 26. Den øvre delta frekvensområde tjener som kontrol frekvensbånd, fordi fysiologisk relevant deltaaktiviteten vises under ikke-theta epoker, for eksempel under slow-wave sleep, som er stærkt dæmpet under theta-aktivitet. - Gentag denne procedure for hver 1 time sektion; derfor, hvert afsnit består af 1.440 EEG segmenter med længder på 2,5 s hver.
- Statistisk vurdere data for de identificerede theta svingning epoker.
- Beregn statistik for den samlede varighed tidspunkter af opdagede theta epoker; særskilte eller foruddefinerede grupper; cyklusser, såsom lys / mørke; og andre parametre.
BEMÆRK: Statinde egenskaber kan indbefatte t-test, ANOVA, eller MANOVA, afhængigt af variable, antallet af grupper, betingelserne, etc. - Beregn statistikkerne for amplituden af de fundne theta epoker, men kun i theta frekvensområde (3,5-8,5 Hz).
- Vurdere statistikkerne for hyppigheden af de fundne theta epoker, men kun i theta frekvensområde (3,5-8,5 Hz).
BEMÆRK: theta frekvensen af en theta epoke er defineret som frekvensen tilhører den maksimale theta amplituden af et theta epoke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Theta-aktivitet kan optages i en bred vifte af sygdomme i centralnervesystemet (CNS) regioner. Her præsenteres en analyse af theta svingninger fra murine hippocampus. Sådanne svingninger kan forekomme under forskellige adfærdsmæssige og kognitive tilstande. Det anbefales stærkt at analysere theta svingninger under både spontane langsigtede, opgaverelateret kortsigtede og farmakologisk inducerede betingelser.
Figur 1 illustrerer et repræsentativt intrahippocampal CA1 optagelse under kontrol betingelser. Hvis dyret ikke er i en spontan "theta tilstand," den intrahippocampal EEG er ofte karakteriseret ved store uregelmæssige-amplitude (LIA) aktivitet. Administration af muskarinreceptoragonister (f.eks arecolin, pilocarpin, eller urethan) resulterer i stærkt organiserede theta svingninger, der kan blokeres ved atropin (50 mg / kg, ip, figur 1).
(figur 2). Baseret på denne klassifikation, er det muligt at kvantificere den samlede varighed af theta svingninger under spontane betingelser eller specifikke adfærdsmæssige og kognitive opgaver.
For at analysere en 30-min EEG segment (som for farmakologisk urethan / atropin theta dissektion), vi først udføre en gang-frekvens analyse for et frekvensområde på fra 0,2 til 12 Hz, hvilket viser amplituden (mV) i en farve- kodet måde (Figur 3 A). Som bliver indlysende i figur 3 A, høj amplitude theta-aktivitet, hvilket bekræftes af en visuel inspektion af EEG (hvide pile), er ledsaget af en lav amplitude i deltaet frekvensområdet. Derefter maksimale amplituder aftheta (3,5-8,5 Hz) og delta (2-3,4 Hz) frekvensområder er plottet (Figur 3 B). Systematisk sammenhæng undersøgelser viste, at forholdet mellem maksimal theta amplitude til maksimal delta amplitude på over 1,5, hvilket indikerer stærkt organiserede theta svingninger (Figur 3 C).
Figur 4 viser, hvordan urethan kan inducere hippocampal theta svingninger (hvide cirkler i figur 4 II). Urethan er en multi-target lægemiddel, der kan udløse type II theta grund sin agonistisk virkning på muscarinreceptorer. Efter en atropin injektion (figur 4 III), er disse type II theta svingninger (atropinlignende følsomme theta svingninger) afskaffet. Det er vigtigt at overveje, at de muskarinreceptoragonister, foruden atropin, har individuelle farmakokinetiske egenskaber, der påvirker den tid karakteristika theta forekomst og theta blokade. Det skal bemærkes, at atropin-ufølsomme type I theta forbliver unaffected af muskarine receptorantagonister.
Et resumé af hele theta påvisning og kvantificering værktøj er afbildet i figur 5. Det resulterer i beregningen af amplituden, frekvensen, og sum / middelværdi theta varighed. I modsætning til tidligere beskrevne teknikker, det gør brug af en wavelet-tilgang med høj præcision. Den analytiske værktøj beskrevet her har flere anvendelsesområder. Theta oscillationer genereres i septohippocampal systemet og er ofte hæmmes af neurodegenerative processer, f.eks i Alzheimers sygdom. Talrige musemodeller for Alzheimers sygdom er blevet beskrevet, der varierer i homologi, isomorfi, og forudsigelighed. Nogle af disse modeller blev rapporteret at udvise en reduktion i theta-aktivitet, mens andre blev vist at vise en stigning i theta-aktivitet, årsagen til, skal stadig bestemmes. Vi anvendt med succes theta afsløring tOOL beskrevet her for at karakterisere ændret theta oscillerende arkitektur i 5XFAD model af Alzheimers sygdom 8. Det kan imidlertid også anvendes i epilepsi forskning og neuropsykiatriske sygdomme.
Figur 1: Theta Svingninger i C57BI / 6-mus. Radiotelemetrisk intrahippocampal CA1 optagelse under spontane betingelser (I) og efter urethan injektion (800 mg / kg, ip, II). Efter urethan injektion, stærkt organiserede theta svingninger bliver synlige, som kan blokeres af atropin (50 mg / kg, ip). Dette tal har været ændret siden henvisning 20, med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En Wavelet-baserede analyse af en Deep CA1 EEG optagelse fra et C57BI / 6 mus. (A og B) To 2.5-s EEG epoker er afbildet, visuelt klassificeres som ikke-theta og theta segmenter, hhv. (C og D) Time-frekvens analyse af CA1 EEG segmenterne vist i A og B i intervallet fra 0,2 til 12 Hz, med amplitude er farvekodet. Tiden-frekvensanalyse i C udviser uregelmæssig, svingende theta arkitektur med hensyn til frekvenser og tid, hvorimod et segment med højt synkroniserede theta svingninger er kendetegnet ved en regelmæssig, ikke-fluktuerende høj amplitude theta af en næsten konstant frekvens på 6 Hz. Forholdet mellem maksimal theta til maksimal delta amplitude er 1,25 i C og 4,67 i D, tydelig klassifikation
Figur 3: En Wavelet-baserede Theta Detection Tool. (A) Time-frekvensanalyse af en 30 min EEG segment (ikke vist), der er blevet optaget efter urethan administration. Den komplekse Morlet wavelet-analyse blev udført i området fra 0,2 til 12 Hz, med amplituden (mV) er farvekodet. (B) Dette billede viser den maksimale amplitude af theta frekvensbånd (3,5-8,5 Hz, grøn) og den øvre delta bånd (2-3,4 Hz, rød) for 30-min EEG segment. (C) Denne figur illustrerer forholdet mellem den maksimale theta amplitude(grøn i B) og den maksimale delta amplitude (rød i B). Bemærk, at højt synkroniserede theta svingninger korrelerer med suprathreshold nøgletal i C. Dette tal blev genoptrykt fra reference 20, med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Wavelet-baserede analyse af Farmakologisk-induceret, stærkt organiserede Theta Svingninger. Repræsentativ 30-min EEG segmenter (ikke vist) er analyseret i frekvensområdet 0-12 Hz med amplituden (mV) er farvekodet. En urethan injektion på 800 mg / kg, ip, resulterede i den fragmenterede forekomst af højt organiserede theta svingninger, med en fremherskende frekvens på ca. 6 Hz (hvide cirkler). Efter en påropine injektion med 50 mg / kg, ip, er disse theta svingninger afskaffet. Dette tal blev genoptrykt fra reference 20, med tilladelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: rutediagram, der viser Kvantificering af stærkt organiseret Theta Svingninger Optaget fra Murine CA1. Type II theta svingninger kan analyseres ved anvendelse af en kontrol optagelse (fase), en post-injektion (fx urethan, arecolin, eller pilocarpin) fase, og en post-atropin fase (A1). 30 min EEG segmenter (A2) fra hver fase er tid-frekvens analyseret i intervallet fra 0.2-12 Hz ved anvendelse af en wavelet-tilgang (B1 og B2). Næste, theta Segment detektering påbegyndes (C1), hvilket giver et nærmere kig på tid-frekvens karakteristika af theta rækkevidde (3,5-8,5 Hz, C2) og den øvre delta område (2-3,4 Hz, C3) for EEG epoker, der er 2,5 s hver (C4 og C5). Efterfølgende amplituden analyseret over theta og delta frekvensområde afbilder de maksimale værdier (C6 og C7). Hvis den maksimale amplitude af theta / delta overstiger 1,5, er 2,5 s EEG segment er klassificeret som en epoke med velorganiseret theta oscillation (C8), med en defineret amplitude og frekvens (D1-D3). Denne theta afsløring værktøj giver mulighed for kvantificering af theta oscillation arkitektur (E1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Theta aktivitet er af central betydning i systemisk neurofysiologi. Det kan observeres i forskellige områder af hjernen, især i hippocampus, hvor det er forbundet med specifikke adfærdsmæssige og kognitive tilstande. Desuden kan hippocampal theta være farmakologisk differentieret til atropin-sensitive type II og atropin-ufølsomme type I theta. Type I menes at være relateret til bevægelse, såsom at gå eller løbe 27, 28, 29, 30, 31, hvorimod type II kan observeres under alarm-immobilitet tilstand 27, 28, 29, 30. Alert-immobilitet tilstande kan induceres af sjældne og tilfældige tone eller taktile stimuli, for eksempel 32. Type II theta angår også passive hele kroppen rotation 14. Under paradoksal søvn begge til atropinlignende følsomme og atropinlignende resistente theta rytmer er til stede 33. Den hvilested ubevægelighed tilstand er kendetegnet ved store uregelmæssige aktivitet (LIA) 27.
Generelt kan theta svingninger optages under spontane betingelser, men også efter farmakologisk induktion (fx via anvendelse af muskarinreceptoragonister, såsom urethan, pilocarpin, arecolin, oxotremorin, etc.). Bemærk at, farmakodynamisk, urethan er en multi-target lægemiddel, der kan forbedre type II theta men også inhiberer type I theta. I modsætning hertil pilocarpin, arecolin, og oxotremorin selektivt inducerer type II theta. Afhængigt farmakokinetikken af de muskarine agonister, der anvendes, det tager en variabel mængde tid indtil forekomme theta svingninger. Type II kan blokeres effektivt af atropin. Kritisk, dosages af muskarine agonister og antagonister til at inducere og blokere type II theta svingninger er arts- og stamme-afhængig. Således er det absolut nødvendigt at udføre dosis-effektstudier at optrævle den optimale dosis til fremkaldelse af theta svingninger og for deres blokering for en bestemt videnskabelig spørgsmål. Kortvarig theta svingninger kan også fremkaldes af sensoriske stimuli, såsom bag- eller pote-klemme.
Der er forskellige tilgange til at karakterisere theta-aktivitet i almindelighed. FFT tilgange, hvilket resulterer i kontinuerlige eller diskontinuerlige (frekvensbånd-relateret) power spektrum densitet (PSD) analyse / plots eller i en magt analyse for de enkelte frekvensbånd, er standard tilgange, der giver værdifulde oplysninger om frekvens karakteristika.
at opnå en mere kompleks indsigt i theta arkitektur, synes imidlertid yderligere tilgange til at være nødvendig. Især kunne man være interesseret i de forskellige organizational tilstande af theta og deres frekvenser, som ikke kan vurderes direkte og præcist ved de førnævnte procedurer. I modsætning hertil hidtil ukendte analyseteknik præsenteret her er wavelet-baserede og i stand til at evaluere højt organiseret, kortsigtede theta svingninger. De svarer ikke til standard theta magt, som også finder paroxysmal, diskontinuerlig theta-aktivitet. Fokus er at fremkalde specifikke tid-frekvens karakteristika i EEG-data, der er typiske for theta epoker. Således er den nye metode forhindrer falsk-positive klassificeringer af theta epoker. Den automatiserede procedure garanterer evaluering af langvarige EEG datasæt og omfatter derfor pålidelige statistiske sammenligninger af fysiologiske cyklusser (lys / mørke cyklus eller døgnrytmen rytme) under langtidsstudier.
Denne protokol er af særlig betydning i analysen af EEG-data indhentet fra dyremodeller for neurodegenerative sygdomme, især i træk enning af højt organiserede theta arkitektur i septohippocampal og andre neurale systemer. Kompleks og høj præcision theta analyse kan hjælpe til at bestemme EEG fingeraftryk, der kan tjene som EEG biomarkører i fremtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen (Rimadyl VET - Injektionslösung) | Pfizer | PZN 0110208208 | 20ml |
| binocular surgical magnification microscope | Zeiss Stemi 2000 | 0000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000 | |
| Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe) | Bayer | PZN: 1578818 | |
| drapes (sterile) | Hartmann | PZN 0366787 | |
| 70% ethanol | Carl Roth | 9065.5 | |
| 0.3% / 3% hydrogene peroxide solution | Sigma | 95321 | 30% stock solution |
| gloves (sterile) | Unigloves | 1570 | |
| dental glas ionomer cement | KentDental /NORDENTA | 957 321 | |
| heat-based surgical instrument sterilizer | F.S.T. | 18000-50 | |
| high-speed dental drill | Adeor | SI-1708 | |
| Inhalation narcotic system (isoflurane) | Harvard Apparatus GmbH | 34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230 | |
| Isoflurane | Baxter 250 ml | PZN 6497131 | |
| Ketamine | Pfizer | PZN 07506004 | |
| Lactated Ringer's solution (sterile) | Braun | L7502 | |
| Nissl staining solution | Armin Baack | BAA31712159 | |
| pads (sterile) | ReWa Krankenhausbedarf | 2003/01 | |
| Steel and tungsten electrodes parylene coated | FHC Inc., USA | UEWLGESEANND | |
| stereotaxic frame | Neurostar | 51730M | ordered at Stoelting |
| (Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic) | |||
| tapes (sterile) | BSN medical GmbH & Co. KG | 626225 | |
| TA10ETA-F20 | DSI | 270-0042-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 2.5 mV, channel bandwidth (B) 1 - 200 Hz, nominal sampling rate (f) 1,000 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 4 months |
| TL11M2-F20EET | DSI | 270-0124-001X | Radiofrequency transmitter 3.9 g, 1.9 cc, input voltage range ± 1.25 mV, channel bandwidth (B) 1 - 50 Hz, nominal sampling rate (f) 250 Hz (f = 5B) temperature operating range 34 - 41 °C warranted battery life 1.5 months |
| Vibroslicer 5000 MZ | Electron Microscopy Sciences | 5000-005 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | PZN: 1320422 | |
| Matlab | Mathworks Inc. | programming, computing and visualization software | |
| SPSS | IBM | statistical analysis software |
References
- Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 26, 407-418 (1969).
- Kahana, M. J., Seelig, D., Madsen, J. R.
- Varga, V., et al. The presence of pacemaker HCN channels identifies theta rhythmic GABAergic neurons in the medial septum. J Physiol. 586, 3893-3915 (2008).
- Takano, Y., Hanada, Y. The driving system for hippocampal theta in the brainstem: an examination by single neuron recording in urethane-anesthetized rats. Neurosci Lett. 455, 65-69 (2009).
- Goutagny, R., Manseau, F., Jackson, J., Danik, M., Williams, S. In vitro activation of the medial septum-diagonal band complex generates atropine-sensitive and atropine-resistant hippocampal theta rhythm: an investigation using a complete septohippocampal preparation. Hippocampus. 18, 531-535 (2008).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28, 4096-4107 (2008).
- Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29, 8094-8102 (2009).
- Siwek, M. E., et al. Altered theta oscillations and aberrant cortical excitatory activity in the 5XFAD model of Alzheimer's disease. Neural Plast. 2015, 781731 (2015).
- Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33, 325-340 (2002).
- Buzsaki, G., et al. Hippocampal network patterns of activity in the mouse. Neuroscience. 116, 201-211 (2003).
- Buzsaki, G., Moser, E. I. Memory navigation and theta rhythm in the hippocampal-entorhinal system. Nat Neurosci. 16, 130-138 (2013).
- Shin, J.
- Shin, J., et al. Phospholipase C beta 4 in the medial septum controls cholinergic theta oscillations and anxiety behaviors. J Neurosci. 29, 15375-15385 (2009).
- Shin, J., Kim, D., Bianchi, R., Wong, R. K., Shin, H. S. Genetic dissection of theta rhythm heterogeneity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18165-18170 (2005).
- Brown, D. A., Adams, P. R. Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current in a vertebrate neurone. Nature. 283, 673-676 (1980).
- Senkov, O., Mironov, A., Dityatev, A. A novel versatile hybrid infusion-multielectrode recording (HIME) system for acute drug delivery and multisite acquisition of neuronal activity in freely moving mice. Front Neurosci. 9, 425 (2015).
- Lundt, A., et al. EEG Radiotelemetry in Small Laboratory Rodents: A Powerful State-of-the Art Approach in Neuropsychiatric, Neurodegenerative, and Epilepsy Research. Neural Plast. 2016, 8213878 (2016).
- Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), (2016).
- Csicsvari, J., Hirase, H., Czurko, A., Buzsaki, G. Reliability and state dependence of pyramidal cell-interneuron synapses in the hippocampus: an ensemble approach in the behaving rat. Neuron. 21, 179-189 (1998).
- Muller, R., et al. Atropine-sensitive hippocampal theta oscillations are mediated by Cav2.3 R-type Ca2+ channels. Neuroscience. 205, 125-139 (2012).
- Klausberger, T., et al. Brain-state- and cell-type-specific firing of hippocampal interneurons in vivo. Nature. 421, 844-848 (2003).
- Caplan, J. B., Madsen, J. R., Raghavachari, S., Kahana, M. J. Distinct patterns of brain oscillations underlie two basic parameters of human maze learning. J Neurophysiol. 86, 368-380 (2001).
- Montgomery, S. M., Buzsaki, G. Gamma oscillations dynamically couple hippocampal CA3 and CA1 regions during memory task performance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14495-14500 (2007).
- Kronland-Martinet, R., Morlet, J., Grossman, A. Analysis of sound patterns through wavelet transform. Int J Pattern Recognit Artif Intell. 1, 29 (1987).
- Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12, 1491-1493 (2009).
- Bland, B. H. The physiology and pharmacology of hippocampal formation theta rhythms. Prog Neurobiol. 26, 1-54 (1986).
- Leung, L. S. Generation of theta and gamma rhythms in the hippocampus. Neurosci Biobehav Rev. 22, 275-290 (1998).
- Shin, J., Talnov, A. A single trial analysis of hippocampal theta frequency during nonsteady wheel running in rats. Brain Res. 897, 217-221 (2001).
- Shin, J. A unifying theory on the relationship between spike trains, EEG, and ERP based on the noise shaping/predictive neural coding hypothesis. Biosystems. 67, 245-257 (2002).
- Kramis, R., Vanderwolf, C. H., Bland, B. H. Two types of hippocampal rhythmical slow activity in both the rabbit and the rat: relations to behavior and effects of atropine, diethyl ether, urethane, and pentobarbital. Exp Neurol. 49, 58-85 (1975).
- Lu, B. L., Shin, J., Ichikawa, M. Massively parallel classification of single-trial EEG signals using a min-max modular neural network. IEEE Trans Biomed Eng. 51, 551-558 (2004).
- Robinson, T. E., Kramis, R. C., Vanderwolf, C. H. Two types of cerebral activation during active sleep: relations to behavior. Brain Res. 124, 544-549 (1977).
